GlyA基因的克隆及检测
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告基因克隆实验报告引言基因克隆是一项重要的生物技术，它可以通过复制和转移特定基因来研究基因功能、生物发育和疾病治疗等方面。
本实验旨在通过基因克隆技术，将一个目标基因从一个宿主生物转移到另一个宿主生物中，并观察其表达情况和功能。
材料与方法1. 实验材料：目标基因序列、质粒、限制酶、DNA连接酶、细菌宿主等。
2. 实验步骤：a. 提取目标基因序列：通过PCR技术，从源DNA中扩增目标基因序列。
b. 制备质粒：选择合适的质粒，将其线性化。
c. 酶切与连接：使用限制酶切割目标基因序列和质粒，然后使用DNA连接酶将两者连接。
d. 转化：将连接好的质粒转移到细菌宿主中。
e. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等方法，鉴定宿主细菌中是否成功克隆了目标基因。
结果与讨论在本实验中，我们成功地将目标基因从一个宿主生物转移到了另一个宿主生物中。
通过PCR技术，我们扩增得到了目标基因的特异片段，并在质粒上进行了酶切与连接。
随后，我们将连接好的质粒转移到了细菌宿主中，并进行了筛选与鉴定。
在筛选培养基中，我们观察到了对抗特定抗生素的细菌生长，这表明成功转化了质粒。
此外，通过PCR检测，我们也验证了目标基因的存在。
这些结果表明，我们成功地进行了基因克隆实验，并成功地将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆的成功不仅仅是一项实验技术，它还具有广泛的应用前景。
基因克隆技术可以用于生物学研究，例如研究基因功能、生物发育和疾病机制等。
此外，基因克隆还可以用于生产重组蛋白、制备基因工程药物等方面。
然而，基因克隆技术也存在一些挑战和争议。
首先，基因克隆需要复杂的实验操作和昂贵的设备，对实验者的技术要求较高。
其次，基因克隆可能引发伦理和道德问题，例如克隆人类等。
因此，在进行基因克隆实验时，必须遵守伦理规范和法律法规，确保实验的合法性和安全性。
结论通过本实验，我们成功地进行了基因克隆，并将目标基因转移到了新的宿主生物中。
基因克隆技术在生物学研究和应用中具有重要意义，但也面临一些挑战和争议。
项目五-L-丝氨酸的酶法合成及分析
姓名：候雅媛 班级：生药1311 学号：2013040808 组别：第4组
L-丝氨酸简介
L-丝氨酸的应用
仪器及试剂
试剂 甘氨酸、甲醛溶液、PLP、四氢叶酸 仪器 三角瓶、摇床
操作步骤
1、将菌种接入LB液体培养基，37℃摇床培养24小时。 2、 将培养物超声波破碎后离心取上清液。 3、 取已破碎的菌悬液，加等体积20mmoL/L PLP溶液。 4、 37℃摇床振荡温浴，然后向反应容器中，加100mL酶反应液。
操作流程
4.1、100mL酶反应液（含10mmoL/L甘氨 酸、13.3mmoL/L甲醛、0.4mmoL/L PLP、 5mmoL/L四氢叶酸、0.2mmoL/LS-硫基乙 醇、0.1mmoL/L磷酸盐溶液（pH8.0） 5、37℃空气浴摇床震荡反应30min,调 pH7.5。 6、加甲醛使其浓度达10mmoL/L，pH降 至7.22。 7、当上升至7.42后，加甲醛至7.22，反 复添加甲醛至反应液pH不随时间变化。 反应结束后，500r/min，离心10min上清 液待分析
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L-丝氨酸的提取纯化
研究酶促反应液中L-丝氨酸的分离和反应液中甲醛、丝氨酸浓度的测定
方法:采用732树脂、717树脂离子交换柱层析从酶促反应液中分离甘氨酸、 L-丝氨酸;
采用铬变酸比色法测定甲醛和丝氨酸浓度.结果:两种树脂柱层析均可不 同程度地分离两种氨基酸,但717树脂柱的分离效果更好,丝氨酸的收率可 达77%. 结论:利用717树脂柱层析可从SHMT酶促反应液中成功地分离L-丝氨酸;铬 变酸比色法可用于测定酶反应液中甲醛浓度.
L-丝氨酸的分析
பைடு நூலகம்训器材
实训试剂
1、展层剂 正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5充分摇 匀，用分液漏斗取上层液体做展开剂。 2、样品 L-丝氨酸标准样品、酶法合成的丝氨酸 样品 3、显色剂 0.5%茚三铜溶液
克隆化培养和抗体检测的原理 -回复
克隆化培养与抗体检测：实验技术原理克隆化培养和抗体检测是两种常用的实验技术，具有不同的原理和应用领域。
1、克隆化培养的原理：
克隆化培养是指从单个细胞或细胞群体中分离并培养出单个细
胞系或细胞株。
其原理基于细胞的能够通过无性繁殖产生与原始细胞相同或高度相似的后代细胞。
在克隆化培养过程中，细胞被分离并单独培养，通过提供适当的培养基和条件，细胞将进行增殖并形成单个细胞克隆或细胞株。
这种技术广泛应用于细胞生物学、生物医学研究和生物工程等领域，可用于研究细胞的特性、功能和响应，以及生产具有特定功能的细胞或蛋白质。
2、抗体检测的原理：
抗体检测是一种常用的生物分析技术，用于检测目标分子（如抗原或其他生物分子）在样品中的存在与数量。
其原理基于抗体与抗原之间的高度特异性结合。
抗体是由免疫系统产生的蛋白质，能够识别和结合到其特定的抗原。
在抗体检测中，首先通过免疫方法制备特异性的抗体，然后将其与待检样品中的目标分子发生结合反应。
随后，通过不同的检测方法（如免疫荧光、酶联免疫吸附实验等）来检测抗体-抗原结合的信号或标记物，从而确定目标分子的存在与数量。
抗体检测广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物工程等领域，可用于检测病原体、蛋白质、细胞表面分子等多种生物分子。
我国急性白血病免疫分型的四色方案
我国急性⽩⾎病免疫分型的四⾊⽅案中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫表型已成为诊断急性⽩⾎病的重要依据之⼀。
因准确的诊断需要选择⼀定数量的抗体，涉及多个造⾎系列的抗原。
但⽬前国内甚⾄国际上没有规范化的⽅案可以借鉴。
⽽国内不同的医疗单位所⽤的抗体数量和种类均有较⼤的异质性，有些单位由于应⽤的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会⾎液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次的讨论，提出以CD45/SSC为基础的中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案，供参考。
