TRIzol法
Trizol-法提取RNA实验步骤
Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液[准备不含RNase的水，将其装入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。
静置过夜，然后高压灭菌。
0.5% SDS溶液必须用DEPC预处理、高压灭菌的水]1、组织匀浆(1) 取出高温高压消毒后研钵，切取50-100mg冰冻组织置于研钵内，倒入液氮，研碎。
(2) 每50-100mg均浆组织标本中加入1ml的TRIZOL，标本的量不能超过TRIZOL体积的10%，否则会出现DNA污染。
(3) 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分钟，以彻底分离核蛋白复合体。
2、相分离加入0.2 ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇晃15秒，在15- 30°C放置2-3分钟，然后离心12,000× g，15 minutes ，2 - 8°C。
离心后分成三层，下面的红色为酚-氯仿相，一个中间层，一面是无色的水相。
RNA只存在于水相中。
水相占总TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的EP管中，加入0.5ml异丙醇，静置10 minutes ，15 -30°C，然后离心12,000 × g ，10 minutes，2 - 8°C。
离心前可以在管的侧壁和底部看到絮状胶样沉淀，这就是RNA沉淀。
4、RNA洗涤去上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，振荡器混匀，离心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心干燥）。
注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它的溶解度。
RNA提取方法
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放臵5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放臵2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相臵于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放臵10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
通用Trizol法提取RNA
Trizol法提取细胞rna2.1 实验器材的处理1．在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。
2．处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
3．在通风柜中室温处理过夜。
4．将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌40分钟。
5．烘箱用合适的温度烘拷至干燥。
置于干净处备用。
6. 璃玻和金属物品250°C烘烤3小时以上。
2.2 细胞RNA的提取1、液氮冻过的细胞敲出直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管，室温放置5min，使其充分裂解2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。
11、可用50ul H2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。
12、测O.D值定量RNA浓度。
2.3．RNA分析紫外分光光度计测量含量，2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。
A260/230，A280/260值都大于1.8为好。
TRIZOL用法
TRIZOL（invitrogen life techologies）一．RNA提取1.-80o C取标本2.取组织3.液氮中陶瓷研钵研磨，组织呈粉状时转移到预先称重的5毫升的塑料离心管中，离心管需要DEPC水处理后，灭菌。
