皱纹盘鲍性腺多糖抗氧化活性研究

第28卷第4期2009年4月水产科学FISH ERIES SCIENCEVol.28No.4Apr.2009皱纹盘鲍性腺多糖抗氧化活性研究李　韬,周大勇,杨静峰,李冬梅,闫　雪,包国庆,朱蓓薇(大连工业大学生物与食品工程学院,辽宁　大连　116034)摘　要:采用酶法结合醇提法从皱纹盘鲍性腺中提取鲍性腺多糖PA G ,测定其组成为:糖31.77%,蛋白质6.1%,脂肪6.79%,硫酸根25.78%,氨基己糖6.42%,氨基半乳糖1.25%。

以・O H 清除活性、DPP H ・清除活性、还原性及抗脂质过氧化能力等为指标,测定PA G 的体外抗氧化活性。

试验结果表明,PA G 不仅具有较强的・O H 、DPP H ・清除作用和还原能力,还具有一定的抗脂质过氧化能力。

关键词:皱纹盘鲍;性腺;多糖;抗氧化活性;化学组成中图分类号:Q538文献标识码:A 文章编号:100321111(2009)0420179204收稿日期:2008209223;　修回日期:2008210220.基金项目:国家“863”计划项目(No.2007AA091804);国家“十一五”科技支撑计划项目(No.2008BAD94B07).作者简介:李韬(1983-),男,硕士研究生,研究方向:海洋生理活性物质;E 2mail :superrunner1003@.通讯作者:朱蓓薇(1957-),女,教授,研究方向:水产品加工与贮藏;E 2mail :zhubeiwei @. 鲍(H aliotis )属软体动物门、腹足纲,是名贵的水产珍品,具有丰富的营养价值和药用价值。

长期以来,鲍的加工和食用主要以腹足为主,占鲍总质量1/5的脏器大部分被加工成鱼粉或丢弃,这不仅造成环境污染,同时也是资源的极大浪费。

鲍多糖是鲍的重要生理活性物质之一[1],具有抗肿瘤、增强免疫力、抗衰老、抗病毒等生物学作用[2]。

程婷婷等[324]研究了鲍脏器多糖酶法提取的最佳用酶和最适作用条件,并对分离纯化得到的一种鲍多糖A HP 212进行了组成分析和体外抗肿瘤活性的测定;李冬梅等[5]研究了鲍脏器多糖A H P 22的分离纯化方法并对其进行了结构鉴定。

鲍性腺是鲍脏器的主要组成部分,笔者以皱纹盘鲍(H.discushannai )性腺为研究对象,提取鲍多糖,并通过体外抗氧化活性模型评价了其抗氧化活性,为鲍加工废弃物的综合利用提供理论基础。

1　材料与方法1.1　原料、试剂与仪器1.1.1　原料新鲜皱纹盘鲍脏器由大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供。

从鲍的脏器中摘取鲍性腺,经清洗、冻干后,粉碎至20目,冰箱-20℃保存、备用。

1.1.2　试剂木瓜蛋白酶为Sigma 公司生产;氯化钠、浓硫酸、邻苯三酚、番红、无水乙醇、甲醇、苯酚等试剂均为分析纯。

1.1.3　仪器8511型电动搅拌机调速器(上海地理模型厂);L G 21.0型真空冷冻干燥机(沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司);UV 22100紫外分光光度计(尤尼柯仪器有限公司);傅立叶变换红外光谱仪SPEC 2TRUM ON E 2B (Perkin Elmer )。

1.2　鲍性腺多糖的制备鲍性腺干粉,经木瓜蛋白酶水解24h 后(料液比1∶25,加酶量0.2%,反应温度45℃,p H 7.0),水煮1h ,4000r/min 离心10min ,将上清液浓缩后加入3倍体积50%乙醇搅拌提取1h ,静置1h ,再加入3倍体积沸甲醇静置24h ,4000r/min 离心10min后,上清液经旋转蒸发蒸去甲醇、乙醇,冷冻干燥,得到鲍性腺多糖(将其命名为PA G )。

1.3　红外光谱分析将鲍性腺多糖PA G 与K Br 以1∶100比例混合研细后,以K Br 为本底,在4000～400/cm 范围内扫描红外吸收。

1.4　组成分析蛋白质含量采用凯氏定氮法测定,脂肪含量采用索氏提取法测定[6];总糖含量采用酸解法测定,硫酸根含量采用明胶—比浊法测定,氨基己糖及氨基半乳糖含量采用氨基比色法测定[7]。

1.5　抗氧化活性研究1.5.1　对二苯代苦味酰自由基(DPPH ・)的清除作用利用DPP H 体系测定样品对DPP H ・的清除作用[829]。

反应体系中先后加入2.0ml 不同浓度的PA G溶液、2.0ml DPP H・溶液(1.0×1024mol/ L),混匀后室温避光反应20min,4000r/min离心10min,上清液以95%的乙醇调零,于517nm处测定其吸光度A i。

同时测定2.0ml乙醇(95%)与2.0ml PA G溶液混合后的吸光度A j以及2.0ml DPP H・溶液(1.0×1024mol/L)与2.0ml去离子水混合后的吸光度A0。

以V E作阳性对照。

按下式计算清除率:清除率/%=[1-(A i-A j)/A0]×100%以EC50值表示PA G对DPP H・的清除能力。

EC50值是利用线性回归方程计算出样品对DPP H・清除率为50%时对应的样品浓度。

1.5.2　还原作用利用Oyaizu[10]方法测定PA G的还原能力。

反应体系中按顺序分别加入0.2mol/L的磷酸缓冲液(p H6.6)1.0ml、1%铁氰化钾溶液1.0ml、不同浓度的PA G溶液0.25ml,混匀,50℃反应20 min。

