应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量
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双缩脲法与考马斯亮蓝法测定母乳总蛋白的应用比较宋景秋 王以立 (南京鼓楼医院检验科,南京 210008)关键词 双缩脲 考马斯亮蓝 消化定氮 母乳 总蛋白母乳喂养已被广泛认同,其中蛋白质是主要营养成份,因此母乳总蛋白的测定显得非常重要。
母乳中乳糖浓度较高,实验发现乳糖对双缩脲法干扰较大,而考马斯亮蓝法不受其干扰。
结果报告如下。
1 材料和方法111 UN ISON B I O T ECH公司提供。
双缩脲试剂为Sclavo试剂。
112 标本的制备 新鲜采集母乳标本约5 m l,以4000×g,离心15分钟去脂,-20℃保存备用〔1〕。
113 考马斯亮蓝法以人血清蛋白标准作标准曲线,标本去脂后用生理盐水50倍稀释,按试剂盒要求操作,用B I O2RAD550酶标仪读取结果。
114 双缩脲法用M ERCK M A GA自动生化仪。
115 微量消化定氮法按文献〔2〕,试剂自配。
2 实验与结果211 三种方法测定50例去脂母乳总蛋白结果(xθ±2s g L)并以微量消化定氮法为准作t检验:微量消化定氮法1114±118;双缩脲法1918±213,t=211232,P<0105;考马斯亮蓝法916±213,t=210384,P<0105。
双缩脲法明显结果偏高,考马斯亮蓝法与微量消化定氮法结果接近。
212 乳糖干扰实验 10例标本,每例标本均分别加入01175、0135及015g L乳糖,分别用考马斯亮蓝法和双缩脲法测定均值,前者结果为910、911、910、819(g L),基本呈一条横线,后者则随乳糖加入量增多而升高,结果分别为1810、2110、2410、2610 (g L)。
213 用考马斯亮蓝法测定母乳蛋白浓度为713g L及1118g L的标本,每份重复测定10次,其CV值分别为217%及313%。
3 讨论311 通过实验发现,考马斯亮蓝法和双缩脲法与微量消化定氮法相比均有显著性差异,双缩脲法结果偏高73%左右,其原因可能:一是微量消化定氮法结果未减去非蛋白氮含量;二是乳糖作为一种还原剂可使碱性铜还原为一价的铜化合物,其颜色与双缩脲法测定蛋白生成的紫色复合物相近而干扰双缩脲反应〔3〕。
蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)
三、主要仪器：
（1）分析天平、台式天平 （2）具塞刻度试管 （3）吸管 （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心机、离心管 （7）容量瓶 （8）微量取样器 （9）分光光度计
四、试剂：
（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并 定容至100ml，制成 100 μg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－ 250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最 后用蒸馏水定容到 1000ml。
（1）准确称取约200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏 水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上 清液，定容至刻度。 （2）另取2支具塞试管，准确加入0.5 ml样品提取液，再加入0.5 ml蒸 馏水，4ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲 线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
剂法（Lowry法）
2．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混
合？（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测
定时，结果会有较大偏差，使ห้องสมุดไป่ตู้准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。）
3．如何正确使用分光光度计？
八、实验报告：按常规。
分光光度计的使用与注意事项
1. 接好电源线。 2. 启动电源开关，仪器显示“F7230”，预热20分钟（要打开比 色皿盒盖）。 3.（1）设置年、月、日、时、分： 按“CLEAR”键，仪器显示“YEA”进入年份设置，按数字键，输入
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量专业班级：制药工程3班小组成员：李梦娴李敏林晓丝一、实验目的1、了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作步骤二、实验原理1、根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G-250是比色法和色素法相结合的复合方法。
考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈棕红色，当和蛋白质结合后呈青蓝色。
在一定范围内，也就是蛋白质含量在0~1000ug范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度和蛋白质含量成正比，所以可用比色法测定。
2、考马斯亮蓝G-250法有常量法和微量法两种。
三、仪器和试剂1、仪器：分析天平；铁架台；大漏斗；洗瓶；烧杯100m l×2、50m l×1；吸管10ml×2、5ml×1；胶头滴管；移液枪；离心管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml×3；洗耳球×2；玻璃棒；记号笔。