本⽅案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整及急性⽩⾎病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。
1．适应范围：1.1急性淋巴细胞⽩⾎病(ALL):z B系：早B前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体B-ALL(Pre-B),及与Burkitt淋巴瘤进⾏鉴别z T系：早T前体-ALL (Pro-T), 前体T-ALL(Pre-T),⽪质-T-ALL和髓质-T-ALL.1.2急性早幼粒细胞⽩⾎病（APL）1.3急性髓细胞⽩⾎病（AML）z AML微分化型（AML-M0）z AML伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2和AML-M4/5）z急性红⽩⾎病（AML-M6）z急性巨核细胞⽩⾎病（AML-M7）1.4前体树突细胞肿瘤1.5急性嗜碱性粒细胞和肥⼤细胞⽩⾎病1.6 混合表型⽩⾎病1.7 对上诉急性⽩⾎病治疗后检测MRD的标志进⾏筛查2.抗体的选择：根据检测的⽬的，需要检测不同的抗体：2.1 鉴别急性、慢性⽩⾎病:对于急性髓细胞⽩⾎病，可以根据CD45/SSC图型进⾏初步判断。
髓系⽩⾎病细胞CD45的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下⽅，且多数⽩⾎病细胞SSC较低（除去⼤颗粒APL 患者）。
丝氨酸
酶法合成原理
L-丝氨酸是一个重要的药用氨基酸. 利用丝氨酸羟甲基转移酶催化甲醛 和甘氨酸,可逆地合成L-丝氨酸(图8) ,反应过程中丝氨酸羟甲基转移酶 需要PLP和四氢叶酸作为辅助因子. 最终反应液中L-丝氨酸浓度达到0. 2 mol/ L ,该法是目前最有应用前景的L-丝氨酸生产方法。
在动 、植 物体内和微生物细胞内，普遍存在着甘 氨酸和丝氨酸的互相转换。该反应的生理方向是L 一丝氨酸断裂成为甘氨酸和N5, N,o亚甲基四氢叶 酸，其中辅酶四氢叶酸作为C.基团的载体。生物 体内包含甲基基团的化合物、PI吟环等的生物合 成均利用该步反应提供的C、基团。催化该步反应 的酶是丝氨酸经甲基转移酶(serine
酶反应体系建立时，甲醛多次少量加入，防止酶 失活。
超声波细胞破碎时注意间歇时间，以工作2s间歇 3s为宜。
参考文献
陈永波,饶斌,覃兰;高效液相色谱法快速直接测定酪氨酸、苯丙氨酸和 色氨酸[J];氨基酸和生物资源;2000年01期
胡兵,龙化云,黄光斗;丙酮酸的合成研究进展[J];化工时刊;2003年09期
李省云,杨毅萍;L-丝氨酸与四氯对苯醌的荷移反应[J];光谱实验室;2004 年06期
丝氨酸羟甲基转移酶基因的功能表达及其活性鉴定 - 食品与发酵工业 2002, 28(1)
期刊论文 丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆 - 广西农业生物科学 - 2003, 22(2)
期刊论文 两种菌株来源的glyA基因的克隆、表达及酶活性检测 - 氨基 酸和生物资源 - 2006, 28(1)
超声波细胞破碎仪工作原理
就是将电能通过换能器转换为声能，这种能量通 过液体介质(如水)而形成一个个密集的小气泡，这 些小气泡迅速炸裂，产生像炸弹一样的能量，从 而起到破碎细胞等物质的作用，俗称空话效应， 超声波细胞破碎仪具有破碎组织、细菌、病毒、 孢子及其他细胞结构，以及乳化、混合、脱气、 崩解、分散、清洗和提取等作用。
yac构建基因文库的原理
yac构建基因文库的原理基因文库是DNA片段的集合，其中每个片段都包含来自基因组的某个部分。
这些片段可以来自不同的染色体区域，并且可能包含整个基因或其部分。
YAC（酵母人工染色体）是一种用于构建基因文库的载体，它允许研究人员在酵母细胞中克隆和表达大片段的基因组DNA。
下面将详细介绍YAC构建基因文库的原理，主要包含以下几个方面：1. 构建构建YAC载体的第一步是制备适合克隆大片段DNA的载体。
通常，YAC载体包含一个选择标记（如抗性基因），允许在含有特定抗生素的培养基上筛选和识别含有YAC的克隆。
此外，YAC载体还应包含一个多克隆位点，用于插入感兴趣的基因组DNA片段。
2. 转化一旦制备了YAC载体，就可以将其转化到酵母细胞中。
转化过程通常涉及将酵母细胞与YAC载体共孵育，以使载体与酵母细胞的DNA结合。
然后，通过加入选择标记来筛选和识别成功转化的细胞。
3. 克隆化在成功转化后，研究人员需要筛选和识别含有重组YAC载体的细胞克隆。
通常，这可以通过多轮筛选和鉴定来完成。
首先，研究人员可以使用特定抗生素来筛选含有选择标记的细胞。
然后，他们可以使用 Southern 印迹分析或 PCR 等技术来鉴定含有重组YAC载体的克隆。
4. 筛选筛选是YAC构建基因文库的关键步骤之一。
通过筛选，研究人员可以识别包含所需基因组区域的有效克隆。
这通常涉及对重组YAC进行分子遗传分析，以确定其包含的基因组区域。
通过比较筛选结果和基因组图谱，研究人员可以选择正确的克隆用于进一步研究。
5. 鉴定一旦筛选出正确的克隆，研究人员需要对其进行进一步鉴定。
这可以通过一系列技术来完成，包括 Southern 印迹分析、PCR、测序和功能分析等。
通过这些技术，研究人员可以确定重组YAC中的基因组区域是否包含所需的目标基因或DNA片段。
此外，他们还可以验证克隆的可靠性和稳定性，以确保其可以用于进一步实验和研究。
总之，YAC构建基因文库是一个复杂的过程，涉及多个步骤和关键环节。
基因克隆实验报告
基因克隆实验报告摘要：本实验旨在通过基因克隆技术，将特定基因从一个细胞中复制并插入到另一个细胞中，以实现基因的传递和表达。
实验采用了大肠杆菌作为模型生物，利用质粒载体和限制酶切技术完成了基因的克隆和转移。
通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中，验证了基因克隆技术的有效性。
一、实验材料和方法1. 实验材料：- 大肠杆菌菌种- 目标基因DNA样本- 质粒载体- 限制酶- DNA连接酶- 抗生素培养基2. 实验步骤：步骤一：菌液制备1. 取一支滤漏筒，加入适量的LB培养基，用移液管取一小部分大肠杆菌菌种，接种于LB培养基中，静置在37℃恒温摇床中培养过夜。
步骤二：DNA提取1. 取LB培养基中的大肠杆菌菌液，用离心机进行离心分离，将上清液去除，留取沉淀。
步骤三：DNA酶切1. 取目标基因DNA样本和质粒载体，分别加入限制酶，按照限制酶切反应的条件进行反应。
步骤四：DNA连接1. 取等体积的酶切后的目标基因DNA和质粒载体，加入DNA连接酶，按照连接酶反应条件进行反应。
