人寡肽转运体hPepT1及其在前药设计中的应用

基金项目:“十一五”重大新药创制专项资助项目(2009Z X 09304-003);浙江省钱江人才计划资助项目(2010R 10049)作者简介:孙冬黎,女,博士研究生 研究方向:寡肽转运体 ＊通讯作者:蒋惠娣,女,教授 研究方向:药物代谢 T e l :(0571)88208408 E -m a i l :h d j i a n g @z j u .e d u .c n ·综　述·人寡肽转运体h P e p T 1及其在前药设计中的应用孙冬黎,曾苏,蒋惠娣＊(浙江大学药学院药物分析与药物代谢研究室,杭州310058)摘要:目的　综述人寡肽转运体1(h P e p T 1)的结构特点、功能、在生物体内的分布和调控,及其底物的结构特征。

方法　通过对国内外近年来对寡肽转运体研究的调研,归纳总结h P e p T 1的研究现状。

结果　h P e p T 1除转运饮食中二肽/三肽外,在拟肽类药物的摄取中也起关键的作用,如对β-内酰胺类抗生素及血管紧张素转换酶抑制剂的吸收。

h P e p T 1主要在小肠表达,并受多种因素,如激素,表皮生长因子,饮食,疾病等调控。

以h P e p T 1为靶点,对药物进行结构修饰设计前药,以提高母体药物的口服生物利用度是非常有潜力的策略,目前已有许多成功的例子。

由于h P e p T 1的晶体结构尚没有完全阐明,研究者通过各种体内外模型的转运摄取实验,获得了很多关于h P e p T 1对底物结构要求的信息。

结论　通过文献调研,综述了h P e p T 1结构特点、功能、在生物体内的分布和调控,尤其是其底物的结构特征,强调其在前药设计中的应用。

关键词:人寡肽转运体;底物;前药;结构;调控中图分类号:R 96 文献标志码:A 文章编号:1001-2494(2011)03-0161-05 曾经认为饮食中的蛋白质需降解为氨基酸后才被肠道吸收,但是自20世纪60年代初研究发现,完整的肽也可被吸收,这一经典理论已被打破。

20世纪70年代,许多二/三-肽转运实验显示大量二肽物质可在人类肠道被吸收。

1994年,研究人员首先从兔小肠克隆得到寡肽转运体,命名为P e p T 1(o l i g o -p e p t i d e t r a n s p o r t e r 1)。

1996年,又有研究者从人小肠克隆得到了P e p T 1,即h P e p T 1(h u m a no l i g o -p e p t i d e t r a n s -p o r t e r 1)。

在研究饮食中肽类吸收的同时,有许多研究表明,β-内酰胺类抗生素、血管紧张素转换酶抑制剂等也可由载体介导的机制穿过肠道上皮细胞。

在寡肽转运体成功克隆之后,h P e p T 1被证实在药物经载体介导的吸收过程中起重要作用。

这一发现,使研究者对探索h P e p T 1在药物运输中的作用产生了很大兴趣,目前已经发现了大量经h P e p T 1转运的底物(药物)。

1　h P e p T 1的结构、功能及转运机制h P e p T 1是质子依赖性转运蛋白家族的成员之一。

通过对h P E P T 1的基因组分析显示,h P e p T 1由位于13号染色体上的一段含有24个外显子的基因编码。

这段基因的产物包括h P e p T 1(23个外显子)及其变体,以及调节因子h P e p T 1-R F (6个外显子)[1],h P e p T 1c D N A 含有3105个碱基对,其开放阅读框架翻译成708个氨基酸,组成12个跨膜区,相对分子质量约为79000。

目前尚没有h P e p T 1直接的结构信息,推测的蛋白结构在第9和10个跨膜区之间存在一个很大的细胞外环[2]。

定点突变研究显示,h P e p T 1蛋白中的组氨酸57,酪氨酸167为底物识别所必需,而组氨酸121,色氨酸294和谷氨酸595的突变显著降低寡肽的转运活性,精氨酸282突变为谷氨酸后,h P e p T 1与底物亲和力不变,但转变为非质子偶联的转运模式[3]。

h P e p T 1是一个H +/肽共转运体,它利用肠腔(p H 5.5～6.0)和细胞(p H 7.0～7.4)之间的质子梯度转运底物。

质子梯度的产生和维持主要依靠上皮细胞顶膜上的N a +/H +交换泵的活性。

但是从纯热力学考虑,N a +/H +交换泵产生的p H 梯度在有些情况下不能产生足够的动力,因此有人认为其中还涉及了碱转载器(如N a +/H C O 3-共转运体)。

进入细胞后,多数肽类(约90%)进一步水解成为氨基酸,然后通过基底侧的氨基酸转运体进入血液,未水解的底物(约10%)可能通过一种目前还不清楚的基底膜肽转运机制跨过上皮细胞的基底膜[3]。

在外源表达h P e p T 1的非洲爪蟾蜍卵母细胞上的吸收实验表明,中性底物甘氨酰-肌氨酸(G l y c y l s a r c o s i n e ,G l y -S a r )与h P e p T 1的亲和力随细胞外p H 从7.4至5.0出现先下降后增加的现象,p H 5.5时为最低点。

而阴离子底物头孢丁烯与h P e p T 1的亲和力则随着p H 下降(7.4～5.0)稳定增加[4]。

因此研究者认为,H +影响h P e p T 1的底物转运,不仅与H +结合位点结合,还与h P e p T 1的底物结合位点结合,在h P e p T 1底物结合位点的H +抑制中性和阳离子底物与结合位点的相互作用,但却是阴离子底物结合h P e p T 1所必需[4]。

