TRIZOL说明书

trizol 中文说明书

trizol 试剂是一种从组织及细胞中提取总rna的专用试剂。这种试剂是一种酚和硫氰酸

胍的单相溶液，是将chomczynski 和sacchi发明的一步rna提取法的改进。在样品匀浆或

分析过程中，trizol 试剂可在分裂细胞及溶解胞膜的同时保持rna的完整。在匀浆后加入氯

仿，可将溶液分为水相和有机相。rna均在水相中。吸取水相加入异丙醇，得到rna沉淀。

去除水相后，样品中的dna及蛋白质可通过进一步连续的沉淀而得到。中间相加入乙醇可沉

淀dna而有机相加入异丙醇则能沉淀出蛋白质。dna的再纯化可能对标化样品的rna产量有

作用。

2．这一技术可以用于人，动物，植物或细菌株的微量组织（50—100mg）及细胞（5

×106），也可以用于大量检材（≥1g）及细胞(﹥107).该方法简便易行,可用于同时检测大量

样品,全部过程1小时内可以完成.用trizol 试剂分离的rna 没有dna及蛋白质成分.这种

rna可用于northern印迹分析,斑点杂交,多聚(a)+检出及vitro转移, rna酶蛋白分析及分

子克隆.用于pcr反应时,当两个引物位于同一外显子时应用扩增特异dna酶i处理提取出的

rna.

3． trizol 试剂可用于分子量从大到小的各种rna的提取.例如,大鼠肝脏提取出的rna,

经琼脂糖凝胶电泳,eb染色后可显现出7kb和15kb的大分子量的rna谱带(包括mrna和

hnrna), 位于～5kb(28s)和～2kb (18s)的两条主要的核糖体rna谱带及大小在0.1kb-0.3kb

之间的低分子量rna(trna,5s).分离出的rna当溶于双蒸水中时a260/280为1.6-1.8之间.

每毫克组织所能提取的rna量约为:肝和脾,6-10μg;肾,3-4μg;骨骼肌和脑,1-5μg;胎

盘,1-4μg.从1×106培养细胞中提取的rna量约为:上皮细胞,8-15μg;成纤维细胞,5-7μg.

需要但未提供的试剂:

1. 氯仿

2. 异丙醇

3. 75%乙醇(depc处理水配制)

4. 无rna酶水或0.5%sds溶液(制备无rna酶水:将水倒进无rna酶的玻璃容器中,加入

depc至0.01%(v/v)放置过夜后高压灭菌). sds溶液必须用depc处理后高压灭菌的水配制.

rna分离提取步骤:

1．匀浆

a. 组织每50-100mg组织加入1ml的trizol 试剂后用匀浆机或玻璃棒匀浆。样品的

体积不要超过匀浆使用的trizol 试剂体积的1/10。

b. 单层培养细胞在一个直径3.5cm的培养皿中加入1mltrizol 试剂来溶解细胞，用

移液器反复吸打细胞溶液。加入的trizol 试剂的量取决于培养皿的表面积（每10cm2加入

1ml）而不是取决于细胞的数目。如果trizol 试剂的量不足，提取的rna中会混有dna。

c. 悬液中培养细胞离心沉淀细胞，吸取细胞，反复吹打使溶解于trizol 试剂中。每

5～10×106个动物，植物或酵母细胞，每1×107个细菌细胞加入1ml trizol 试剂。应该避

免在加入trizol 试剂前洗细胞，因为会增加mrna的变性。破坏某些酵母或细菌细胞需要使

用匀浆机。

2．选择采用的步骤：对于含有大量蛋白质，脂肪，多糖或其他细胞外物质的样品如

肌肉，脂肪，植物的块茎等可能需要再加上一个步骤。匀浆后，2℃～8℃条件下12，000×g

离心10分钟去除不溶物质。沉淀中包含有细胞外膜，多糖，大分子量dna，rna在上清中。

来源于脂肪组织的样品，最上层是脂肪层应该弃去。在每一种情况下，将纯净后的匀浆溶液

放在一新管里，加入氯仿即可以有如后面所描述的分层。

3．有机相与无机相的分开将匀浆后的样品在15℃～30℃孵育5分钟使核酸蛋白质混

合物分裂彻底。每1mltrizol 试剂加入0.2ml氯仿。小心盖上离心管盖，用手剧烈振摇15

秒，15℃～30℃孵育2～3分钟。2℃～8℃条件下，以低于12，000×g离心15分钟。样品分

成几层，

最下层红色的酚-氯仿层，中间层及无色的上层水相。rna均在水相中。水相的体积约是

用于匀浆的trizol 试剂体积的60%。

4． rna沉淀将水相转移至一个新试管中，如果需要提取dna或蛋白质可以保存有机

相。用异丙醇从水相中沉淀rna。匀浆时每使用1ml的trizol的试剂加入0.5ml异丙醇沉淀

rna。样品在15℃～30℃孵育10分钟后，2℃～8℃条件下，以低于12，000×g离心10分钟。

离心后rna沉淀通常即可见到，在管底或管壁上形成了胶样的小团块。

5． rna洗涤弃去上清，用75%乙醇洗涤rna沉淀一次，匀浆时每使用1ml的trizol

试剂至少加入1ml75%乙醇。涡旋混匀样品，2℃～8℃条件下，以低于7，500×g离心5分钟。

6． rna的再溶解在步骤最后，暂短干燥rna沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟），

不要在真空下离心干燥rna。很重要的一点是，不要让rna团块完全干燥，因为这会大大降

低其溶解性。不完全溶解的rna a260/280＜1.6。用无rna酶水或0.5%sds溶液溶解rna，可

以用吸头反复吹打，55℃～60℃孵育10分钟（当rna用于酶学反应时不用sds）。rna也可用

100%formamide（去离子）溶解储存于-70℃。

dna提取步骤

在水相被完全吸取后，正如在rna分离步骤中所述一样，最初离心后在中间相和酚相中

的dna可以被提取。在沉淀及洗涤后，dna溶于8mm naoh。trizol试剂可以用于从组织及培

养细胞中分离dna并分析样品中dna含量的实验，同时，提取基因组 dna可以用于northern

分析的标化，这是因为可以用每个基因组dna替代更容易变化的总rna或组织重量。（根据来

源不同，在下一步反应前有些获得的dna沉淀可能需要进一步纯化。

需要但未提供的试剂

1．乙醇2．溶于10%乙醇中的0.1m柠檬酸钠3． 75%乙醇4． 8mm naoh 步骤：1． dna沉淀弃去在中间相上残存的水相，用乙醇沉淀中间相和水相中的dna。

匀浆时每使用1ml的trizol试剂加入0.3ml100%乙醇，颠倒混匀样品。将样品在15℃～30℃

放置2-3分钟后，2℃～8℃条件下，以低于2，000×g离心5分钟沉淀dna。（小心弃去水相

对提取的dna的质量十分关键）

2． dna洗涤弃去酚-乙醇组成的有机相上清，如果需要，则保留此上清用于提取蛋白

质。用溶于10%乙醇的0.1m柠檬酸钠溶液洗涤dna沉淀两次。匀浆时每使用1ml的trizol

试剂，加入1ml上述溶液。每次洗涤时，使dna沉淀在洗涤溶液中室温（15℃～30℃）30分

钟（隔一段时间混匀一次），2℃～8℃条件下，2，000×g离心5分钟。洗涤两次后，将dna

团块置于75%乙醇（每1ml的trizol试剂加入1.5-2ml75%乙醇）室温放置10-20分钟（隔一

段时间混匀一次）之后，2℃～8℃下，2，000×g离心5分钟。（如果dna团块很大，含有＞

200μg dna或大量非dna组成，可以多用溶于10%乙醇的0.1m柠檬酸钠溶液洗涤一次）

3． dna的再溶解打开管盖，空气中干燥dna 5-10分钟（不要离心条件下干燥，否则

极难溶解）。将dna溶于8mmnaoh中，dna浓度为0.2-0.3μg/μl。例如，对从107细胞或

50-70mg组织中提取的dna加入300-600μl的8mmnaoh溶解。由于提取的dna在水或tris

缓冲液中溶解不好，所以需要将其溶于弱碱溶液中。8mmnaoh的ph值约为9，dna一旦溶于

其中其ph值很容易用te或hepes来校准。这一步中，dna沉淀（尤其来源于组织的dna）可

能带有不溶性的胶状物（碎片或细胞膜等）。大于12，000×g离心10分钟去除不溶物。将含

有dna的上清液移至一个新管中。溶于8mmnaoh的dna在4℃可以稳定保存几个月，在-20℃

可以保存一年以上，在-70℃则可以长期保存。

dna的产量

取出一定量溶解在8mmnaoh的dna，用水稀释混匀后测定上述溶液的a260值。用双链dna