步骤五：转化1. 将连接后的DNA溶液加入已经制备好的培养基中，用恒温摇床静置培养。
步骤六：筛选1. 取一块含有抗生素的琼脂平板，将转化后的菌液均匀涂布在平板上，放入恒温箱培养。
步骤七：分离1. 从琼脂平板上挑选抗生素抵抗的单个菌落，进行培养。
二、实验结果与分析通过本实验的操作，成功地将目标基因从一个细胞复制并转移到另一个细胞中。
在转化后的琼脂平板上，观察到一些菌落的形成，这些菌落对抗生素具有抗性。
说明转化后的细胞成功地表达了目标基因，并能产生相应的蛋白质。
三、讨论与总结基因克隆技术是现代生物学研究中常用的实验手段之一。
通过限制酶切和DNA连接，可以实现基因的克隆和转移。
本实验结果表明，大肠杆菌是一个有效的模型生物，可用于基因克隆实验。
通过对转化菌落的筛选和培养，可以得到具有抗生素抵抗能力的菌落，进一步验证了实验结果的有效性。
基因克隆实验流程
基因克隆实验流程基因克隆技术，又称重组 DNA 技术，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA 进行体外重组，获得新的重组DNA后导入受体细胞中表达相应蛋白，以研究蛋白结构与功能及其与其他分子的相互作用。
一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。
获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。
该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。
原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。
2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。
此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。
因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。
3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。
在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。
4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。
用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。
用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。
二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。
为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。
含融合自杀基因CDglyTK复制型重组腺病毒的构建与鉴定
细胞 Ａ ４ ， ５ ９ 从荧光蛋 白表达 、 细胞病变及病毒增殖 等方 面进行 比较 ， 以确定其复制能力及溶瘤特性 。结果 ： 成功构建
ｖ ｒ ｙｉ ｅ ｌ ａ ｖ ｂｌ ｙａ ｄ ｏ ｃ ｌｔ ｂｌｙｉ ｌ ｔｍｏ ｅｌ ４ ． ｔ ｏ ｓ Ｅｓ ｌ ｈｏ ｅｌｐ— ｘｅ ｓ ｎ Ｐ Ｒ．ｎ ｅｉ ｓｒｐｉ ｔ ｅａ ｉｔ ｎ ｎ ｏｙｉ ａ ｉｔ ｎｔｅ ｕ ｒｃ ｌＡ５ ９ Ｍｅ ｈ ｄ ： ｔ ｉ ｖ ｒａ ｅｔｎ ｉ Ｃ ａ ｄ ｆ ｔ ｃｉ ｉ ｃ ｉ Ｉ ｂ ａ ｓ ｏ
的复制能 力、 溶瘤特性 和外源基 因的表达明显优于 目前广泛应用 的复制缺陷型重组腺病毒 。
关键 词 基 因， 病毒 基 因疗法 腺病毒科 基 因， 转基 因 ， 自杀 基因表 达
Ｃｏ ｓｒ ｃｉｎａ ｄ Ｉｅ ｔ ｉａｉ ｎｏ ｐｉａｉｅ Ｒ ｃ ｍ ｂｎ ｎ ｅ ｏ ｉ ｓ ｎ ｔｕ ｔ ｎ ｎ ｉ ｔ ｆ ｏ ｄ ｆ ｃ ｏ Ｒｅ ｌ ｔ ｅ ｏ ｃ ｖ ｉａ ｔ Ａｄ ｎ ｖｒ ｕ
了含融合 自杀基 因 Ｃ ｇｙ Ｋ的复制型重组腺病毒 ｒｄ １ — Ｄ ｌ Ｋ， 病毒感 染肿瘤细胞 Ａ ４ 后 报告基因绿色荧 Ｄ ｌＴ Ａ ＥＡ Ｃ ｇＴ 该 ｙ ５９ 光蛋白（ Ｆ ） Ｇ Ｐ 的表达 ， 能大量增殖并 出现 明显 的细胞病变效应（ Ｐ 。 Ｃ Ｅ） 结论 ： 构建的复制型重组腺病毒在肿瘤细胞 内
ｃ ｎ ｔｕ ｔ ｅ ｌ ａｉｅ ｒ ｃ ｍ ｉ ａ ｔ ｄ ｎ ｖｒ ｓ ｏ ｔｉ ｉ ｇｆ ｓｏ ｕ ｃ ｄ ｅ ｅ Ｃ ｌＴ ｂ Ａ— Ｒ ａ ｍｅ ｔ ｒ ｍ ｖ ｒ ｐ — ｏ ｓ ｃ ｐ ｉ ｔ ｅ ｏ ｒ ｒ ｃ ｖ ｂ ｎ ｅ ｏ ｉ ｎ ｎ ｎ ｉｎ ｓ ｉ ｉ ｅｇ ｎ Ｄｇｙ Ｋ ｙ Ｅ１ — ＥＳ ｆ ｇ ｎ ｏ ｏ ｅ ａ — ｎ ａ ｕ ｃ ａ ｕ Ｉ ｒ ｆ ｌ ｅ ｔ ｎ ｉｎ Ｐ Ｒ ｎ ｈ ｄ ｆ ｄ Ａｄ ｓ ｙ ｔ ｍ ｆ ｃ ｍｐ ｔｎ ｅｌ ｐ ｅ ａ ｅ ｓｎ ａｃ ｕ ｃ ｌ ｒ ｅ ａ ｄ ｈ ｍｏ ｏ ｏ ｓ ｘ ｅ ｓｏ Ｃ ａ ｄ ｔ ｅ ｍｏ ｉ ｅ Ｅａ ｙ ｓ ｓｅ ｏ ｏ ｅｅ ｔ ｃ ｌ ｒ ｐ ｒ ｄ ｕ ｉｇ ｃ ｌｉ ｍ ｈ ｏ ｄ ｎ ｏ ｌ ｇ ｕ ｉ ｉ ｒ ｃ ｍ ｉ ａ ｉｎ ｉ ａ ｔｒａ Ｕｓｎ ｈ ｅ ｌ ａｉ ｅ ｒ ｃ ｍ ｉ ａ ｔａ ｅ ｏ ｉｕ Ａｄ Ａ— ｇ ｙ ｎ ｅ ｒ ｐ ｉａ ｉｎ ｄ ｆ ｃ ｖ ｅｏ ｂ ｎ ｔ ｎ ｂ ｃｅ ． ｉ ｇｔ ｅ ｒ ｐ ｉ ｔ ｅ ｏ ｏ ｉ ｃ ｖ ｂ ｎ ｄ ｎ ｖ ｒ ｓ ｒ Ｅ１ ＣＤ ｌＴＫ ａ ｄ ｔ ｅ ｌ ｔ ｅ ｅ ｔ ｅ ｎ ｈ ｃ ｏ ｉ ａ ｅ ｏ ｉ ｓｒ — Ｄｇｙ Ｋ ｅ ｔ ｅ ｔ ｍｏ ｅ ４ ｅ ｐ ｃｉ ｅｙ Ｃｏ ￣ｅ ｔ ｉ ｄ ｆａ ｅ ｏ ｉｕ ｏ ｔ ｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｆ ｄ ｎ ｖ ｒ Ａｄ Ｃ ｌＴ ｉ ｃ ｕ ｆ ｎ ｈ ｔ ｕ ｒｃ ｌ Ａ５ ９ ｒ ｓ ｅ ｔ ｌ ． ｍｐ ｖ ｗｏ ｋ ｎ ｓｏ ｄ ｎ ｖ ｒ ｓｆ ｍ ｘ ｒ ｓ ｉ ｎ ｏ ｒ ｈ
植物SHMT基因家族研究进展
引用格式：倪弦之，柏浩东，韩进财，等. 植物SHMT 基因家族研究进展[J]. 湖南农业科学，2021（1）：102-106. DOI:10.16498/ki.hnnykx.2021.001.025丝氨酸羟甲基转移酶（Serine hydroxymethyltransferase ，SHMT）是高等植物的一碳化合物代谢和光呼吸过程的关键酶，属于磷酸毗哆醛依赖酶。
