(完整word版)免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光实验步骤大全
免疫荧光实验步骤大全免疫荧光实验是一种常见的实验技术，用于检测特定抗原和抗体的相互作用。
本文将介绍免疫荧光实验的详细步骤，以供参考。
实验材料准备：- 试验样本（包括细胞或组织）- 抗原或抗体- 包含荧光素的二抗- PBS缓冲液- 荧光显微镜- 封片胶实验步骤：1. 样本制备- 如果是细胞样本，在培养皿中培养并观察细胞的形态和生长状态。
- 如果是组织样本，将组织切片并进行固定，然后反复用PBS缓冲液进行洗涤。
2. 抗原或抗体的固定- 将样本固定在载玻片上，可以使用正硫酸盐和乙醇来进行固定。
- 固定后用PBS缓冲液进行洗涤，以去除多余的固定试剂。
3. 孵育抗原或抗体- 在固定后的样本上加入适量的抗原、抗体或荧光素标记的二抗。
- 在室温下或4摄氏度下孵育一定的时间，以实现抗原和抗体的特异结合。
4. 洗涤- 使用PBS缓冲液洗涤固定后的样本，可多次洗涤以去除非特异性结合。
5. 荧光显微镜观察- 将载玻片放置在荧光显微镜上，调整荧光滤镜组合以观察荧光信号。
- 使用合适的放大倍率观察细胞或组织中特定的抗原或抗体信号。
6. 影像采集与分析- 使用相机或图像采集系统记录荧光显微镜观察到的图像。
- 使用图像分析软件对图像进行处理和分析，如测量荧光强度、定量特定抗原或抗体的表达水平等。
7. 结果和讨论- 分析实验结果，比较不同样本之间的差异。
- 讨论实验结果与研究假设的一致性，并可进行进一步的实验验证。
8. 结论- 总结实验结果，并得出相应的结论。
- 可以进一步讨论实验结果在相关领域的应用和意义。
9. 实验清理- 定期清洗和消毒实验室工作区域和仪器设备，以确保实验环境的卫生和安全。
以上是免疫荧光实验的基本步骤，每一步都需要仔细操作和控制实验条件。
在实验过程中，要注意遵守实验室安全操作规范，确保自己和他人的安全。
希望本文对您的科研工作有所帮助！。
免疫荧光法(免疫细胞化学)
免疫荧光法(免疫细胞化学)免疫荧光法（免疫细胞化学）免疫荧光法，也称为免疫细胞化学，是一种用于检测和定位特定分子在细胞或组织中的分布的技术。
该方法利用荧光标记的抗体与目标分子结合，通过显微镜观察荧光信号的发射来确定其位置。
本文将介绍免疫荧光法的基本原理，实验步骤和应用领域。
一、基本原理免疫荧光法依赖于抗原与抗体的特异性结合。
在免疫细胞化学中，荧光标记的抗体与靶分子结合后，可以通过激发荧光，从而使得靶分子在细胞或组织中可见。
这种荧光标记可以通过直接结合或间接结合实现。
直接结合法是将荧光染料直接与抗体结合，制备成荧光标记的抗体。
这种方法操作简单，适合用于单一标记物的检测，但可能导致染色反应无法控制甚至给靶分子造成损伤。
间接结合法则是利用第二抗体与一抗体结合，然后再将第二抗体与荧光标记结合。
这种方法可以使用多个不同的抗体，并能将多个目标同时检测，具有高度特异性和灵敏度。
但是，操作过程相对繁琐，需要较长时间。
二、实验步骤1. 样本制备：取得所需检测的细胞或组织样本，处理好固定和预处理的步骤。
例如，细胞需经过固定、渗透、洗涤等操作，组织则需进行切片和脱水等步骤。
预处理的目的是为了提高抗体的结合效率和信号强度。
2. 抗体染色：将标记了荧光的一抗体或一抗体与标记物结合的复合物加到预处理好的样本上，充分孵育，以实现抗原和抗体结合。
3. 清洗：将标本进行适当的冲洗，使未结合的抗体、标记物等被去除。
4. 结果观察：将标本放置在荧光显微镜下观察，通过不同波长的光源激发和发射荧光信号。
5. 形态学观察：根据样本的特点、形态学特征及标记染色的荧光信号，判断目标分子的定位和表达情况。
三、应用领域免疫荧光法在生物医学和生命科学领域中得到了广泛应用。
以下是其主要应用领域的一些例子：1. 免疫细胞凝集试验：用于检测抗原与抗体间的反应，如血型鉴定等。
2. 免疫组织化学：通过检测和定位特定分子在组织中的分布，来研究疾病的发生和发展机制，如肿瘤标记物的检测等。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法（1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡（2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min（4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。
（6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。
（11）次日取出切片，室温下复温 30min。
（12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。
（13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。
（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。
（15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
（18）使用荧光显微镜进行观察拍照。