2、试剂：（1）蒸馏水。
（2）标准蛋白质溶液：用移液枪吸取1ml浓度为1mg/ml标准蛋白质溶液，溶于蒸馏水并定容至10ml，制成0.1mg/ml的原液。
（3）考马斯亮蓝G-250(0.01%)染液:称取0.01g考马斯亮蓝G-250,溶于5ml 90%乙醇中，加入85%（m/v)的磷酸10ml,最后用蒸馏水定容至100ml（此溶液不宜久存，在常温中可放置1~2个月）；将定容好的染液过滤并装入棕色瓶中保存。
（4）样品液：用移液枪取1ml纯牛奶液体（经调查，市场上大部分纯牛奶中蛋白质的含量大致为每100ml中2.5~3.5g），用蒸馏水稍做稀释，然后转移至一号100ml的容量瓶中并定容至100ml;用10ml的吸量管吸取10ml一号容量瓶中的液体于二号100ml的容量瓶中，最后用蒸馏水定容至100ml，此时二号容量瓶中为待测样品液。
四、操作步骤1、0~100μg/ml标准曲线的制作：取8支离心管，编号后，按下表加入试剂，盖塞后，将各试管中的溶液纵向倒转混匀，室温静止5min后，以管一为空白对照，在595nm 下比色测定。
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。
当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。
（3）0.9% NaCl溶液。
三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。
1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
用上述0号管调零，测出血清的A595值。
【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。
③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。
④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。
考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质
考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马氏亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与595nm的吸光度成正比。
大大提高了测定蛋白质的灵敏度（1ug）【器材与试剂】器材 1.可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3.移液枪 4. 新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等试剂 1. 0.9%生理盐水 2. 考马斯亮蓝试剂 3. 1000µg /ml蛋白质标准液【实验步骤】1. 标准曲线的制作(1) 取试管6支，按下表进行编号并加入试剂。
(2) 另取试管6支，吸取上述各管蛋白质溶液0.1ml，加入3.0ml考马斯亮蓝G250试剂, 充分振荡混合，放置5min后，测定A595值。
(3) 分光光度法的基本原理和分光光度计的使用方法（分组实际操作、讲解）(4) A595为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
2. 样品提取液中蛋白质含量的测定(1)蛋白质提取:称取样品约200mg，加蒸馏水5ml，匀浆，4000rpm离心10min，取上清液。
残渣用2.0ml 蒸馏水悬浮，4000rpm离心10min，合并上清液并定容至10ml。
(2)蛋白质含量测定: 取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡混合，放置5min后，测 A595 值(3) 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋白含量。
3. 结果计算样品蛋白质含量（µg/g鲜重）＝a (µg) × 提取液总体积 (ml) / [测定所取提取液体积（ml）×样品鲜重（g）], a为从标准曲线上查得的蛋白质含量，单位为µg【实验结果与分析】复习思考题、作业题：1. Bradford法测定蛋白质含量的原理是什么？应如何克服不利因素对测定的影响？2．为什么标准蛋白质必须用凯氏定氮法测定纯度？3. 根据蛋白质的呈色反应，测定蛋白质的方法还有哪种？根据所学知识推断各种测定方法有何优点、缺点。
细胞总蛋白提取-考马斯亮蓝测蛋白含量
蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，可以根据实验目前选择最合适的方法，本文主要总结了蛋白抽提的仪器和材料的准备，试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。
蛋白提取方法1 材料和方法1.1 材料1.1.1 组织和细胞的来源：1.1.2 仪器设备机械组织匀浆器低温高速离心机(>40,000 g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1.3 试剂三氯醋酸(TCA)丙酮二硫苏糖醇(DTT)尿素CHAPSPMSFEDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝R350抑肽素A亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。
