支气管肺泡灌洗液及胸腔积液中MAGE-3 mRNA的表达在良、恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值

胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中MAGE-3mRNA的表达在良、恶性胸腔积液鉴别诊断中的价值※刘静，岳红梅，吕燕兰州大学第一医院呼吸科，甘肃兰州730000E-mail:ices200501@摘要：目的：研究MAGE-3基因mRNA在支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BLF）及胸腔积液（pleural effusion，PE）中的表达，并探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的可能性。

方法：采用巢式逆转录-聚合酶链反应（nRT-PCR）方法，检测35例患者（25例恶性，10例良性）胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中的MAGE-3表达的情况。

结果：良性胸腔积液患者组中，胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中的MAGE-3表达均为阴性。

恶性胸腔积液患者组中，胸腔积液中MAGE-3表达的阳性率为56％，而支气管肺泡灌洗液中MAGE-3表达的阳性率为76％；其中2例患者胸腔积液中MAGE-3基因表达阳性，支气管肺泡灌洗液中表达阴性，7例患者支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因表达阳性，胸腔积液中基因表达阴性；而12例患者胸腔积液和支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因表达均为阳性。

联合检测胸腔积液和支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因的表达阳性率为84％，较单一检测胸腔积液中基因表达率提高，且差异有统计学意义（P=0.031<0.05）。

结论：联合检测胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因mRNA的表达，可以作为鉴别良恶性胸腔积液的一个指标。

关键词：肺癌；MAGE-3基因；胸腔积液；支气管肺泡灌洗液；巢式逆转录-聚合酶链反应中图分类号R7342引言胸腔积液是一种常见临床征象，临床上可分为漏出液和渗出液。

漏出液大多数是由良性疾病引起的，常见的病因为充血性心力衰竭、肝硬化、肾病综合征。

渗出液最常见的病因为恶性肿瘤、结核性胸膜炎、细菌性肺炎。

其中，结核性胸腔积液和恶性胸腔积液发病率较高，鉴别十分困难。

此外胸腔积液的诊断与治疗、预后密切相关。

目前，临床上常见的鉴别方法是脱落细胞检查找癌细胞，但其阳性率不高，易导致漏诊。

因此，目前尚需一种敏感、特异、方便的方法来鉴别良恶性胸腔积液。

黑色素瘤抗原(melanoma-associated antigen,MAGE)是Van等[1]于1991年在黑色素瘤细胞系中首次发现，是一种新的肿瘤特异性抗原(tumor-specificitied antigen,TSA)。

MAGE 基因通常只在睾丸、胎盘[2][3][4]等少数正常组织中表达，而在多数肿瘤组织中有异常高※本研究受甘肃自然科学基金暨中青年科技项目（3ZS051-A25-082）资助表达。

许多MAGE家族基因被报道在肺癌组织中有表达[5][6][7][8][9][10][11]。

Jong-Rung等研究报道[12]，肺癌组织中MAGE表达阳性率达88％。

Jang.SJ[13]对早期非小细胞肺癌及未患肺癌且有吸烟史的正常人行支气管刷检，发现两者MAGE基因表达均上调。

本实验研究MAGE-3基因mRNA在支气管肺泡灌洗液及胸腔积液中的表达，并探讨MAGE-3基因作为良、恶性胸腔积液鉴别诊断指标的可能性。

1材料与方法1.1材料1.1.1临床资料2007年2月－2007年10月兰州大学第一医院收住的35例住院患者的胸腔积液及支气管肺泡灌洗液。

其中男性19例，女性16例；患者年龄21～78岁，平均年龄49岁。

经组织病理学（纤维支气管镜活检、经皮肺活检、胸膜活检、淋巴结活检、术后经病理证实等）、胸腔积液细胞学诊断恶性胸腔积液25例，其中包括肺癌21例（包括鳞癌9例、腺癌7例、腺鳞癌1例、大细胞未分化癌3例、小细胞未分化癌1例），转移卵巢癌2例，转移前列腺癌2例；根据病史、体征、胸部X线、胸腔积液化验及诊断性治疗并经随访胸液完全吸收等诊断为良性胸腔积液10例，其中结核性胸膜炎7例，肺炎3例；1.1.2主要试剂所用试剂Trizol裂解液、AMV第一链cDNA合成试剂盒、Taq DNA聚合酶、Low MW DNA marker-A等均购自上海生工生物工程服务有限公司，其他分析试剂为国产分析纯。