该酶可以催化甘氨酸和N 5，N 10-亚甲基四氢叶酸生成丝氨酸和四氢叶酸（THF ），且该过程可逆[1]，反应式如下。
SHMT 广泛存在于原核生物和真核生物中，其在原核生物中是由单基因编码并以二聚体形式存在；而在动物和真菌中，SHMT 则是由不同的核基因编码的具有2种异构型的四聚体[2]。
近年来由于SHMT 可用于体外催化生产丝氨酸而备受关注，同时该物质对植物多种生理功能具有调节作用，因此关于植物SHMT 的相关研究越来越多，也越来越深入。
笔者主要对不同植物体内SHMT 的多种构型、克隆、逆境表达及其在植物保护上的应用研究进展进行综述，以期为植物SHMT 基因家族的功能及其相关应用研究提供参考。
1 植物SHMT 基因家族SHMT 基因在植物界是非常广泛且重要的存在。
植物界SHMT 基因家族同时也是一个神秘而庞大的家族。
目前的研究显示，在拟南芥中，已经鉴定出7个SHMT 基因[3]；在水稻中，OsSHMT 家族有5个成员[4]；在大豆中，GmSHMT 大豆基因组包含大量的SHMT 基因，约有18个成员[5]。
植物的光合作用分为光反应和暗反应2个过程。
光反应发生在叶绿体类囊体膜上，光合色素吸收光能后进行电子传递，形成光合作用所需的能量和还原力（A TP 和NADPH ）；而暗反应在叶绿体基质中进行，是光合作用碳同化过程[1]。
已有研究表明，植物体中存在3种形式的SHMT ，即细胞质cSHMT 、线粒体mSHMT 和叶绿体亚型SHMT [5-6]。
《2024年‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》范文
《‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》篇一范文字体：西伯利亚百合LiCMK基因克隆及功能分析一、引言西伯利亚百合（Lilium sibiricum）是一种具有重要观赏价值的植物，其生长环境及植物本身的遗传特征使它在花卉种植及生物医药研究中具有重要的地位。
其中，对特定基因的研究成为了解析西伯利亚百合各种特性的关键步骤。
本研究中，我们将深入讨论西伯利亚百合的LiCMK基因的克隆及功能分析。
二、材料与方法（一）材料本实验使用的西伯利亚百合由我实验室自主种植，并在适当的生长条件下进行取样。
（二）方法1. 基因克隆：通过PCR技术，从西伯利亚百合的基因组DNA中扩增出LiCMK基因。
2. 序列分析：利用生物信息学软件对LiCMK基因的序列进行分析，包括开放阅读框（ORF）预测、蛋白结构预测等。
3. 功能分析：通过构建过表达和敲除的转基因植物，分析LiCMK基因在植物生长发育过程中的功能。
三、LiCMK基因克隆及序列分析（一）基因克隆我们成功地从西伯利亚百合中克隆出了LiCMK基因，其PCR产物经测序验证与预期序列一致。
（二）序列分析通过生物信息学软件分析，我们发现LiCMK基因具有完整的开放阅读框，编码的蛋白质具有典型的结构域和功能域。
此外，我们还预测了该蛋白的三维结构，为后续的功能研究提供了基础。
四、LiCMK基因的功能分析（一）转基因植物的构建与筛选我们构建了LiCMK基因的过表达和敲除的转基因植物，并通过PCR和RT-PCR等方法对转基因植物进行了筛选和验证。
（二）功能分析通过对转基因植物的生长、发育和生理特性的观察和测定，我们发现LiCMK基因在植物的生长过程中起到了重要作用。
过表达LiCMK基因的植物表现出更强的生长势和抗逆性，而敲除LiCMK基因的植物则表现出生长缓慢和抗逆性减弱的现象。
这表明LiCMK基因在西伯利亚百合的生长发育及抗逆过程中发挥了重要的调控作用。
五、讨论与结论本实验成功克隆了西伯利亚百合的LiCMK基因，并对其进行了序列分析和功能分析。
基因克隆实验实验报告
一、实验目的本实验旨在学习基因克隆的基本原理和操作步骤，掌握DNA提取、限制性核酸内切酶酶切、连接、转化、筛选等基因克隆技术，并对实验结果进行分析。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因片段插入到载体中，使其在宿主细胞中复制、表达的过程。
本实验采用以下原理：1. DNA提取：利用细胞裂解、蛋白酶K处理、酚/氯仿抽提等方法提取目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：利用限制性核酸内切酶识别特定的核苷酸序列，并在这些序列上切割DNA分子，产生具有黏性末端或平末端的DNA片段。
3. 连接：利用DNA连接酶将目的基因片段与载体连接，形成重组DNA分子。
4. 转化：将重组DNA分子导入宿主细胞，使其在细胞内复制、表达。
5. 筛选：通过分子生物学方法筛选出含有目的基因的细胞株。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、目的基因片段、限制性核酸内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、PCR引物、酚/氯仿、无水乙醇、氯仿等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、紫外分光光度计、DNA纯化仪、PCR仪、电热恒温培养箱等。
四、实验步骤1. DNA提取：取一定量的大肠杆菌DH5α菌液，加入细胞裂解液，充分振荡，加入蛋白酶K，37℃水浴30min，加入酚/氯仿抽提，离心，取上清液，加入无水乙醇沉淀，离心，洗涤，溶解，得到目的基因片段。
2. 限制性核酸内切酶酶切：将目的基因片段和载体pUC19分别进行限制性核酸内切酶酶切，酶切产物经电泳鉴定后，切胶回收酶切产物。
3. 连接：将切胶回收的目的基因片段和载体pUC19在连接酶的作用下连接，连接产物经电泳鉴定后，取适量连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4. 转化：将连接产物加入大肠杆菌DH5α菌液中，在冰浴中振荡，加入CaCl2，热冲击，涂布于含有抗生素的琼脂平板上，37℃培养过夜。
5. 筛选：挑选单菌落，进行PCR扩增，鉴定阳性克隆。
glo1蛋白表达基因
glo1蛋白表达基因
GLO1是指甘氨酸酮醇酶1基因 (Glyoxalase 1)，它在人体内编码甘氨酸酮醇酶1蛋白。
甘氨酸酮醇酶1是一种重要的代谢酶，参与甲醛和乙醛代谢途径中的底物清除过程。
如果您想表达GLO1基因，可以采取以下步骤：
1. 克隆：首先需要通过PCR或其他方法从人体组织中获取GLO1基因的DNA序列，并将其克隆到适当的表达载体中。