1.1.4 溶液配制(1) PBS：NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4，溶于800 ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1 L;(2) EDTA 储存液：18.61 g Na2EDTA•2H2O，溶于70 ml纯水中，用10 mol/L NaOH调节pH 值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒)，定容为100 ml。
可高压灭菌后分装备用; (3) 亮肽素储存液(50 μg/ml，100×)10 mg/ml溶于水，-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液，-20℃保存; (4) 抑肽素储存液(70 μg/ml，100×)1 mg/ml溶于甲醇，-75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液，-20℃保存; (5) PMSF储存液(10 mM, 100×):17.4 mg PMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃ 保存。
DTT 储存液(1 M):0.31 g DTT溶于2 ml H2O中，-20℃ 保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。
(7) 裂解液:Lysis buffer A(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer B(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer C40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2OLysis buffer D(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)Lysis buffer E(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)Lysis buffer F100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8,50 mM DTT, 25% v/v glycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量
·１１８生垦生塑型旦芏壁查垫嫂至璺！！鲞蓥２塑鱼垫』ｇｉ世鲥些垫鲎，坠！：１３：№：！应用考马斯亮蓝法测定总蛋白含量李娟张耀庭曾伟罗璇廖长春（长春生物制品研究所，长春１３００６２）【摘要】目的应用考马斯亮蓝法检测总蛋白含量。
方法应用考马斯亮蓝法与凯氏法和ｂｗＩｙ法同时进行不同生物制品的总蛋含量检测。
结果考马斯亮蓝法操作简便，灵敏度高，重复性好．测定蛋白的线性范围为５～２５ｐｇ，ｒ＝０．９９９５，ｎ＝５，平均回收率为ｌ叭．３％。
结论考马斯亮蓝法是检测生物制品总蛋白含量的理想方法。
【关键词】考马斯亮蓝（ｃ耶）总蛋白含量凯氏法Ｌｏｗｒｙ法生物制品总蛋白含量的测定是制品质量控制的重要指标之一，可用以检查有效成分，计算纯度和比活性。
目前常用的方法有凯氏法、酚试剂法（Ｌｏｗｒｙ法）、紫外吸收法等．其中凯氏法繁琐，费时，且不适合微量蛋白含量测定。
Ｌｏｗｒｙ法和紫外吸收法干扰物质较多，不适于硫柳汞做防腐剂的样品和核酸含量较高的样品检测。
为此作者参考有关文献，初步建立了考马斯亮蓝法（简称ＣＢＢ法），并分别与凯氏法、Ｌｏｗｒｙ法测定结果做了比较，现报道如下。
材料与方法１．仪器与试剂１３本岛津ｕｖ一２２０１型分光光度计，瑞士ＦＤｓｓＴＥＣＡＴＯＲ２３００型全自动凯氏定氮仪。
考马斯亮蓝Ｇ２５０（ＣＢＢ）为ＦＬＵＫＡ试剂。
８５％磷酸（ｗ，ｖ）、９５％乙醇为分析纯试剂。
２．考马斯亮蓝染色液的配制准确称取１００ｍｇＣＢＢ，溶于５０ｍｌ９５％乙醇溶液中，与１００ｍｌ８５％磷酸（Ｗ／Ｖ）混合，加水至１０００ｒａｌ。
３．标准蛋白溶液的配制用本所生产的人血白蛋白，采用凯氏定氮法测定蛋白含量，准确稀释成５０ｖｅＣｍｌ的标准蛋白溶液。
４．测定方法取一定体积样品（含蛋白质１５９９左右，蛋白含量较高的样品可适当稀释），补加蒸馏水至０．５ｍｌ，加入３．０ｍｌ染色液，摇匀，于室温放置３—５ｍｉｎ，同时用水做空白试验，于５９５ｎｍ处测定吸收度，分别为Ａｓ和Ａｏ，计算△Ａ＝Ａｓ—Ａ０。
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
考马斯亮蓝法肾组织总蛋白定量一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。
考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝储备液（蒸馏水1：4稀释，现配）、蛋白标准品、NaCl三、操作步骤（一）样品前处理组织：肾组织1.准确称量肾组织0.1g，按质量和体积比加生理盐水制备成10%组织匀浆（注意使用匀浆混匀器时未避免摩擦产生热量会隔10秒钟暂停一下），2.将匀浆吸入1.5毫升的离心管中，将离心管进行标号3000r/min,离心10min后3.取组织匀浆上清，再用生理盐水按1:9稀释。
取样本10微升，生理盐水90微升稀释成1：9的组织匀浆混匀。
三管混匀静置10min于测定波长595nm处的吸光值。
（二）标准曲线的制作1.用空白管取生理盐水50μl，考马斯亮兰3ml；标准品管取标准品50μl，考马斯亮兰3ml；测定管取样本50μl，考马斯亮兰3ml。
分别对管子进行标注。
2.三管混匀后静置10min，将分光光度计的波长调整为595nm，预热20min.3.打开样品槽盖分别将空白管、标准品管、测定管放入样品槽中。
比色皿取毛面。
将分光光度计的模式调至特射比开盖调0，关盖调满，拉杆调吸光度。
记录数据。