2　h P e p T 1的分布D N A 分子信号扩大实验研究表明,P e p T 1m R N A 在大鼠和小鼠的小肠(十二指肠、空肠、回肠)高度表达,而且在大、小鼠的生殖器官(睾丸、子宫、卵巢),大鼠的肾脏中均可监测到,在小鼠的肾脏表达很低,大肠中基本没有分布。

目前已·161·中国药学杂志2011年2月第46卷第3期C h i nP h a r mJ ,2011F e b r u a r y ,V o l .46N o .3经从人、大鼠、小鼠、兔子、鲈鱼和人结肠癌细胞株C a c o -2中成功克隆了P e p T 1。

人胰腺癌细胞株A s P c -1,C a p a n -2和许多其他人肿瘤细胞株[5-7]中也都检测到了h P e p T 1m R N A 。

3　底　物h P e p T 1是人类饮食中蛋白质水解物经肠吸收的主要途径,而饮食中存在20种不同的氨基酸,即可能有数百个不同的二肽和数千个三肽。

但是,目前人体上皮细胞只有四种寡肽转运体被证实,而在小肠中以h P e p T 1为主,肽/组氨酸转运体1、寡肽转运体2在小肠不表达,肽/组氨酸转运体2在小肠表达较低,提示h P e p T 1具极宽泛的底物谱,可接受各种化学修饰的底物。

除了转运内源性的二、三肽类物质之外,h P e p T 1还转运许多拟肽类化合物,包括β-内酰胺类抗生素(如青霉素和头孢菌素)、血管紧张素转换酶抑制剂(如福森普利、贝纳普利、厄纳普利、西罗普利)、肾素抑制剂、凝血酶素抑制剂、氨基肽酶抑制剂苯丁抑制素。

此外,某些非肽类药物,如单氨氧化酶抑制剂4-氨基苯乙酸、阿昔洛韦的氨基酸酯前药(伐昔洛韦)和齐多夫定[8]、L -多巴的前药L -多巴-L -苯丙氨酸、抗低血压药米多君及其氨基酸衍生物[9]也是h P e p T 1的底物。

3.1　h P e p T 1的底物特征由于h P e p T 1的跨膜特性,其三维晶体结构尚未阐明,因此人们通过C a c o -2细胞,外源表达h P e p T 1的非洲蟾蜍卵母细胞、马丁达比犬肾上皮细胞(M D C K )和转基因酵母以及肠道灌流等实验模型的摄取/转运实验获得了很多关于h P e p T 1转运体对底物结构要求的信息。

有研究者利用这些信息,建立了测定亲和力/转运的实验模型,以用于药物的合理设计。

本实验将探讨h P e p T 1的底物特征。

3.1.1　对分子大小的要求　最初认为,只有二肽是h P e p T 1的底物。

后来,研究者以人空肠灌流模型的研究证明,只有二肽和三肽可直接经小肽转运体摄取,而四肽则需经过酶水解之后才能被摄取。

而后,又有人研究了4-,5-,6-甘氨酸组成的小肽在人空肠的吸收情况,结果同样显示4个以上氨基酸组成的肽没有被吸收。

上述研究结果得到许多研究者验证及认可。

目前认为,h P e p T 1仅识别二/三肽为底物,且其与二肽的亲和力比与三肽的高,而单个氨基酸或者4个以上的肽类均不是h P e p T 1的底物。

但是h P e p T 1对底物分子大小和相对分子质量并没有明确的上限,小至G l y -S a r ,大至柰丁美酮的硫代二肽前药都是h P e p T 1的底物。

但基于头孢菌素的构象分析,有研究者认为,N 末端氨基和C 末端羧基之间的最佳距离为5.0～6.3×10-10m [2]。

3.1.2　立体化学专属性　二/三肽的转运具有显著的立体化学选择性,自然界存在氨基酸主要是L -构型,由L -对映体以顺式构型组成的肽与转运体有最高的亲和力[2]。

有研究者以包含所有D -和L -构型的缬氨酸(v a l i n e ,v a l )三肽和二肽(H -v a l -v a l -v a l -O H ,H -V a l -V a l -O H )研究了h P e p T 1对底物的立体选择性,就二肽而言,L -L 异构体显示了最高的亲和力,其次是D -V a l -L -V a l ,L -V a l -D -V a l 和D -V a l -D -V a l ;就三肽而言,L -L -L 活性最高,而L -D -D 、D -L -D 、D -D -D 无亲和力[10]。

值得一提的是,有侧链修饰的D -构象的肽相比于母体化合物,其亲和力和转运能力显著增加。

h P e p T 1与顺式氨基酸的二肽有较高的亲和力,而与反式氨基酸的二肽亲和力较低。

非寡肽类底物,如头孢菌素类中的头孢氨苄也是左旋的亲和力高[11]。

3.1.3　末端基团　以往认为,C 末端和N 末端是自由基团时可被二/三肽转运体优先识别,但现在的观点认为,N -末端的自由氨基基团对h P e p T 1的亲和力非常重要,当氨基末端被甲基化、乙基化或被其他基团取代,都会减弱与转运体的亲和力。

N -甲基甘氨酰-丙氨酸(G l y -A l a )的抑制常数K i 值是G l y -A l a 的38倍[12],而对C -末端的自由羧基的修饰,如转变成氨基,亲和力减小程度比N 末端的修饰弱得多[13]。