载体可以是质粒、病毒载体或其他合适的表达系统。
2. 转染：将所构建的表达载体转染入目标细胞（例如细胞系或转基因动物）中。
可以使用合适的转染试剂或技术来实现转染。
3. 表达：在转染后，目标细胞会开始表达GLO1蛋白。
为了促进蛋白表达，可以选择合适的培养基和培养条件，并根据需要添加适当的诱导剂或调节剂。
4. 验证：通过Western blotting、免疫荧光染色或其他蛋白质分析技术来验证目标细胞中GLO1蛋白的表达情况。
需要注意的是，以上步骤仅为基本示意，并且具体的操作细节可能因实验条件和所选表达系统而有所不同。
在进行蛋白表达实验之前，请确保遵循相关的实验安全规范和伦理要求。
基因克隆具体实验报告
基因克隆具体实验报告基因克隆是指将一个物种的基因从其源生物体中提取出来，并插入到另一个宿主生物体中的过程。
基因克隆可以用于基础研究、医学诊断和治疗、农业改良等领域。
以下是一个基因克隆具体实验的报告。
实验目的：本实验旨在将一段目标DNA序列从一个细菌中克隆到另一个细菌中，以验证克隆技术的可行性。
实验材料：- 源生菌株：提供目标DNA序列的细菌- 宿主菌株：用于接受目标DNA序列并进行复制的细菌- 高浓度DNA提取试剂盒：用于提取源生菌株中的基因组DNA- 质粒：使用质粒介导转化的方式将目标DNA序列插入到质粒中- 缓冲液：用于稀释DNA、提供合适的反应环境- 培养基：提供细菌生长所需的养分- 抗生素：用于选择具有目标DNA序列的细菌实验步骤：1. 提取源生菌株中的基因组DNA：a. 从培养基中取一些源生菌落，转移到离心管中。
b. 加入适量的高浓度DNA提取试剂盒，根据试剂盒说明书进行细胞破裂和DNA纯化的步骤。
c. 将提取的DNA用缓冲液稀释，并进行质量检查。
2. 克隆目标DNA序列到质粒中：a. 将提取的DNA和质粒按照一定比例混合。
b. 加入适量的酶切酶，根据目标DNA序列的酶切位点选择适当的酶切方法。
c. 在恒温水浴中进行酶切反应，使目标DNA序列与质粒酶切后的末端互补连接。
d. 加入适量的合成DNA ligase，进行连接反应，形成目标DNA序列与质粒的连接产物。
3. 将质粒插入宿主细菌：a. 将宿主细菌制备成化学计量的细菌悬液。
b. 加入目标DNA序列与质粒连接产物到宿主细菌悬液中。
c. 进行质粒介导转化，使目标DNA序列与质粒插入到宿主细菌中。
4. 筛选具有目标DNA序列的细菌：a. 将转化后的宿主细菌悬液分别均匀涂布在含有适量抗生素的培养基平板上。
b. 在适当的培养条件下，培养细菌培养基平板，并观察是否有菌落生长。
c. 通过PCR、酶切等方法对菌落进行初步筛选。
d. 对初步筛选出的菌落进行进一步的测序和验证。
分子克隆(亚克隆)实验总体流程详解
一、扩增1、LB培养基5ml；2、抗生素：1000X，即1:1000比例。
种类根据细菌抗性决定；3、菌体：看浑浊度，1%-5%，取500ul于其中；4、37℃摇床220转，过夜，12-16h。
二、纯化质粒DNA1、1.5ml离心管，编号一定要写清楚；2、加满离心管，离心12000xg. 1min，弃上清。
取三次；3、加Buffer S1 200ul，溶解沉淀，5min；4、加S2（用完立刻盖紧瓶盖，以免CO2中和Buffer中的NaOH）200ul，不能剧烈（以免基因组DNA的污染），上下翻转4-6次，直至形成透亮的溶液，时间少于5min。
目的是使蛋白包裹基因组DNA，游离质粒；5、加S3 280ul，温和充分翻转混合6-8次，12000xg，10min(此步呈白色絮状)；*备注：S1：S2：S3=5:5:76、取上清加入制备管（置于2ml离心管），12000xg，1min，去滤液；7、加Buffer W1 500ul，12000xg，1min，弃滤液；8、加Buffer W2 700ul，12000xg，1min，弃滤液。
重复一遍；9、空管离心12000xg，1min；10、制备管移入新的1.5ml离心管，管膜中加60-80ul去离子水，静置1min，12000xg，1min。
（将去离子水加热至65度，将提高洗脱效率）四、跑胶回收：sost回收失败1、2%浓度胶，Loading Buffer如是6X，则加10ul到样品，全部加样到胶孔中。
插入：配胶方法大块胶60ml；小块胶25ml；需要配置大块胶、大孔胶；Agarose 0.6g，TAE60ml，微波中火2min；趁热但不烫手时加入gold view 0.5ul/25ml；倒入槽里。
2、跑胶：单位厘米/5-10v。
所以大槽25cm，150v即可。
小槽100v即可。
3、紫外灯下切胶，纸巾吸进液体，计算凝胶重量（1mg=1ul）；4、加3个凝胶体积的凝胶结合液DB（0.1ul视为100ul；如凝胶浓度大于2%，则加入6倍体积溶胶液；凝胶块最大不能超过400ul，超过可多个离心柱）；5、56℃水浴放置10分钟，至完全溶解；6、每100mg最初的凝胶重量加入150ul的异丙醇，震荡混匀，回收大于4Kb的片段可不加异丙醇，加入反而降低回收效率；7、将上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），12000rpm，30-60s，弃液体；8、加700ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；9、加500ul漂洗液WB，12000rpm，1min，弃废液；10、空离心2min，弃废液；11、晾干乙醇，以免抑制下游反应；12、将吸附柱放入新的1.5ml离心管，加入50ul（最少30ul）洗脱缓冲液EB或者去离子水（65-70水浴加热效果更好，或将得到的溶液重新加入离心柱可增加洗脱量）；五、连接体系：六、转化1、加感受肽：连接产物=10:1，冰浴30min；2、激活：42℃，90s，不能震动；3、加500ul LB培养基；4、37℃，150转摇床，45min；5、铺板子七、检测1、细菌长势良好，对照组不长；2、酶切检测：（1）1ml LB体系：1ml LB培养基+1ul抗生素于1.5mlEP管中；（2）15ul Pcr体系：7.5ul Mix（2X）5.5ul water1ul上游引物1ul下游引物（3）用枪头挑培养皿中的菌体，吹打于1ml LB体系中，再吹打于15ul Pcr体系中；（4）1ml LB体系放入37℃摇床，150rpm；显示4°/4°时，结束。
crpa的mlst分型步骤流程
crpa的mlst分型步骤流程CRPA（C. jejuni-Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis）是一种常用的分子流行病学分型方法，用于研究食源性病原菌的遗传多样性和流行病学关系。