贴壁细胞免疫荧光法（1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min（2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min（3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min（5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
（6）1%BSA室温封闭30min（7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。
免疫荧光 标准方法
免疫荧光标准方法一、样品制备1. 选取适当的组织样品，用冷丙酮固定，并保存在-80°C。
2. 将样品切成5μm厚的切片，放置在载玻片上。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用3%的H2O2在室温下处理切片10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用0.1%的Triton X-100在室温下处理切片10分钟，以增加细胞膜的通透性。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
二、免疫荧光染色1. 用5%的牛血清白蛋白(BSA)封闭切片，室温下放置30分钟。
2. 取出切片，用特异性一抗溶液封闭切片，4°C孵育过夜。
3. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
4. 用荧光二抗溶液封闭切片，室温下孵育1小时。
5. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
6. 用DAPI染色液染色核，室温下孵育5分钟。
7. 用PBS漂洗切片，5分钟/次，共三次。
8. 用抗荧光淬灭封片液封片，避免强光照射。
三、观察和记录1. 用荧光显微镜观察切片，记录荧光信号的位置、强度和分布情况。
2. 对每个样本至少观察三个不同的视野，并记录数据。
四、结果分析1. 根据荧光信号的位置、强度和分布情况进行分析。
2. 可使用图像分析软件进行定量分析。
3. 根据分析结果进行数据处理和统计。
五、标准化1. 采用阳性对照和阴性对照作为内标。
2. 阳性对照应呈现强烈的荧光信号，阴性对照应无荧光信号。
3. 对所有样本进行标准化处理，以保证结果的可靠性。
六、质量控制1. 实验过程中应避免交叉污染和样品间的干扰。
2. 对实验数据进行及时记录和分析，确保数据的准确性和完整性。
免疫荧光测试项目
免疫荧光检查可分直接法、间接法、夹心法和补体法。
1. 直接法将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待检标本片上，10分钟后弃去，使标本保持一定湿度。
（2）滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30分钟）。
（3）取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序经过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3～5 分钟，不时振荡。
（4）取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。
（5）立即用荧光显微镜观察。
观察标本的特异性荧光强度来判断免疫复合物的多少，常用半定量法，（-）阴性，无荧光；（±）高倍镜下似乎可见；（+）低倍镜下似乎可见，高倍镜下明显可见；（++）低倍镜下明显可见，高倍镜下清晰可见；（+++）低倍镜下清晰可见，高倍镜下耀眼；（++++）低倍镜下耀眼，高倍镜下刺眼。
2. 间接法如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原—抗体—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。
如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。
（1）滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于已知抗原标本片，10分钟后弃去，使标本片保持一定湿度。
（2）滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS适当稀释的待检抗体标本，覆盖已知抗原标本片。
将玻片置于有盖搪瓷盒内，37℃保温30分钟。
（3）取出玻片，置于玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序过0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5分钟，不时振荡。
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术的分类
免疫荧光技术是一种广泛应用于生物医学和生命科学领域中的分析技术。
根据不同的用途和操作方法，免疫荧光技术可以分为以下几类：
1. 直接免疫荧光法
直接免疫荧光法是一种最简单的免疫荧光技术，通常用于检测单一抗原。
该方法将荧光标记的抗体直接与待检测物接触，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
2. 间接免疫荧光法
间接免疫荧光法是一种常用的免疫荧光技术，可用于检测多个抗原或抗体。