称重，得组织100mg4.加入TRIZOL 1.5ml（-60 o C—-70o C下，可存放1个月）5.室温保温5min6.加入氯仿0.3ml，盖紧手震动混匀15s7.室温2-3min8.4 o C，12000g 15min9.取上清约0.8ml，转移到1.5ml离心管中，管子处理同上，去净上清的中下层液体用于DNA和蛋白质的提取10.加异丙醇0.7ml，混匀，室温下10min11.4 o C，10000g 10min12.弃上清，加1.4ml 75%乙醇（以DEPC处理灭菌水配制）混匀13.4 o C，7000g 5min14.弃上清，室温干燥5min15.DEPC处理灭菌纯水100μl溶解，-70 o C保存二．DNA提取1.去净上清的中下层液体约0.6ml，加入100%乙醇0.45ml，混匀2.室温下2-3min3.4 o C，5000g 5min4.去除液体，可保留用为蛋白提取5.加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀，室温下30分钟，间断混匀6.4 o C，2000g 5min7.重复洗涤一次8.加入0.1M柠檬酸钠75%乙醇溶液洗涤1.4ml DNA沉淀，室温下15分钟，间断混匀9.4 o C，2000g 5min10.室温下干燥5-15min11.在300-600μl 8mM NaOH中溶解，DNA浓度约为0.2-0.3 μg/ μl12.若有不溶物，12000g 10min13.上清可以在4 o C存放过夜14.长时间保存需要用HEPES加1mM EDTA调整pH至7-8。
三．蛋白质提取1.转移上清到5ml的离心管中，大约体积为1ml2.加入2.3ml异丙醇（1.5ml/mlTRIZOL），室温下保温10min3.4 o C，12000g 10min4.加入3ml（2ml/mlTRIZOL）含0.3M盐酸胍的95%乙醇，室温下20min5.4 o C，7500g 5min6.重复洗涤3次7.加入2ml乙醇，室温下20min8.4 o C，7500g 5min9.真空干燥蛋白沉淀5－10min，1%SDS溶解10.完全溶解需要在50 o C保温，不溶物可4 o C 10000g 10min离心去除11.上清转移至新管，可用于Western blotting或－20o C存放。
TRIZOL法提取总RNA
目录
• 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 注意事项 • 实验优化和常见问题处理
01
实验原理
Trizol的组成和作用
Trizol是一种常用的细胞裂解液，主要由苯酚、异硫氰酸胍和苯酚等成分 组成。
苯酚的作用是使蛋白质变性并释放核酸，异硫氰酸胍的作用是抑制DNA 酶活性，防止DNA降解，同时能ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ效地变性蛋白质，使RNA充分释放。
RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳
将RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，观察28S和18S rRNA条带的亮度及完整性， 判断RNA的质量。
生物信息学分析
将RNA测序数据与基因组数据进行比对，分析转录本的拼接情况，评估RNA的 完整性。
反转录和PCR验证
反转录
将RNA反转录成cDNA，以便进行后 续的PCR验证。
效果。
去除DNA和蛋白质
在提取RNA的过程中，需要去除DNA 和蛋白质等杂质，以避免对后续实验 的干扰。
在去除杂质的过程中，需要注意控制 好离心时间和转速，以保证去除效果。
Trizol法中，DNA和蛋白质可以通过 离心和洗涤的方法去除。在离心后， 上清液中的DNA和蛋白质可以被去除， 而RNA则留在沉淀中。
在使用Trizol法时，通常采用玻璃匀浆器或匀浆机进行匀浆破碎。
抽提RNA
抽提RNA的目的是将RNA从细 胞碎片和其他杂质中分离出来。
Trizol法是一种常用的RNA抽提 试剂，它能够有效地分离出
RNA，同时抑制DNA和蛋白质 的降解。
在抽提过程中，需要按照试剂说 明书进行操作，注意控制好细胞 碎片的浓度和体积，以保证抽提
将提取的RNA存储在无菌环境中， 避免污染。
trizol法
TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA 的完整性。
在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。
取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。
动植物总RNA提取-Trizol法Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交，Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
Trizol法提取组织和细胞RNA
Triz ol法提取组织和细胞RNA操作步骤：1、用剪刀将半个绿豆大小的组织剪碎，加入1 ml Trizol , 振荡器上震荡1分钟。
常温放置10 min，使核蛋白体完全分解。
2、加入200 ul 三氯甲烷（氯仿），盖紧管盖，剧烈震荡15 sec。
常温静置10 min。
3、在4度条件下，11000 rpm 离心15 min。
4、将水样层转移到一个新的离心管中，加入500 ul 异丙醇。
颠倒混匀后，常温静置10 min。