MLST（Multi-Locus Sequence Typing）是CRPA的一种常用分型方法，通过对多个位点的DNA序列进行分析，可以准确地确定菌株的分型。
CRPA的MLST分型步骤如下：1. 选择目标位点：首先，需要选择一组与菌株遗传多样性相关的目标位点。
常用的目标位点包括gltA、glyA、pgm、aroA、tkt、gnd等。
2. 提取基因组DNA：从研究对象中提取基因组DNA，可以使用常规的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
3. PCR扩增目标位点：使用适当的引物对目标位点进行PCR扩增。
PCR反应体系通常包括模板DNA、引物对、dNTPs、Taq DNA聚合酶和缓冲液。
PCR条件根据不同的引物和目标位点而有所不同，通常包括一定的变性、退火和延伸步骤。
4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，可以通过检测PCR产物的大小来确定扩增是否成功。
可以使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶进行分析，根据扩增产物的大小选择合适的凝胶浓度和电泳条件。
5. 酶切消化：将PCR扩增产物进行酶切消化，选择适当的酶切酶和缓冲液进行消化。
酶切消化的目的是将PCR产物切割成不同的片段，以便进行进一步的分析。
6. 凝胶电泳分析：将酶切产物进行凝胶电泳分析，可以通过检测切割产物的大小来确定酶切是否成功。
根据切割产物的大小选择合适的凝胶浓度和电泳条件。
7. 比对序列：将酶切产物的序列进行比对，可以使用序列比对软件进行分析。
常用的序列比对软件包括BLAST、ClustalW等。
比对序列的目的是确定目标位点的序列差异，从而确定菌株的分型。
8. 分型结果分析：根据比对序列的结果，可以确定每个位点的分型，通常将每个位点的分型组合成一个多位点序列类型（ST）。
《2024年‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》范文
《‘西伯利亚’百合LiCMK基因克隆及功能分析》篇一范文：西伯利亚百合LiCMK基因克隆及功能分析一、引言西伯利亚百合（Lilium sichotense）是一种极具观赏价值的植物，因其美丽的花朵和独特的基因特性，已成为园艺学和生物学研究的重要对象。
近年来，随着分子生物学技术的发展，西伯利亚百合的基因克隆和功能分析逐渐成为研究的热点。
本文以西伯利亚百合的LiCMK基因为研究对象，对其基因克隆及功能进行深入分析。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的西伯利亚百合材料采自我国北方某地，经过鉴定为纯种西伯利亚百合。
实验所需试剂和仪器均符合分子生物学实验要求。
2. 方法（1）基因克隆首先，通过PCR技术扩增出LiCMK基因的cDNA序列。
然后，将PCR产物进行纯化、连接至载体、转化至感受态细胞等步骤，最终获得含有LiCMK基因的重组质粒。
（2）功能分析通过生物信息学方法对LiCMK基因进行序列分析，预测其编码的蛋白质的功能。
同时，利用转基因技术将LiCMK基因导入模式植物中，观察其对植物生长、发育及抗逆性等方面的影响。
三、实验结果1. 基因克隆结果通过PCR扩增，成功获得了LiCMK基因的cDNA序列。
经过纯化、连接、转化等步骤，成功构建了含有LiCMK基因的重组质粒。
经测序验证，LiCMK基因序列正确无误。
2. 功能分析结果（1）生物信息学分析通过生物信息学分析，发现LiCMK基因编码的蛋白质属于蛋白激酶家族成员。
通过预测其结构域和功能域，推测其可能参与细胞信号传导、植物生长和发育等过程。
（2）转基因实验结果将LiCMK基因导入模式植物中，观察其对植物生长、发育及抗逆性等方面的影响。
实验结果表明，过表达LiCMK基因的植物在生长速度、株高、花色等方面表现出明显优势。
此外，过表达LiCMK基因的植物在抗逆性方面也有所提高，表现出更强的抗病、抗虫和抗旱能力。
四、讨论本实验成功克隆了西伯利亚百合的LiCMK基因，并通过生物信息学分析和转基因实验对其功能进行了初步探讨。
发酵乳食品乙醛等的形成与调控
发酵乳食品乙醛等的形成与调控本文作者：丹彤包秋华孟和毕力格王俊国张和平作者单位：内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室乳酸细菌广泛分布于自然界中，是一类利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌通称。
传统发酵乳食品中分离的乳酸菌一般被认为是安全的细菌，早在人们认识乳酸菌之前，就已将其广泛应用于发酵酸乳、制作奶酪、食品防腐、保藏等方面。
这些乳酸菌在酸奶发酵过程中产生多种代谢产物，包括乳酸、胞外多糖、风味物质以及人体营养所必需的多种维生素等。
这些菌体及其代谢产物具有改善乳制品的风味，提高制品营养价值，调节肠道菌群平衡，维持和保证肠道菌群最佳优势组合及稳定性，抑制肿瘤和免疫赋活等生理功能[1]。
酸奶是以新鲜的牛奶为原料，经过2种或2种以上的乳酸菌发酵制成的产品。
目前，主要应用于酸奶制造的乳酸菌发酵剂有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。
这2种发酵剂在酸奶发酵过程中相互作用，产生的代谢产物赋予发酵乳特有的风味、质地、口感和营养价��。
发酵乳中风味物质的成分及含量受诸多因素的影响，其风味物质的形成主要受原料中成分、加工过程中条件变化及发酵剂种类的影响。
为了提高乳酸菌在发酵过程中生产主要风味物质乙醛、双乙酰的能力，国内外一些学者对乳酸菌合成乙醛、双乙酰的代谢途径及其代谢调控方式开展了大量的研究工作。
这篇综述主要描述了乳酸菌在酸奶发酵过程中产生的风味物质，以及主要风味物质乙醛、双乙酰的代谢途径和其调控机制。
1酸奶发酵剂生产的风味物质乳酸菌在碳水化合物的代谢过程中能生产乙醛、丙酮、乙偶姻、双乙酰等多种挥发性芳香化合物[2]。
这些风味物质主要由挥发性、非挥发性酸以及羰基化合物组成，其中，羰基化合物对发酵乳的风味有显著影响。
在单一乳酸菌发酵的发酵乳中，主要羰基化合物的含量为乙醛(2.0~41.0μg/mL)、双乙酰(0.2~2.3μg/mL)、乙偶姻(2.2~28.2μg/mL)、乙醇(0.2~9.9μg/mL)以及丙酮(1.8~3.4μg/mL)[2]。
基因克隆转化实验报告
一、实验目的1. 掌握基因克隆的基本原理和操作步骤；2. 学习基因克隆转化实验技术；3. 验证目的基因在受体细胞中的表达。
二、实验原理基因克隆是指将目的基因从基因组中提取出来，并在受体细胞中稳定复制、表达的过程。