该方法通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，然后使用荧光标记的二级抗体识别和结合一级抗体，形成免疫复合物。
荧光信号可以用显微镜观察或流式细胞术检测。
3. 间接免疫荧光染色法
间接免疫荧光染色法是一种特定的间接免疫荧光技术，通过将未标记的一级抗体与待检测物接触，再使用被标记的一级抗体结合一级抗体，形成免疫复合物。
该方法可以用于检测多个抗原或抗体，并且适用于细胞和组织的检测。
4. 光度法免疫荧光
光度法免疫荧光是一种快速、准确的免疫荧光技术，用于检测微量物质，如细菌和病毒。
该方法通过对待测样品进行化学反应，形成荧光物质，然后测量荧光信号强度。
5. 免疫电子显微镜法
免疫电子显微镜法是一种高分辨率的免疫荧光技术，用于检测细胞和分子水平上的抗原或抗体。
该方法使用标记有金颗粒的抗体，进行免疫染色，然后使用电子显微镜观察荧光信号。
总之，免疫荧光技术是一种多功能的生物分析技术，可用于各种生命科学领域，其中不同的分类方法可以根据需要进行选择。
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术原理与步骤
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。
它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。
该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。
主要用于检测细胞内物质的定性、定位、定量及动态变化。
免疫荧光技术的基本原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来检测目标分子。
具体步骤如下：
1. 制备样本：将要检测的样本制备成适当的形式，如细胞涂片、组织切片等。
2. 固定样本：使用适当的固定剂将样本固定，以保持其形态和结构。
3. 抗原修复：对于某些样本，需要进行抗原修复以暴露抗原表位，使抗体能够更好地结合。
4. 封闭：使用适当的封闭液封闭样本表面的非特异性结合位点，以减少背景噪音。
5. 加一抗：将特异性的一抗加入样本中，使其与目标抗原结合。
6. 洗涤：洗涤样本以去除未结合的一抗。
7. 加二抗：将荧光标记的二抗加入样本中，使其与一抗结合。
8. 洗涤：再次洗涤样本以去除未结合的二抗。
9. 荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察样本，在合适的激发波长下，荧光标记的二抗将显示出荧光信号，从而指示目标抗原的存在和定位。
免疫荧光技术可以应用于多种领域，如细胞生物学、免疫学、遗传学等。
它不仅可以用于检测蛋白质、核酸等生物大分子，还可以用于检测细胞表面标志物、细胞内细胞器等。
需要注意的是，免疫荧光技术的结果解读需要结合荧光显微镜的成像特点和抗体的特异性等因素进行综合分析。
同时，在实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可靠性。
免疫荧光技术
多激光器系统（多通道激光检测）：
在可见光范围内使用 多谱线氩离子激光器，发射波长为457nm、488nm和514nm的蓝绿光， 氦氖绿HeNe（G）激光器提供发射波长为543nm的绿光， 氦氖红HeNe（R）激光器发射波长为633nm的红光， 新的405nm的半导体激光器的出现可以提供近紫外谱线。
时效性：标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯 塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发；
使用的玻片等载体，都必须厚度均匀，无明显的自发荧光，如果使用油镜，还必须 保证镜油为无荧光镜油；
电源最好装稳压器，否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命，也会影响镜检的效果。
免疫荧光技术常见问题
镧系 镧系螯合物某些3价稀土镧系元素如铕（Eu3）、铽（Tb3）、铈（Ce3）等的螯合物经激 发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应用最广。Eu3螯合物的激发光波长范围宽，发 射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。
藻红蛋白（P-phycoerythrin，PE） PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，最 大吸收峰为564 nm，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激 光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐 使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。
可选择性地嵌入核酸（DNA、RNA）的双螺旋碱基对中。在对DNA染色时，需 用RNase对细胞进行处理，以排除RNA对DNA荧光定量精度的影响。在488nm 波长激发下，PI的发射光谱为610-620nm。 FL2探测器检测PI。
细胞爬片免疫荧光实验流程
免疫荧光染色实验步骤