反应体系中再加入10%三氯乙酸(TCA)溶液1.0ml,振荡混匀后在4000r/min下离心10 min。

取上清液2.5ml,再加入2.5ml蒸馏水和0.5ml0.1%的三氯化铁溶液,静置10min后溶液由黄色变蓝色,于700nm处测OD值。

空白组以等体积去离子水代替PA G溶液。

以VC作为阳性对照。

以A700,0.5值表示PA G的还原能力。

A700,0.5值是利用线性回归方程计算出吸光值为0.5时对应的样品浓度。

1.5.3　对羟自由基(・O H)的清除作用利用Fenton体系检测PA G对・O H的清除作用[11]。

按顺序分别在试管中加入p H7.4、0.15 mol/L的磷酸盐缓冲溶液0.5ml,520μg/ml的番红溶液0.1ml,6mmol/L的ED TA2Na22Fe2+溶液0.5ml,以及不同浓度的PA G溶液3.5ml,再加入0.3%的H2O20.4ml启动反应。

混匀后于40℃的水浴中保温30min。

以等体积的去离子水代替PA G溶液调零,于520nm处测定其吸光度。

对照管以等体积的去离子水代替PA G溶液和H2O2溶液。

以VC作阳性对照。

按下式计算清除率:清除率/%=OD样品-OD空白OD对照-OD空白×100%以EC50值表示样品对・O H清除能力。

EC50值是利用线性回归方程计算出PA G对・O H清除率为50%时对应的样品浓度。

1.5.4　抗脂质过氧化能力的测定利用碘量比色法测定PA G的抗脂质过氧化能力[12]。

分别取碘标准溶液0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125ml于试管中,加入氯仿—冰醋酸溶液2.5ml,1%淀粉溶液0.5ml,加水稀释至5ml,摇匀,使终质量浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/ ml,取上层液,570nm测定吸光度值,绘制标准曲线。

将油脂5ml、不同浓度PA G溶液1.0ml、75%乙醇1.0ml混合于试管中,硅胶塞密封避光,60℃水浴4d。

空白以去离子水代替样液。

取0.1ml 油样于10ml试管中,加入氯仿—冰醋酸(2∶3,V/ V)溶液2.5ml,再加入饱和KCl0.5ml,混匀,暗处反应5min,取出后加入1%的淀粉溶液0.5ml,用水稀释至5.0ml,混匀,570nm测定吸光度值。

以VC作阳性对照。

按下式计算过氧化值:过氧化值含量X/%=AV×1000×100%式中,X-样品中过氧化值含量(%);A-测定样品中I2的含量(mg);V-样品体积(ml)。

以EC0.8值表示PA G的抗脂质能力。

EC0.8值是利用线性回归方程计算出溶液中过氧化值含量为0.8时对应的样品浓度。

2　结果与讨论2.1　PA G的红外光谱分析图1　PA G的红外光谱图PA G的红外光谱图见图1。

由图1可知,在3412/cm和1080/cm附近有强吸收,表示有2O H 的O2H键伸缩振动和变角振动;1402/cm附近有吸收,表示有C2H、C2O键的伸缩振动和变角振动,这些都是多糖的特征吸收峰。

1633/cm附近有中强吸收,可能是C=O键的伸缩振动,或是酰胺键081水　产　科　学第28卷中N 2H 键的变角振动。

1216/cm 也有强吸收,证明有2OSO 32基团的S =O 伸缩振动。

IR 光谱数据表明,PA G 是含硫酸根的多糖类化合物。

2.2　PA G 的组成分析按1.4所述方法,测定PA G 中的糖为31.77%,蛋白质为 6.1%,脂肪为 6.79%,氨基己糖为6.42%,其中氨基半乳糖为1.25%,硫酸根为25.78%,与红外分析的结果一致。

动物多糖中一般都含有较多蛋白质,采用单一酶法提取的多糖往往蛋白质含量较高,后续脱蛋白工作复杂。

本试验采用酶法结合醇提法提取的PA G 中蛋白质含量远低于以往采用的单酶水解法从鲍内脏中提取的多糖,其蛋白质含量6%[13]。

本试验通过酶法结合醇提法提取多糖,很好地解决了提取多糖中蛋白质含量高这一问题。

2.3　PA G 的抗氧化结果分析2.3.1　PA G 对DPP H ・的清除作用不同质量浓度PA G 的DPP H ・的清除能力见图2。

由图2可知,PA G 质量浓度为1.0～5.0mg/ml 时,对DPP H ・的清除能力随质量浓度增加而增大,其EC 50为2.75mg/ml 。

V E 的DPP H ・清除能力低于PA G ,其EC 50为8.68mg/ml 。

Tseng 等[14]从灵芝中提取的多糖,其质量浓度为5mg/ml 时,对DPP H ・清除率为36.4%～58.4%,而5mg/ml 的PA G 具有78.7%的清除率,因此,PA G 具有较强的DPP H ・清除能力,是一种良好的DPP H ・清除剂。

图2　PA G 对DPP H ・的清除作用2.3.2　PA G 的还原能力PA G 的还原能力见图3。

由图3可见,PA G质量浓度为10～50mg/ml 时,还原能力随质量浓度增加而增大,其A 700,0.5为7.74mg/ml 。

VC 的还原能力高于PA G ,其A 700,0.5为1.24mg/ml 。

Zhu 等[13]从鲍脏器中提取粗多糖,当OD 700值达到0.2时,其雄性多糖质量浓度为8.17mg/ml 、雌性多糖质量浓度为9.25mg/ml ,而本试验提取的PA G 质量浓度仅需2.69mg/ml 。