基因克隆转化实验主要包括以下步骤：目的基因的提取、克隆载体构建、目的基因与克隆载体的连接、转化受体细胞、筛选阳性克隆、鉴定阳性克隆等。
三、实验材料1. 材料：大肠杆菌DH5α、克隆载体pUC19、目的基因片段、DNA连接酶、限制性内切酶、DNA聚合酶、质粒提取试剂盒等；2. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、离心机、恒温培养箱等；3. 试剂：LB培养基、氨苄青霉素、IPTG、X-gal等。
四、实验方法1. 目的基因的提取：采用PCR技术扩增目的基因片段，利用限制性内切酶将目的基因片段与克隆载体连接；2. 克隆载体构建：将目的基因片段与克隆载体pUC19连接，构建重组克隆载体；3. 转化受体细胞：将重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α中；4. 筛选阳性克隆：在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养转化后的菌落，挑选白色菌落进行PCR验证；5. 鉴定阳性克隆：对PCR验证阳性的菌落进行菌落PCR，将扩增产物进行电泳，观察条带是否与预期大小一致。
五、实验结果1. 目的基因提取：PCR扩增产物电泳结果显示，目的基因片段大小与预期一致；2. 克隆载体构建：重组克隆载体转化到大肠杆菌DH5α后，在含有氨苄青霉素的LB培养基上培养，观察到白色菌落；3. 筛选阳性克隆：PCR验证结果显示，白色菌落中含有目的基因片段；4. 鉴定阳性克隆：菌落PCR结果显示，阳性克隆中含有与预期大小一致的目的基因片段。
六、实验讨论1. 实验过程中，DNA连接酶和限制性内切酶的用量、转化效率等因素对实验结果有一定影响，需根据实际情况调整；2. 实验中，菌落PCR验证和鉴定阳性克隆是确保实验结果准确的关键步骤；3. 基因克隆转化实验技术在生物科研和生物医药领域具有广泛的应用前景。
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武汉生物工程学院毕业论文(设计)题目： GlyA基因的克隆及检测系别：生物工程专业班级：生物工程二班学号： 0801410227 学生姓名：丁柯指导教师：叶斌时间：2011年10月至 2012年5月目录摘要............................................................. I I 关键词............................................................ I I Abstract ......................................................... I II Key words ........................................................ I II 1 前言 (1)1.1丝氨酸的简介 (1)1.2丝氨酸的研究进展 (1)1.3G LY A基因和SHMT基因工程菌 (1)1.4研究目的和意义 (1)2 材料 (2)2.1主要实验材料 (2)2.2主要实验试剂 (2)2.3试验仪器 (2)3 实验方法 (2)3.1质粒DNA的提取 (2)3.2目的基因的扩增 (3)3.3琼脂糖凝胶电泳和DNA序列分析检测 (4)3.3.1 琼脂糖凝胶电泳 (4)3.3.2 测序 (4)4 结果与分析 (4)4.1电泳结果 (4)4.1.1 质粒电泳结果 (4)4.1.2 PCR产物电泳结果 (5)4.2测序结果分析 (5)5 总结 (6)参考文献 (7)致谢 (8)GlyA基因的克隆及检测摘要GlyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶可利用廉价的甘氨酸和甲醛合成丝氨酸，很有工业价值。
本文对GlyA基因克隆作了探索，成功地从大肠杆菌BL21菌株中提取出质粒DNA，并用PCR 法扩增出长约1.6kb的DNA片段。
经Agarose电泳和DNA序列分析(blast软件比对分析),发现该片段与已报道的Methy lobacteriumex torquens AM1的glyA基因的序列相似性为95% ,氨基酸序列的相似性为98%，确证PCR法扩增的DNA片段是GlyA目的基因。
关键词甘氨酸；丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）；PCRGlyA gene cloning and testingAbstractGlyA genetic code of serine hydroxyl phenol-o-methyl shift enzyme can use cheap glycine and formaldehyde synthesis serine,very industrial value.In this paper, the GlyA gene cloning of method, successfully from e. coli strains BL21 extract plasmid DNA, PCR amplification method and a long approximately 1.6 KB segment of DNA.The Agarose electrophoresis and DNA sequence analysis,PCR amplification method confirmed segment of DNA is GlyA purpose gene.Key wordsGlyA;Serine hydroxyl phenol-o-methyl shift enzyme(SHMT);PCR1 前言1.1 丝氨酸的简介丝氨酸（简称Ser.）是一种重要的生化试剂和药剂，在氨基酸输液和氨基酸胶囊以及多肽合成等方面发展迅速。
同时丝氨酸的衍生物也具有优良的药用和生物活性[1]，如：取代丝氨酸被应用于设计多肽，而且是免疫抑制剂ISP（多球壳菌素mvriocin，嗜热菌杀酵母素thermozymoc记in）和免疫激活剂，神经鞘真菌素E川等生物活性物质的有效组成部分[2]；L-丝氨酸的磷酸脂具有解除疲劳，恢复体力等功效；偶氮丝氨酸常用于治疗肿瘤。
但是目前国内外生产L-丝氨酸的方法，不论是水解蛋白还是传统发酵，成本都很高。
而GlyA基因编码的丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）可利用廉价的甘氨酸和甲醛合成L-丝氨酸[3]，很有工业价值。