免疫荧光染色实验步骤1.细胞处理：将需要进行染色的细胞培养于培养皿中，通常使用生理盐水或PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，以去除培养基或其它细胞残留物。
2.固定：使用适当的固定剂，如甲醛或乙醛，固定住细胞。
通常在室温下固定细胞10-30分钟，然后用PBS洗涤。
3.渗透化处理：为了增强抗原与抗体的结合，需要使用渗透化剂如BSA（牛血清白蛋白）或胎牛血清等，封闭其它非特异结合位点。
浓度通常为1-5%的BSA，可以根据实验需要调整。
4.预处理：通过预处理，可以增强抗原的可见性。
预处理方法包括煮沸、酶解或蛋白酶处理等。
具体方法应根据需要选择。
5.抗原特异性溶液：将具有特异性的抗体溶液加入到含有细胞的培养皿中，使其与抗原结合。
抗体通常与标记物如荧光染料共价结合，使得标记的抗原能够被荧光显微镜观察。
6.清洗：将细胞用PBS洗涤，以去除未与抗体结合的游离抗体。
7.荧光显微镜观察：使用荧光显微镜观察染色后细胞中的抗原。
荧光显微镜具有特殊的光学透镜和滤光片，可以选择和激发不同荧光染料的发光。
根据需要，可以选择合适的滤光片来检测多个染色的细胞。
8.影像分析：通过图像处理软件对荧光显微镜下观察到的细胞图像进行分析和量化。
常见的分析内容包括抗原的位置、表达强度和相对数量等。
9.结果解读：根据荧光染色的结果来解读细胞中其中一抗原的表达情况。
可以通过比较实验组和对照组的亮度或表达分子的定量来确定差异。
补充说明：2.正、阴对照：在进行抗原染色前，应设置正、阴对照实验。
正对照是指使用已知表达目标抗原的样本，而阴对照是指使用未表达目标抗原的样本。
通过对照实验可以判断染色结果是否可靠。
3.染色条件优化：染色条件如温度、时间、抗体的浓度等都可能影响染色效果。
因此，需要对染色条件进行优化，以确保得到准确的结果。
4.扩展检测：除了直接染色，还可以使用间接染色方法来增强信号。
通过使用辅助抗体，可以将多个标记物同时进行检测，提供更多的信息。
总结起来，免疫荧光染色实验步骤是：细胞处理→固定→渗透化处理→预处理→抗原特异性溶液→清洗→荧光显微镜观察→影像分析→结果解读。
免疫荧光技术
免疫荧光技术
1. 常规做法：
1.从-20或-70℃冰箱中取出切片，回温（室温放置直至切片上无水汽），在切片的四周涂上指甲油，晾干。
2.洗片：0.1M PBS洗2次，每次5min。
3.穿透：0.1%或0.1%TritonX-100，0.1M PBS 洗30min。
4.封闭：10%胎牛血清,0.1%TritonX-100,0.1M PBS封闭液，室温封闭1-2小时
5.抗体稀释液稀释一抗，用量视切片的大小而定，每张切片50-200µl，抗体充分搅匀后，加在切片（放在湿盒上）上，4℃16-24小时。
6.将湿盒从冰箱中拿出，切片放入装有0.1 M PBS的盒子中洗6次，每次10min，换液时注意勿对着切片冲。
7.用抗体稀释液稀释荧光第二抗体。
抗体稀释后需充分混匀，用吸水纸吸干指甲油及其外周的水，将荧光第二抗体加入，室温孵育2~6小时。
此整个荧光抗体稀释和加的过程中注意避光！
8.将湿盒从温箱中取出，切片放入装有0.1 M PBS的盒子中洗6次，每次5min，换液时注意勿对着切片冲。
其中第三次可洗DAPI(1：1000)衬染细胞核。
9.甘油封片剂封片
10.切片可当时观察，或放在4℃冰箱中保存。
注意：1.免疫荧光技术的整个过程不能干片。
2.二抗的过程均需要避光操作。
免疫荧光实验技术
595～600nm（橙 FITC的衬比染色或双
红色）
标记FAT
四甲基异硫氰酸罗 丹明 (TRITC) 藻红蛋白（PE）
Eu3+螯合物
550nm 490-560nm 340nm
620nm（橙红色） FITC的衬比染色或双 标记FAT
575nm（红色） 双标记FAT、流式细 胞术
613nm
时间分辨荧光免疫测 定
免疫荧光技术实验 封闭，抗体孵育
封闭：目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常 用的封闭剂为 BSA, （PBS pH 7.5）,其他可选择的封 闭剂还有 1% 凝胶 gelatin, 1% bovine 或与二抗种 属相同的血清（3-10%）等。室温和4℃均可以。
抗体孵育：直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧 光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育 的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防 止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
免疫荧光技术简介:荧光
发射光谱是指固定激发波长，在不同波长下记录的样品发射荧光的强 度。
激发光谱是指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品记录 的相应的荧光发射强度。
荧光寿命：荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的 时间。
荧光淬灭：荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退 称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（≥20℃）、苯胺、酚、硝基苯、 I-等 。
荧光显微镜
Chance Favors Only the Prepared Mind.