『离心后分为三层，下层为红色的苯酚-氯仿层，中间层，和上层的水样层。
RNA存在于水样层中』5、在4度条件下，11000 rpm 离心10 min。
6、用枪小心吸走液体，留沉淀在管底。
加入1 ml 75%的乙醇，在振荡器上震荡5sec，洗涤沉淀一次。
7、在4度条件下，8000 rpm 离心5 min。
8、将上清小心去掉，干燥沉淀10 min，加入适量的水溶解沉淀10 min。
9、检测浓度，鉴定RNA产量和纯度。
Takara PrimeScript RT reagent Kit逆转录Real-time PCR 用cDNA 操作步骤：1、按下列组分冰上配制RT反应液5×PrimeScript Buffer 4 ulPrimeScript RT Enzyme Mix 1 ulOligo dT Primer 1 ulRandom 6 mers 1 ulTotal RNA X（1 ug）RNA Free dH2O 补足20 ul2、混匀后，按如下反应条件进行：37度15 min85度 5 sec反应结束后将产物于-20度保存，待Real-time PCR检测。
Trizol法提取总RNA(细胞和组织)
Trizol法提取总RNA
1、①提取组织RNA时，研钵高温高压灭菌，每50-100mg组织液氮研磨后，将粉末用液氮预冷的药匙转移至预先装有1ml Trizol的EP管中，充分混匀（粉末总体积不能超过Trizol体积的10%）用1ml Trizol 试剂裂解；
②提取细胞RNA时，每5-10×106个细胞用1ml Trizol裂解，反复吹打或剧烈振荡；
2、将上述裂解液，室温15-30℃静置5min；
3、每1ml Trizol加入0.2ml氯仿，在手中用力振荡15s，室温放置2-3min后，12000r离心15min（2-8℃）；
4、取上层水相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加入0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，室温放置10min，12000r离心10min（2-8℃），弃上清；
5、向沉淀中按每1ml Trizol加1ml 75% 乙醇（4℃），涡旋混合，进行洗涤，7500r离心5min（2-8℃）,弃上清；
6、将RNA沉淀在室温下自然干燥（5-10min）；
7、用30μl RNase-free water溶解RNA沉淀；
8、取出1μl，稀释10倍，测定RNA浓度并记录；
9、进行反转录或分装保存于-80℃。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法提取RNA实验步骤及原理实验原理：Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用三种有机物（TRIzol、氯仿和异丙醇）的混合物，使细胞或组织中的RNA在低温下与TRIzol发生相互作用，形成RNA-TRIzol复合物。
加入氯仿后，RNA-TRIzol复合物会转移到有机相中，而DNA和蛋白质则留在水相中。
通过离心分离有机相和水相，可将RNA从有机相中分离出来。
最后，加入丙醇沉淀RNA，即可得到纯度较高的RNA。
实验步骤：1. 细胞或组织样品的收集：将细胞或组织样品收集到离心管中。
2. 加入Trizol试剂：向离心管中加入适量的Trizol试剂，按比例加入的量为1mL Trizol/100mg组织或1×10^7个细胞。
3. 细胞或组织样品的破碎：使用超声波或均质器等方法将细胞或组织样品破碎。
4. 加入氯仿：向离心管中加入适量的氯仿，按比例加入的量为0.2mL氯仿/1mL Trizol。
5. 混合离心：将离心管中的混合物混合均匀后，离心分离有机相和水相。
6. 收集RNA：将有机相转移到新的离心管中，加入适量的异丙醇，沉淀RNA。
7. 洗涤RNA：用75%乙酸酒精洗涤RNA。
8. 溶解RNA：用RNase-free水或DEPC水溶解RNA。
9. 检测RNA：使用比色法或琼脂糖凝胶电泳等方法检测RNA的纯度和浓度。
注意事项：1. Trizol试剂应保存在4℃下，避免阳光直射和冰冻。
2. 操作过程中要注意RNA的保护，避免RNA的降解。
3. 操作过程中要使用无菌技术，避免污染。
4. 操作过程中要注意个人防护，避免接触到有害物质。
5. 实验前要准备好所有所需试剂和设备，确保实验顺利进行。
6. 实验后要及时清洗和消毒实验器材，避免交叉污染。
trizol法提取rna步骤
trizol法提取rna步骤TRIzol法提取RNA步骤RNA是一种重要的生物大分子，具有多种功能。
在研究生物学、医学等领域中，需要从细胞或组织中提取RNA。
TRIzol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用TRIzol试剂将细胞或组织中的RNA溶解，并与其他生物大分子分离。
本文将详细介绍TRIzol法提取RNA 的步骤。