八十年代初，Hamilton等用鸟枪法克隆并构建了SHMT基因工程菌，已用于生产。
沈天翔等在九十年代初，也用此法克隆出了GlyA基因[4]。
1.2 丝氨酸的研究进展目前L-丝氨酸生产水平还较低，在世界氨基酸生产行业中L-丝氨酸是工业化生产难度较大的氨基酸。
日本用前体发酵法生产L-丝氨酸，在1969年产量为4t，在1990年70t，在1996年100t，2002年280t[5]。
中国以前大多采用蛋白质水解法提取，然而分离困难，始终未能形成生产规模。
四川南充药厂生产是用发酵法，生产周期长，收率低也不宜推广应用。
而湖北八峰药化采用酶促法转化生产L-丝氨酸，2003年3月建成一条年产50t的生产线，产酸量及转化率均达到国际先进水平[6]。
丝氨酸在人体中由糖代谢中间产物3-磷酸甘油反应生成，工业上则是由蛋白质水解法、发酵法、化学合成法和酶法制备得到。
Mullis和Saiki等于1985年发明的PCR技术（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应），能简单、快速地得到微克级的纯目的基因片段，在现代分子生物学研究中，尤其是基因克隆方面，得到了越来越广泛的应用[7]。
1.3 GlyA基因和SHMT基因工程菌丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT），由GlyA基因编码，是一种以5-磷酸吡哆醛为辅酶的吡哆醛酶，它能在四氢叶酸存在的条件下，催化甲醛与甘氨酸缩合生成L-丝氨酸[8]。
在自然界中，一般的菌体内都含有GlyA基因，都能自产SHMT酶。
用于生产L-丝氨酸的SHMT酶主要源于两个方面：（1）从自然界中筛选出高产菌株，如PseudomonasSP；（2）利用现代生物技术，构建SHMT高产的基因工程菌，这方面的工作最早是由lowa大学微生物系StaufferG.V等人进行的。
1981年，他们首先以pACYC184为质粒，用鸟枪法构建了一系列重组质粒（以EcoR1为酶切点），并转化到丝氨酸营养缺陷型菌株GS245中，同时利用适当的抗性标记筛选出含GlyA基因的重组质粒pGS1酶切结果显示，插入pACYC184的外源基因片段约长13kb；然后利用抗卡那霉素的Tn5转座子进行随机插入实验，把GlyA基因的具体位置限定在一段2.5kb的序列上（Sall-Boll）。
在其后的几年中，他们对这2.5kb的基因片段和其编码的SHMT进行DNA序列及氨基酸序列分析，他们发现，在细胞外转录-翻译系统中pGS1中长13kb生物EcoR1插入片段编码了两条分子量十分接近的肽，分别是46500和45500。
当GlyA基因在Tn5转座子介入而失去转翻译活性后，分子量45500的肽消失，从而证明了GlyA基因产物的分子量，即SHMT酶的分子量是46500[9]。
1.4 研究目的和意义我们在前人工作的基础上，大胆采用较新的PCR技术，从大肠杆菌BL21菌株中提取出质粒DNA，并用PCR法扩增出长约1.6kb的DNA片段，证实了PCR法扩增的DNA片段是GlyA目的基因，为下一步构建高效表达丝氨酸羟甲基转移酶的基因工程菌做准备。
为丝氨酸羟甲基转移酶利用廉价的甘氨酸和甲醛生产丝氨酸做了铺垫，为丝氨酸的工业生产奠定了良好的基础。
2 材料2.1 主要实验材料原含GlyA基因宿主菌：E.coli .Chaperone Competent Cell pG-KJE8/BL21 code 9121（武汉生物工程学院基因工程实验室保藏）；正向引物P1:5’-ATGTTAAAGCGTGAAATGAACA-3’；反向引物P2:5’-TTATGCGTAGAACCGGGTAACGT-3’（购于上海生工生物）。
2.2 主要实验试剂LB培养基（pH 7.2）：1%胰化蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%氯化钠、1.5%-2%琼脂；TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)、1 mmol/LEDTA(pH 8.0),4 ℃保存；6×上样缓冲液：0.25％溴酚蓝、40％蔗糖、10 nmol/LEDTA(pH 8.0),4 ℃保存；溴化乙啶（EB）购于上海研拓生物科技有限公司；PCR试剂盒购于大连宝生物公司；电泳琼脂购于GENE COMPANY LTD；Tris base 购于武汉杰辉生物技术有限公司；琼脂糖电泳级、DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸（NTPs）、10×Buffer、核酸电泳Marker（λDNA/HindⅢ）、TaKaRa质粒提取试剂盒：均购于宝生物工程（大连）有限公司。
2.3 试验仪器BYY-8B型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂ZF-258型全自动凝胶成像分析系统上海嘉鹏科技有限公司MG48G型基因扩增仪杭州朗基科学仪器有限公司HH-S3型数显恒温水浴锅金坛市金南仪器厂SW-CJ-ZF无菌操作台上海浦东荣丰科学仪器有限公司HQ45Z型恒温摇床武汉中科科仪技术发展有限公司BS124S型精密电子天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司DS76310型微量移液器上海大龙医疗设备有限公司5417R型低温高速离心机深圳市凯铭杰仪器设备有限公司WP700P21型微波炉佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司SZ-93型自动双重水蒸馏仪上海亚荣生化仪器厂YX280A型手提式不锈钢蒸汽消毒器上海三申医疗器械有限公司3 实验方法3.1 质粒DNA的提取原理：质粒提取无论手提还是试剂盒，其根本原理大多还是碱裂解法。
当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来[10]。
进一步的质粒DNA获取，手提是经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA以及过多的盐分，而试剂盒则在此基础上使用DNA吸附柱来吸附质粒DNA，再洗脱得到质粒[11]。
利用TaKaRa质粒提取试剂盒从原含GlyA基因的E.coli BL21中提取含有目的基因的质粒DNA。
并将提取出来的质粒DNA于冰箱冷冻保存。
（1）取4mL的过夜培养菌液，12000rpm离心2min弃上清液。
（2）用250uL的溶液Ⅰ充分悬浮菌液。
（稳定pH，使菌液悬浮，抑制DNase的活性和抑制微生物生长）（3）加入250uL的溶液Ⅱ轻轻地上下翻转混合5~6次，是菌液裂解，形成透明溶液。