免疫荧光技术简介:抗体
抗体（Antibody）：抗体指机体的免疫系统在抗原刺 激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞 所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分 泌液中。
免疫荧光实验步骤大全(精华版)
免疫荧光实验步骤大全(精华版)免疫荧光染色大全（精华版）组织免疫荧光法1.将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1小时，脱蜡。
2.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
3.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
4.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
注意：步骤3和4用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原可以直接跳过这一步骤。
5.进行抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3分钟，后转成低火15分钟。
6.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
7.在室温下，使用3% H2O2孵育30分钟，目的是灭活内源性过氧化物酶。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
9.使用1% BSA进行室温封闭30分钟，用于封闭非特异性抗原表位。
10.按照抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4℃湿盒中静置过夜。
11.次日取出切片，室温下复温30分钟。
12.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
13.选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37℃避光孵育30分钟。
14.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
15.在避光条件下，使用DAPI染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用。
16.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
17.在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。
18.使用荧光显微镜进行观察和拍照。
贴壁细胞免疫荧光法1.在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3分钟。
2.使用4%多聚甲醛固定细胞爬片15分钟。
3.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
4.在室温下，使用0.5% Triton X-100（PBS配制）通透10分钟。
5.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
6.使用1% BSA室温封闭30分钟。
7.弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜。
8.用1×PBS洗涤3次，每次5分钟。
免疫荧光技术完整版本
3 荧光抗体的鉴定：
4 ⑴ 抗体含量测定：双扩法
5
6 ⑵ 结合比率(F/P)测定：
7
分光光度法，并按下式计算：
8
FITC:
0.35×A495)
F/P=2.87×A495/(A280-
9
A280
RB和TRITC:
F/P= A515 /
10 *
F/P值高则抗体分子结合的荧光素
多。
11 *
固定标本染精品课色件 以F/P=1.5左右为宜
镜判 定结果的检测方法。
⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测
定 荧光强度而精推品课算件 被测物浓度的检测
3 荧光的产生：
4
物质吸收外界能量而进入
激发状态，在回复基态时多余的能量以电
磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为
荧光。
5
这种物质，称为荧光素
6
致荧光
由光激发所引起的荧光，为光
7
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用 活细胞染色）。
精品课件
⑵ 常用的固定方法：
抗原 固定方法
固定剂
蛋白质 或4℃30min
95%乙醇
室温3~10min
Ig类 同上
甲醇
酶类 同上
丙酮
激素
CCl4
同上
类脂质
10%福尔马林
室温3~10min
多糖(细菌) 4℃30min
10%福尔马林
室温3~10min或
精品课件丙酮、甲醇
㈡试验类型 1 直接法 2 间接法 3 补体结合法 4 双标记法
精品课件
抗原
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验步骤+经验总结
免疫荧光实验是一种用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的位置和表达水平的常用技术。
下面我将从步骤和经验总结两个方面来回答你的问题。
免疫荧光实验步骤：
1. 样本制备，首先，收集细胞或组织样本，然后进行固定和切片处理，以确保样本的完整性和稳定性。
2. 抗原修饰，样本经过透化处理后，使用适当的抗原修饰方法，如热处理或酶解，以增强抗体的结合效率。
3. 抗体孵育，将样本与特异性的一抗（一般为多克隆抗体）孵育，使其与目标蛋白结合。
4. 荧光二抗孵育，将荧光标记的二抗孵育，使其与一抗结合形成复合物。
5. 染色与显微镜观察，样本经过洗涤后，使用荧光显微镜观
察，检测目标蛋白在细胞或组织中的分布和表达水平。
免疫荧光实验经验总结：