（三）目标样品的蛋白浓度测定1.计算公式：蛋白的含量=测定管的OD值-空白管的OD值/标准管的OD值-空白管的OD值×标准液的浓度（蛋白含量）。
四、注意事项1、稀释度。
2、样本的蛋白浓度必须稀释到1.3g/l一下，在此范围才会呈线性关系。
五．实验结果：实验未能达到预期的一条直线。
可能原因：1.样本放置太久，蛋白质变性。
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理。
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm 。
当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm ，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml 蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-该方法灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg 。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变的变化很大。
由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。
【实验准备】一、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250 100mg 溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml 。
（2）生理盐水：0.9% NaCl 溶液。
（3）标准蛋白质溶液：牛血清蛋白（BSA ），用0.9% NaCl 稀释成0.1mg/ml 蛋白标准溶液。
二、器材：试管和试管架、紫外分光光度计、移液枪、漩涡振荡器 【实验步骤】一、制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂各管加入试剂立即置于漩涡振荡器上混匀后，静置5min ，以0号管为空白管调零，在595nm 波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A 595值），如下表所示。
编号蛋白浓度（ug/mL）吸光度（A）5951 10 0.1522 20 0.1993 40 0.3324 60 0.4575 80 0.5716 100 0.667以吸光度（A595值）为纵坐标，标准蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，进行直线拟合，得到标准曲线，如y=0.0059X+0.093，R2=0.9975（注：一般相关系数应在0.995以上，至少2个9以上）。
蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)
0
10
20
30
40
60
80
盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。 以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定： （1）准确称取约200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏 水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上 清液，定容至刻度。 （2）另取2支具塞试管，准确加入0.5 ml样品提取液，再加入0.5 ml蒸 馏水，4ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲 线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
三、主要仪器：
（1）分析天平、台式天平 （2）具塞刻度试管 （3）吸管 （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心机、离心管 （7）容量瓶 （8）微量取样器 （9）分光光度计
四、试剂：
（1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并 定容至100ml，制成 100 μg／ml的原液。 （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－ 250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最 后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。 （3）样品液 取牛血清白蛋白（100 ug／ml）溶液稀释质一定浓 度。
反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测 定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。）
七、思考题：
质定量法？（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin—酚试
实验考马斯亮蓝测蛋白质含量