材料准备- TRIzol试剂- 高纯度异丙醇- DEPC水- RNase-free微量离心管和移液器- 1.5 mL离心管- 无菌手套和口罩- 冰桶和冰块步骤一：样品采集首先需要采集样品，可以是细胞或组织。
对于细胞，可以使用离心机将其沉淀；对于组织，则需要切碎并加入适当量的PBS缓冲液。
步骤二：样品裂解将采集到的样品加入适量的TRIzol试剂，并使用移液器充分混合。
然后使用高速离心机将样品离心10分钟，使其裂解。
步骤三：RNA分离将上述裂解物转移至新的离心管中，并加入等体积的异丙醇。
充分混合后，使用高速离心机离心10分钟，使RNA沉淀到底部。
步骤四：RNA洗涤将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入75%的乙醇。
充分混合后，使用高速离心机离心5分钟，去除残留的TRIzol试剂和异丙醇。
步骤五：RNA溶解将上述沉淀物转移至新的离心管中，并加入适量的DEPC水。
充分混合后，在65℃下孵育10分钟，使RNA完全溶解。
步骤六：RNA保存将溶解后的RNA转移至RNase-free微量离心管中，并存放在-80℃冰箱中保存。
注意事项- 在操作过程中要穿戴无菌手套和口罩，以避免污染。
- TRIzol试剂具有强烈腐蚀性，需注意安全操作。
- 所有使用到的器材和试剂都要事先消毒处理。
- 操作过程中需保持低温环境，以避免RNA降解。
- RNA提取后需立即存放在-80℃冰箱中，以避免RNA降解。
TRIzol法提取步骤
TRIzol法提取步骤1、研磨：不多于0.1g植物材料。
2、抽提:向离心管中加人l ml TRizol，充分混匀，室温放置5min。
3、4℃12000rpm，离心10min。
取上清，转移到新的无RNase的新离心管中，加人0.2mL氯仿，盖好盖后，用手剧烈震荡15s，室温放置3min。
4℃11000rpm离心15min，样品分层，把水相约600ul转移至新管中。
5、沉淀:在得到的水相中加人500μl异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃11000rpm离心10min，去上清。
6、洗涤:加人lml75%乙醇洗涤沉淀，4℃7500rpm离心5min将75%乙醇用移液枪吸净，将离心管在超净工作台中吹干(大约3min)时间过长，RNA不易溶解，加人30μl无RNase水混匀溶解沉淀。
方法二：(1)取小于0.2g的小麦黄花苗尽快液氮研磨成粉末状后移人1．5ml小指管；(2)立即加lml TRIzolReagent，轻弹管底，尽快混合样品至重悬；(3)水平放置小指管室温孵育20min；(4)4 C，12000rpm，离心10min；(5)移澄清上清液人一新的1．5ml小指管中，加人0．2ml氯仿，盖紧管盖，用力摇动1．5ml小指管15s，室温孵育2min-3min；(6)4 C，12000rpm，离心15min；(7)移最上层水相到新的1．5ml小指管中，加入0．25ml异丙醇、0．25ml 高盐混合液(O.8mol/l 柠檬酸钠+1.2mol/l NaCl)混匀，室温孵育30min；(8)4℃，12000rpm，离心10min；(9)弃上清，用lml 75％乙醇(用DEPC水来配)洗沉淀，涡旋混合样品，4℃，12000rpm离心5min；(1O)弃上清，短暂干燥RNA沉淀5min-10min，用RNase-free(DEPC处理过的)水溶解沉淀，-70℃保存，供以下实验使用。
trizol法
trizol法
Trizol法是一种常用的分离和提取核酸的方法，它可以有效地分离和提取DNA、RNA和蛋白质。
Trizol法是由美国公司GIBCO BRL公司开发的，它是一种三步法，可以有效地分离和提取核酸。
Trizol法的第一步是细胞悬液的混合，将细胞悬液加入Trizol液中，然后混
合均匀，使细胞膜破裂，释放出细胞内的核酸。
第二步是沉淀提取，将混合液加入乙醇，使核酸沉淀，然后用离心机将沉淀物
收集，再用热水浴将沉淀物稀释，最后用离心机将沉淀物收集，得到提取的核酸。
第三步是提取液的清洗，将提取液加入苯乙醇，使蛋白质沉淀，然后用离心机
将沉淀物收集，再用热水浴将沉淀物稀释，最后用离心机将沉淀物收集，得到提取的核酸。
Trizol法是一种有效的分离和提取核酸的方法，它可以有效地分离和提取DNA、RNA和蛋白质，是研究基因的重要工具。
它的优点是简单、快速、高效，可以有效
地提取大量的核酸，是研究基因的重要工具。
trizol试剂法
Trizol试剂法是一种用于提取RNA的常用方法，其操作简单，可以同时处理多个样品，且提取的RNA无DNA 和蛋白质污染。
以下是其基本步骤：
1. 将细胞或组织样本磨碎，具体操作方法是将细胞或组织样本放入匀浆器中，加入Trizol试剂，通过反复
研磨来破碎细胞。
2. 加入氯仿，用力震荡后离心。
此步操作可使不同物质分相，将RNA留在水相中。
3. 将水相转移至新的EP管中，加入异丙醇后再次离心。
这一步可促进RNA沉淀。
4. 去除上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀，最后让RNA在室温下自然干燥。