1. 选择适当的抗体，选择具有高亲和力和特异性的抗体至关重要，可以通过文献综述或试验验证来确定抗体的适用性。
2. 优化实验条件，包括抗原修饰、抗体浓度、孵育时间等实验条件的优化，以确保信号强度和特异性。
3. 合理的阳性和阴性对照，使用已知表达目标蛋白的阳性对照和不表达目标蛋白的阴性对照，以确保实验结果的准确性和可靠性。
4. 注意样本处理，样本处理的温和和一致性对实验结果至关重要，避免因处理不当导致假阳性或假阴性结果。
5. 数据分析和图像获取，在实验结束后，对荧光图像进行合理的获取和分析，避免图像处理过度或不足，确保结果的客观和准确。
以上是免疫荧光实验的步骤和经验总结，希望能够对你有所帮助。
如果还有其他问题，欢迎继续提问。
免疫荧光的操作方法
免疫荧光的操作方法
免疫荧光是在细胞或组织中，利用特殊成分将蛋白质抗体与荧光染料结合在一起，产生荧光标记，用来可视化受体的技术。
以下是免疫荧光的一般操作方法：
1. 样品的制备：在进行免疫荧光前，需要对样品进行制备，包括固定、包埋、切片等。
2. 抗体标记：选用特异性抗体，并将它们标记成与荧光染料等可视化试剂结合的格式，如荧光分子、酶、金粒子等。
3. 样品的处理：在进行免疫荧光实验时，需要将样品进行特定的处理，如孵育在抗体或底物中。
4. 光学显微镜：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜等可视化技术，观察标记物的分布和数量。
5. 数据分析：使用特定的软件分析图像，帮助确定荧光强度、荧光标记的数量等。
总之，免疫荧光是一项十分繁琐的技术，在实验中需要严格控制各个步骤，才能获得可靠的实验结果。
免疫荧光技术实验步骤及方法
免疫荧光技术实验步骤及方法免疫荧光是标记免疫技术发展最早的一种，它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，通过将抗体与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。
10个关键点免疫荧光步骤包括，细胞固定和通透，封闭，孵育一抗，二抗等。
除了这些基本步骤，以下建议可以帮助您获得更好的实验结果。
1、选择合适的细胞种板密度细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。
2、细胞固定和通透为达到最佳的检测效果，细胞需要经过固定和通透。
这些步骤非常关键，细胞和抗原需要保证最佳的结构，并利于抗体与抗原结合。
现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。
之后用0.1%皂角苷或0.02%的Triton X-100进行通透。
前者是比较温柔的处理，但是对于核内抗原可能无效，需要用到Triton。
使用皂角苷进行通透时，要注意它会引起细胞膜的可逆性通透，也就是除了在通透初期，在每个抗体孵育环节都需要进行通透。
另外，细胞可以用冰甲醇进行同时固定和通透，可以避免去垢剂的使用。
3、抗体特异性免疫荧光需要用到特异性非常强的抗体，可以避免高背景和不理想的蛋白定位结果。
在大多数情况下，纯化抗体的效果很好，但是正确的对照可以帮助精准定位抗原。
使用只有二抗染色的片子作为阴性对照，有利于减少降低背景干扰。
4、合适的抗体稀释比例通过优化抗体稀释比例来优化染色，通常情况下1ug/ml的纯化抗体或者1:100-1:1000的抗血清足够达到特异性染色的结果。
但在能保证低背景染色的前提下，可以通过增加浓度来提高信号强度。
如果是第一次使用该抗体或测定某抗原，强烈建议浓度梯度实验。
5、优化缓冲液和封闭剂尽管很多抗原在常见的Buffer如PBS中可以很好的被染色，但是对于某些目的抗原，更换一下含有不同离子的缓冲液，比如钙、镁、钾等，可以带来很大程度上的改善。
免疫荧光实验原理及其步骤
免疫荧光实验原理及其步骤免疫荧光实验是一种常用的生物学实验技术，用于检测和定位细胞或组织中特定的抗原或抗体。
其原理是利用荧光染料与抗原或抗体结合形成复合物，然后通过荧光显微镜观察荧光信号的强度和位置，从而确定目标物的存在和分布情况。
下面将详细介绍免疫荧光实验的步骤及其原理。
免疫荧光实验的步骤一般分为样品处理、抗体处理、荧光染色和观察四个主要步骤。
第一步是样品处理。
首先需要选择合适的样品，可以是细胞培养物、组织切片或动物体内的器官等。
样品处理的目的是使样品适应实验条件并提取目标物，一般包括固定、脱水和透明化等步骤。
固定可以采用乙醛或甲醛等化学物质，使细胞或组织保持形态结构。
脱水和透明化则是为了去除样品中的水分，并使其透明以便于观察。
第二步是抗体处理。
根据实验的需要，可以选择针对目标物的一抗或二抗进行处理。
一抗是指对目标物抗原的特异性抗体，二抗是指对一抗特异性结合的抗体。
抗体处理的目的是使抗体与目标物结合形成复合物，一般需要在适当的温度和时间下进行孵育。
在进行抗体处理之前，需要对样品进行预处理，如孵育样品以降低非特异性结合等。
第三步是荧光染色。
荧光染色是利用荧光染料标记抗体，以便于荧光显微镜观察。
常用的荧光染料有荧光素（fluorescein）和罗丹明（rhodamine）等。
荧光染色的原理是荧光染料与抗体结合后发射荧光信号，通过荧光显微镜可以观察到目标物的荧光信号。
荧光染色的过程包括将荧光染料溶液加入样品中，与抗体发生特异性结合，并进行洗涤以去除未结合的荧光染料。
最后一步是观察。
观察是通过荧光显微镜观察样品中的荧光信号，从而确定目标物的存在和分布情况。
观察时需要选择适当的荧光滤光片和荧光显微镜参数，以便于观察到荧光信号的强度和位置。
观察结果可以通过摄影或记录视频等方式保存下来，以便进一步分析和研究。
免疫荧光实验的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，可以是细菌、病毒、细胞表面的蛋白质等。
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免疫荧光技术的实验方法及其分类
一、免疫标记法及其分类
1.荧光免疫法
原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。
底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。