实验7考马斯亮蓝考G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色测定的方法2、掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法二、原理蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化,从而改变这些染料的光吸收;在些基础上发展了蛋白质染色测定方法;涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫;目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝;考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色,其所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水区具有亲和力,通过疏水作用与蛋白质相结合,形成蓝色的蛋白质染料复合物,在595nm处有最大吸光度,在一定的蛋白质浓度范围内,蛋白质染料符合物在595nm处的吸光度与蛋白质杭亮成正比,因此可用于蛋白质含量测定;反应2—5分钟即呈最大光吸收,至少稳定1小时;在—蛋白质/ml范围内均可;该法操作简便迅速,消耗样品量少,但不同蛋白质之间差异大,且标准曲线线性差;高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰;缓冲液浓度过高时,改变测定液pH值会影响显色;考马斯亮蓝染色能力强,比色杯不洗干净会影响光吸收值,不可用石英怀测定;三、材料、试剂与器具一试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50ml95%乙醇中,加100ml85%磷酸,加水稀释至1升;棕色瓶保存,该染色液可保存数月,若不加水可长期保存,用前稀释;2、标准蛋白溶液：ml牛血清白蛋白;3、未知浓度的蛋白质溶液用酪蛋白配制,浓度控制在10—30mg/ml二器具1、试管及试管架2、移液管1ml,5ml3、可见光分光光度计四、操作步骤一标准曲线的制作1、取7支试管,按下表加入试剂2、将试管摇匀,放置20分钟;3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm;4、以A595nm为纵坐标,标准蛋白色质浓度为横坐标,绘制标准曲线;二样品的测定1、取一支试管,加入未知浓度的蛋白质溶液,蒸馏水考马斯亮蓝试剂5ml.2、将试管摇匀,放置20分钟;3、比色测定吸光值A595nm,对照标准曲线求得蛋白质的浓度;五、注意事项1、由于染料本身的两种颜色形式的光谱有重叠,试剂背景值会因与蛋白质结合的染料增加而不断降低,因而当蛋白质浓度较大时,标准曲线稍有弯曲,但直线弯曲程度很轻,不致影响测定2、测定工作应在蛋白质染料混合后2min开始,力争1hr内完成,否则会因蛋白质一染料复合物发生凝集沉淀而影响测定结果;六、实验报告绘制标准曲线,并将实验结果与其他蛋白质测定方法比较分析;七、思考题1、考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量的原理是什么2、考马斯亮蓝法有什么优缺点Bradford法的优点是1灵敏度高,其最低蛋白质检测量可达1μg;这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的消光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大;2测定快速、简便、只需要加一种试剂;完成一个样品的测定,只需要5min左右,颜色在5min至20min之间稳定性也很好;3干扰物质相对其它方法少;缺点是1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差;2仍有些物质干扰此法测定：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠SDS和L的NaOH;3标准曲线也有轻微的非线性;操作注意事项：不可使用石英比色皿染色不易洗掉,可用塑料或者玻璃比色皿,使用后立即用少量95%的乙醇荡洗,以洗去染色;塑料比色皿决不可以用乙醇或丙酮长时间浸泡;721分光光度计的操作使用①在接通电源前,应对仪器的安全性进行检查,电源线接线应牢固,接地线通地要良好,各个调节旋钮的起始位置应该正确,然后再接通电源;②将灵敏度派或调至“1”档放六倍率最小;调波长调节器至所需波长;③开启电源开关,指示灯亮,选择开关置于“T”,调节透光度“100％”旋钮,使数字显示“”左右,预热20分钟;④打开吸收池暗室盖光门自动关闭,调节“0”旋钮,使数字显示为“”,盖上吸收池盖,将参比溶液置于光路,使光电管受光,调节透光度“100％”旋钮,使数字显示为“”;⑤如果显示不到“100”,则可适当增加电流放大器灵敏度档数,但应尽可能使用低档数,这样仪器将有更高的稳定性;当改变灵敏度后必须按④重新校正“0”和“100”;⑥按④连续几次调整“”和“100”后,将选择开关置于A,调节吸光度调零旋钮,使数字显示“.000”;然后将待测溶液推入光路,显示值即为待测样品的吸光度值A;⑦浓度C的测量;选择开关由“A”旋至“C”,将标准溶液推入光路,调节浓度旋钮;使得数字显示值为已知标准溶液浓度数值;将待测样品溶液推入光路,即可读出待测样品的浓度值;⑧如果大幅度改变测试波长时,在调整“”和“100”后稍等片刻因光能量变化急剧,光电管受光后响应缓慢,需一段光响应平衡时间,当稳定后,重新调整“”和“100”即可工作;五、注意事项比色皿使用注意事项：①拿取比色皿时,手指不能接触其透光面；②装溶液时,先用该溶液润洗比色皿内壁2～3次；测定系列溶液时,通常按由稀到浓的顺序测定；③被测溶液以装至比色皿的3/4高度为宜；④装好溶液后,先用滤纸轻轻吸去比色皿外部的液体,再用擦镜纸小心擦拭透光面,直到洁净透明；⑤一般参比溶液的比色皿放在第一格,待测溶液放在后面三格;。