5. 用无RNA酶的水溶解RNA沉淀。
此外，Trizol试剂法提取RNA时，需注意以下几点：
1. 在收集到生物材料后应尽快进行RNA制备工作，以避免RNA降解。
2. 提取RNA时，每50~100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细
胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞。
3. 提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于 Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase 保护分
析等。
请注意，对于不同类型和状态的材料，可能需要调整Trizol试剂法的具体步骤和参数。
因此，在实验过程中应根据实际情况进行调整。
RNA 提取(Trizol法)
定位克隆实验室 2010-12-27 胡文波修订- 1 - Trizol 法提取 RNA操作步骤：1. 准备镊子剪刀等材料、试剂，注意取材环境的消毒。
2. 加300ul Trizol 溶液至装有材料的无RNase 的1.5ml 离心管中。
3. 研磨材料，另加700ul Trizol ，涡旋1min 。
4. 离心：15000g 4℃ 10min 。
5. 吸取上清液至新的离心管中，注意不要接触沉淀。
6. 加200ul （1/5 Trizol 体积）氯仿，用手剧烈振动离心管2-5min,然后涡旋15s,室温下孵育样品10min 。
7. 离心：15000g 4℃ 10min 。
8. 转移水相至新的离心管，加500ul （1/2 Trizol 体积）异丙醇，混匀，室温下孵育样品10min 。
9. 离心：15000g 4℃ 5min 。
10. 移除上清液，用1ml （1倍Trizol 体积）75%乙醇上下颠倒洗涤RNA 团块，涡旋混匀样品。
11. 离心：7500g 4℃ 5min 。
12. 移除上清液，泄放离心管，吸取剩余溶液，使RNA 干燥2-3min(RNA 不宜太干)。
13. 加100ul 20mM NaAc/0.5% SDS 溶液，完全溶解RNA 团块(RNA 可保存于此溶液中，-80℃)。
14. 取2ul RNA 进行琼脂糖凝胶（w/v = 2%）电泳，检测其完整性。
15. 取1ul RNA 测浓度，调节RNA 至终浓度为1ug/ul 。
RNA 纯化16. 取5ul 1ug/ul RNA 至新的离心管，加5ul （等体积） 3M NaAc 溶液和15ul （3倍体积） ddH2O ，混匀，17. 然后加50ul （2.5倍体积）无水乙醇，颠倒离心管，混匀，冰上放置30min 。
18. 离心：15000g 4℃ 5min 。
19. 移除上清液，用500ul 75%乙醇上下颠倒洗涤RNA 团块，涡旋混匀样品。
trizol法
trizol法trizol法:在收集到⽣物材料之后，最好能即可进⾏RNA制备⼯作。
若需暂时储存，则应以液氮将⽣物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，⽴即以加⼊液氮研磨的⽅式打破细胞，不可以先⾏解冻，以避免RNase 的作⽤。
1. 提取组织RNA时，每50~100mg组织⽤1ml Trizol试剂对组织进⾏裂解：提取细胞RNA时，先离⼼沉淀细胞，每5~106个细胞加1ml Trizol后，反复⽤枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；2. 将上述组织或细胞的Trizol裂解液转⼊EP管中，在试问15~30℃下放置5分钟；3. 在上述EP管中，按照每1ml Trizol后加0.2ml氯仿的量加⼊氯仿，盖上EP管盖⼦，在⼿中⽤⼒震荡15秒，在室温下（15~30℃）放置2~3分钟后，12000g（2~8℃）离⼼15分钟；4. 去上层⽔相置于新EP管中，按照每1ml Trizol加0.5ml异丙醇的量加⼊异丙醇，在室温下（15~30℃）放置10分钟后，12000g（2~8℃）离⼼10分钟；5. 弃上清，按照每1ml Trizol加1ml 75% ⼄醇进⾏洗涤，涡旋混合，7500g（2~8℃）离⼼5分钟，弃上清；6. 让沉淀的RNA在室温在⾃然⼲燥；7. ⽤Rnase-free water溶解RNA沉淀。
具体需要的操作(TaKaRa)●制品内容（50次量）1. PrimeScript? RTase（200 U/ µl）50 µl2. 5×PrimeScript? Buffer 200 µl3. RNase Inhibitor（40 U/µl）25 µl4. dNTP Mixture（10 mM each）50 µl5.Oligo dT Primer（50 µM）50 µl6. Random 6 mers（50 µM）100 µl7. RNase free H2O 1 ml 【引物序列】引物名称引物序列Random 6 mers pd(N)6Oligo dT Primer TaKaRa独⾃开发的dT区域的序列* 该序列和TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（TaKaRa Code: DRR019A）的Oligo dT Adaptor Primer不同，不含有M13 Primer M4对应序列。