结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。
该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。
除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。
洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。
最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。
然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。
但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。
近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。
3.酶联免疫法(ELISA)
ELISA法有竞争法和夹心法两种。
竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。
夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。
ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。
但不适合急诊的快速检测。
以双抗法为例。
首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原—抗体复合物。
接着加入酶标二抗，形成抗原—抗体—抗体复合物。
最后加入底物，由酶催化底物生成产物。
通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。
4.偶联生物素—亲和素系统的酶免法
利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
5.时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA)是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。
6.解离增强镧系元素荧光免疫分析
解离增强镧系元素荧光免疫分析(Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是时间分辨荧光免疫分析中的一种。
它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。
由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3 从复合物上解离下来，自由Eu3 同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。
因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。
二、荧光抗体染色方法及其分类
1.直接染色法
将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结合物而发出的荧光。
直接染色法的优点是：特异性高，操作简便，比较快速。
缺点是：一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差。
直接法应设阴、阳性标本对照，抑制试验对照。
2.间接染色法
如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体(第一抗体)与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体(第二抗体)与抗原标本反应，如果第一步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，再洗去未反应的标记抗抗体，在荧光显微镜下可见荧光。
在间接染色法中，第一步使用的未用荧光素标记的抗体起着双重作用，对抗原来说起抗体的作用，对第二步的抗抗体又起抗原作用。
如果检查未知抗体则抗原标本为已知的待检血清为第一抗体，基他步骤和检查抗原相同。
由于免疫球蛋白有种属特异性，因此标记的抗球蛋白抗体必须用第一抗体同种的动物血清球蛋白免疫其他动物来制备。
间接染色法的优点是既能检查未知抗原，也能检查求知抗体;用一种标记的抗球蛋白抗体，能与在种属上相同的所有动物的抗体结合，检查各种未知抗原或抗体，敏感性高。
缺点是：由于参加反应的因素较多，受干扰的可能性也较大，判定结果有时较难，操作繁琐，对照较多，时间长。
间接法应设阴、阳性标本对照，还应设有中间层
对照(即中间层加阴性血清代替阳性血清)。
3.抗补体染色法
抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由Goldwasser等建立。
本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体(待检血清)。
染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。
如果第一步中抗原抗体发生反应，形成复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便与补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。
抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。
因为补体的作用没有特异性，它可以与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。
它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。
除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法、三层法、抗体-抗补体法等等。
此文章由广州深华生物技术有限公司编辑修改。