实验 6.考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速， 约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳 定。由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系 数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低 检出量为1µg）。由于染色法简单迅速，抗干扰 性强，灵敏度高，线性关系好，近年来在某些方 面有取代经典的Lowry法的趋势，是一种较好的 蛋白质快速微量测定方法。
1. NaCl、KCl、MgCl2、(NH4)2SO4、乙醇等物 质对测定无影响，而大量的去污剂如Triton X100、SDS等严重干扰测定，少量的去污剂及 Tris、乙酸、2-巯基乙醇、蔗糖、甘油、 EDTA有少量颜色干扰，可很容易地通过用适 当的溶液对照而消除。同时注意，比色应在显 色2min～1h内完成；如果测定很严格，可以 在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因 为在这段时间内颜色最稳定。
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
（三）、结果计算
样品蛋白质含量（g / g鲜重）＝ ag 提取液总体积（ml ) 测定用提取液体积（ml ) 样品鲜重（g )
式中 a为从标准曲线上查得的蛋白质含
量，单位为µg。
【要点提示】
一器材新鲜小麦叶片或绿豆芽下胚轴等二试剂1000gml蛋白质标准液一标准曲线的制作1000gml标准蛋白溶液ul2040608010009生理盐水ul1008060402020406080100分别向每支试管加入考马斯亮蓝g250试剂30ml充分振荡混合放置5min后测以a595为纵坐标标准蛋白含量为横坐标绘制标准曲线
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。
考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸三、操作步骤（一）试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1 g考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容到1000mL。
备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够。
2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100 μg/mL的牛血清蛋白原液。
（二）标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液（浓度控制在10~100μg/mL范围内）1mL，具体操作：取100-900 μl牛血清蛋白原液，水补足到1 mL，浓度相当于所取原液量的十分之一；2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min；3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值；4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程。
（三）目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定A595。
依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。
五、注意事项1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大，反应需控制在同一条件下进行。
2、比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(1)
三、实验器材与试剂
⒈器材。 可见分光光度计、试管、试管架、研钵、离心机、离心管、 10ml容量瓶、刻度移液管、移液枪、小麦叶片或绿豆下胚 轴。 ⒉试剂。 ⑴0.9％生理盐水 ⑵考马斯亮蓝试剂 称取考马斯亮蓝G250 100㎎，加95％乙醇100ml，溶解后 加85％H３ＰＯ４， 100 ml，加水稀释至 1000ml，存于棕色瓶。 ⑶蛋白质标准溶液 准确称取经微量凯氏定氮法校正的结晶牛血清清蛋白，配置 1000µg/ml标准溶液。
★实验优点 （1）灵敏度高。据估计比Lowry法约高四倍，蛋白质－染料复 合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比 Lowry法要大的多。 （2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定， 只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要 2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟 至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法 那样费时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测 定法。 ★实验缺点 （1）Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。在制作 标准曲线时通常选用 g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面 的偏差。 （2）标准曲线也有轻微的非线性。因而不能用Beer定律进行计 算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝法测定 ——蛋白质含量
一、实验目的。
⒈掌握考马斯亮蓝法定量测定蛋白质的原 理与方法。 ⒉熟练分光光度计的使用和操作方法。
考马斯亮蓝法出现背景