trizol提取rna的原理
trizol提取rna的原理
Trizol提取RNA的原理
Trizol是一种常用的RNA提取试剂，广泛应用于生物学研究领域。
它的原理基本上可以概括为以下几个步骤：
1. 细胞破碎：首先，Trizol会迅速破坏细胞膜和细胞核膜，释放出细胞内的RNA。
这一步骤非常关键，因为只有将细胞完全破碎，才能确保后续的RNA提取过程能够顺利进行。
2. RNA沉淀：在破碎细胞的混合物中，RNA会与Trizol中的酚相互作用，形成RNA-酚复合物。
通过离心的方式，将RNA-酚复合物沉淀到管底，使其与其他细胞碎片和蛋白质分离开来。
3. RNA洗涤：沉淀的RNA-酚复合物会被洗涤，以去除杂质和残留的Trizol。
这一步骤能够有效净化RNA，确保后续实验的准确性和可靠性。
4. RNA溶解：最后，RNA-酚复合物会被溶解在适当的缓冲液中，使RNA完全溶解并保持稳定。
这样就得到了高质量的RNA样品，可以用于后续的实验操作，如逆转录、PCR等。
总的来说，Trizol提取RNA的原理是通过酚相分离和沉淀的方式，将RNA从细胞中提取出来，并经过洗涤和溶解等步骤，最终得到纯净的RNA样品。
这种方法简单、高效，适用于各种类型的细胞和组
织，广泛应用于基因表达分析、功能基因研究等领域。
通过了解Trizol的提取原理，可以更好地掌握RNA提取的技术要点，提高实验的成功率和数据的可靠性。
Trizol法提取细胞中RNA及逆转录合成cDNA
Trizol法提RNA试剂及材料：Trizol（3号冰箱4℃3层）、三氯甲烷、异丙醇（以上二者在有机厨）、75%乙醇（按DEPC水:无水乙醇=1：3配制）、DEPC水（以上二者在3号冰箱—20℃3层）、肺动脉平滑肌细胞仪器：4℃离心机、移液枪、Nano drip 2000(微量紫外分光光度仪)、1.5mlEP 管、200μl EP管、EP管插板、冰盒准备：1、配制DEPC水：取一个500ml蓝盖瓶，用去离子水洗涤，加入超纯水500ml,想瓶中加入DEPC母液0.5ml,震荡摇匀，在通风厨内常温过夜，灭活RNA酶，第二天将瓶子盖拧松，高温高压消毒灭菌（121℃，30min）,消毒后分装在1.5mlEP 管中，4℃保存。
2、新鲜标本的保存（备用于RNA提取）：取新鲜标本，先放入液氮中，然后冻存于-80℃。
3、动物组织提RNA前处理：用PBS冲洗干净后，按50-100mg加入1ml Trizol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆，最好在冰上进行。
注：均质50-100 毫克组织样本需要 1 毫升的TRIzol 试剂，使用特富龙玻璃®或强力均质机（Polytron, or Tekmar's TISSUMIZER® TISSUMIZER ®或相当的仪器）。
均质时样本体积不应超过TRIzol 试剂体积的10％。
b. 单层细胞直接在培养皿中裂解细胞，3.5 厘米直径的皿中加入TRIzol 试剂1 毫升，并通过抽吸几次促进细胞裂解。
TRIzol 试剂的添加量基于培养的面积而不是细胞的数目（每10 平方厘米加入1 毫升）。
TRIzol 试剂量不足可能会导致分离出的RNA 有DNA 的污染。
步骤：1.将处理完的35mm细胞皿从细胞培养箱中取出，用预冷的PBS 清洗1-2 次，迅速加入已经预冷的Trizol液1ml，室温孵5分钟。
2.收集标本悬浮于1.5ml EP管内，加入200ul三氯甲烷，用手上下震荡15秒，使之充分混匀成乳状，室温孵育3分钟。
trizol 提取 油状
trizol 提取油状【实用版】目录1.TRIZOL 提取的概述2.TRIZOL 提取油状的方法3.TRIZOL 提取油状的应用4.TRIZOL 提取油状的优势与局限正文1.TRIZOL 提取的概述TRIZOL 是一种常用的细胞膜蛋白提取试剂，其主要成分为聚乙二醇(PEG)、N-十二烷基磺酸钠 (SDS) 和三氯甲烷。
在生物学实验中，TRIZOL 被广泛应用于提取细胞膜蛋白、细胞内蛋白质等。
通过使用 TRIZOL，研究者能够高效地提取目标蛋白质，从而进行后续的实验分析。
2.TRIZOL 提取油状的方法在使用 TRIZOL 提取油状物质时，通常需要遵循以下步骤：（1）样品处理：首先，需要对实验样品进行处理，如研磨、匀浆等操作，以便于后续的提取。
（2）添加 TRIZOL：将处理好的样品与适量的 TRIZOL 混合，确保样品与 TRIZOL 充分接触。
（3）超声：将混合液进行超声处理，以提高提取效率。
超声时间可以根据实验需求进行调整，通常为 30 分钟至 1 小时。
（4）离心：超声处理后，将混合液进行离心，以去除沉淀物。
离心速度和时间需根据实际需求进行选择。
（5）提取油状物质：从离心管中取出上清液，即为提取得到的油状物质。
3.TRIZOL 提取油状的应用TRIZOL 提取油状物质的方法在生物学领域具有广泛的应用，例如：（1）提取细胞膜蛋白：通过 TRIZOL 提取，可以获得较为纯净的细胞膜蛋白，用于研究细胞膜结构与功能。
（2）提取细胞内蛋白质：TRIZOL 提取法可用于提取细胞内蛋白质，以便进行蛋白质组学分析。
（3）提取生物样品中的脂质：TRIZOL 提取法可用于提取生物样品中的脂质，以研究脂质代谢与生物活性。
4.TRIZOL 提取油状的优势与局限优势：（1）提取效率高：TRIZOL 提取法能够快速、高效地提取目标蛋白质和其他生物大分子。
（2）操作简便：相较于其他提取方法，TRIZOL 提取法操作简便，易于上手。
trizol试剂提取原理
trizol试剂提取原理Trizol试剂是一种广泛使用的RNA提取试剂，它的原理是利用酚和盐酸搭配的混合物来破坏细胞膜，使得RNA释放到溶液中。
具体的提取原理如下：1. 细胞裂解：将样品与Trizol试剂混合，并通过机械方式（如搅拌或研磨）破坏细胞膜，使细胞内容物与Trizol混合。
2. 脱脂：将混合物加入氯仿，并进行剧烈摇动，使细胞溶胀并形成两相体系。
氯仿可以与Trizol中的酚类混合，并将细胞脂质分离到有机相中，降低混合物的黏度。
3. 沉淀：将上层水相转移到新离心管中，并加入异丙醇。
异丙醇用于沉淀RNA，形成白色或乳白色的物质。
4. 洗涤：用70%乙醇洗涤沉淀，以去除残留的氯仿和Trizol。
乙醇可以减少RNA降解和去除杂质。
5. 溶解：用去离子水或含RNase的缓冲液溶解RNA沉淀，得到高质量的RNA。
整个提取过程基于RNA在酚和盐酸混合物中的相互作用，通过酚提供酸性环境和与RNA结合的能力，盐酸能够破坏细胞膜并使RNA释放到溶液中。
脱脂、沉淀和洗涤步骤则用于去除细胞脂质和其他杂质。
最后，溶解步骤使RNA完全可溶于溶液中，以供后续分析使用。
继续上述原理之后的步骤如下：6. DNase消化（可选）：如果需要去除DNA污染，可以在溶解RNA沉淀之前加入DNase对样品进行DNA消化。
这可以通过添加DNase I和MgCl2来实现，以去除DNA而不影响RNA。
7. 沉淀和洗涤：将处理后的RNA溶液加入硫酸铵与异丙醇，产生白色RNA沉淀。
离心沉淀，去除上清液，然后使用75%乙醇洗涤沉淀，去除盐和其他污染物。
8. 干燥和溶解：将洗涤后的沉淀离心去除乙醇，然后将RNA沉淀在室温条件下风干。
最后，使用去离子水或缓冲液溶解RNA沉淀，以得到RNA样品。
Trizol试剂的优点是能够快速和高效地提取RNA，并且适用于各种样品（细胞、组织等）。
同时，这种提取方法还可以同时提取DNA和蛋白质，使其具有广泛的应用范围。
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TRIzol法
TRIzol RNA提取操作方便、快捷。
（一）试剂准备
1．TRIzol试剂。
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC H2O配制）
5．DEPC H2O
（二）操作步骤
1．样品处理：
（１）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（２）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Tr izol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。
4℃，7500g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事项
1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。
2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。
二、总RNA定量
RNA定量方法与DNA定量相似。
RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。
因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。
如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以d dH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：
RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000
RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。
若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。