• 双缩脲法和Folin—酚试剂法的 明显缺点和许多限制，促使科学家们去 寻找更好的 蛋白质溶液测定的方法。 1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法 （Bradford法），是根据蛋白质与染料 相结合的原理设计的。这种蛋白质测定 法具有超过其他几种方法的突出优点， 因而正在得到广泛的应用。这一方法是 目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
考马斯亮蓝法测蛋白质
考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie G-250）是一种甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。
考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。
由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。
蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二、操作步骤1.标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清清蛋白标准液，补充水到1.0ml。
然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。
以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。
具体操作见下表。
蛋白质标准曲线测定加样在标准蛋白质测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。
3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的消光系数是 6.6来计算其百分含量。
然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100ug/ml的蛋白溶液。
b.考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入100ml 85%的磷酸，用水稀释至1升三、数据及绘图Welcome To Download !!!欢迎您的下载，资料仅供参考！。
考马斯亮蓝测定蛋白含量总结
一原理考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比FolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二试剂配置三步骤1破碎细菌提取蛋白液大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
(30% Triton X-100的配制Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH=7.3)或0.05mol/l TBS(pH=7.4) 72.8ml配制方法取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
通常将30%稀释到1%。
)注意：在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
GUS荧光定量分析方法1
GUS荧光定量分析方法一、GUS 粗蛋白的提取1、取拟南芥组织100mg，用液氮研磨成粉。
2、加入1ml的GUS提取液（pmsf<蛋白抑制剂>），剧烈震荡。
3、12000rpm离心10分钟，收集上清液，得到GUS粗酶提取液。
二、考马斯亮蓝法测定总蛋白含量按上表加入不同量的BSA标准蛋白溶液，测定OD595的吸光值，并得出曲线方程。
2、样品总蛋白的测定自定合适的比例的稀释GUS蛋白溶液，要求稀释后的待测样品颜色介于1中的0到6之间。
例如：稀释40倍，5ul样品+195ulGus提取液，取40ul +200ulG-250混匀，室温放置2分钟，测定OD595光吸收值，根据标准曲线计算蛋白含量。
三、GUS活性的测定用终止液将MU储备液B按上表稀释成0-250nM,用荧光计在激发波长为350nm,发射波长455nm下测定他们的荧光强度做出一条标准曲线，并得出曲线方程。
2荧光定量1）取两支Ep离心管，各加入1.8mL反应终止液，并编号.2）在Ep管中加入200提取液，加入50uLGUS粗酶提取液，再加入250ul预热的反应液，混匀。
立即取出200ul加入到1号管中，此反应为0时的样品，荧光测定时以此为空白，并开始计时。
3）将反应管放入37摄氏度温箱中进行酶反应，60分钟后，取200ul反应液，加入到2号管中混匀，为反应60分钟时的样品，测定荧光值。
主要溶液的配制：1、GUS提取缓冲液：1)0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）50mL:0.1M磷酸钠缓冲液（pH7.0）：557mL0.1mol/LNa2HPO4+42.3mL1mol/L NaH2PO4定容到1000mL(35.814gNaHPO4.12H2O(358.14)定容到1000mL;15.6g NaH2PO4.2H2O（156.01）定容到100Ml)2) 0.5M Na2EDTA (pH8.0) 2.00mL:9.31gEDTA加水剧烈搅拌，加入约1g NaOH, 定容到50 mL.3) 30% 十二烷基肌氨酸钠0.33 mL：1.5g加水定容到504）10% Triton X-100 1 mL:1 mL Triton X-100 加9 mL水混匀5）β-巯基乙醇0.07-0.10 mL（马琳论文里面有）6）甲醇 20ml（网上有的文献里有）蒸馏水定容至100mL。