1.1.3引物设计与合成参照GenBank设计两对引物见表1表1MAGE-3基因及内参β－actin基因巢式RT-PCR扩增的引物序列及目的基因长度Primer Sequences Size of amplified product(base pairs)MAGE-315-GAA GCC GGC CCA GGC TCG–3MAGE-325-GGA GTC CTC ATA GGA TTG GCT CC-3423MAGE-335-AGC ACT GAA GGA GAA GAT CTG CC-3MAGE-345-CCA GGG TGA CTT CAA CTA GAG T-3235β-actin15-TGG AGA AGA TTT GGC ACC-3β-actin25-TAC GAC CAG AGG CAT ACA-31981.1.4主要仪器B160A型医用低速离心机、Heraeus离心机（德国）、热循环仪、DYY-6B型稳压稳流电泳仪、WFH-201B紫外反射投射仪、Kodak凝胶图象分析仪、超低温冰箱、紫外型超纯水仪、HC-TP11-2架盘药物天平、TN-100B型托盘扭力天平、电热恒温水温箱、LG-WD700型微波炉、LX-100手掌型离心机。

1.2MAGE-3基因mRNA表达的测定1.2.1标本的采集及总RNA的提取用高压灭菌并加有EDTA的250ml盐水瓶收集胸腔积液200ml，另抽100ml送病理科行细胞学检查。

将标本立即离心（1500g，10分钟；PBS缓冲液冲洗两次，1500g,5分钟），弃上清获得沉淀，沉淀中加1mlTrizol(上海生工)裂解液，经氯仿分层，等体积异丙醇沉淀，75％乙醇洗涤，室温干燥，0.1％的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，经变性琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.2cDNA的合成20μl反应体系加入3.5μl总RNA、随即引物1μl、AMV逆转录酶1μl、RNasin1μl等，37℃水浴60分钟，所得逆转录产物cDNA保存于－70℃超低温冰箱备用。

（参照上海生工AMV逆转录聚合酶链反应试剂盒说明书操作）1.2.3MAGE-3基因的PCR扩增（5050μμl反应体系）第一轮PCR扩增:5μl逆转录产物，加入0.5μl Taq DNA聚合酶，扩增片段长度为423bp,于PCR热循环仪中扩增30个循环（95℃60s，56℃30s，72℃30s）72延伸10分钟。

第二轮PCR扩增：5μl第一轮PCR扩增产物，加入0.5μl Taq DNA聚合酶，扩增片段长度为235bp,于PCR热循环仪中扩增40个循环（95℃60s，56℃30s，72℃30s）72延伸10分钟。

引物序列见表1。

1.2.5PCR产物电泳取PCR产物10μl，经溴化乙啶染色，GM331(Low MW DNA)作为Marker,进行2%琼脂糖凝胶电泳，Kodak凝胶图象分析仪分析并与Marke r比较，阳性带为MAGE-3基因,并照相。

1.3统计学处理计数资料用阳性例数或阳性率表示，分类变量间比较采用了χ2检验。

P值<0.05有统计学意义。

运算过程采用SPSS13.0统计软件包处理。

2．结果2.1MAGE-3基因的表达10例良性胸腔积液患者组中，胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中的MAGE-3表达均为阴性。

25例恶性胸腔积液患者组中，MAGE-3表达的为阳性率56％，支气管肺泡灌洗液中MAGE-3表达的为阳性率为76％。

其中2例患者胸腔积液中MAGE-3基因表达阳性，支气管肺泡灌洗液中该基因表达阴性；7例患者支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因表达阳性，胸腔积液中基因表达阴性；而12例患者胸腔积液和灌洗液中MAGE-3基因表达均为阳性。

联合检测胸腔积液和支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因的表达阳性率为84％。

表2恶性胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因表达的比较注：a 联合检测恶性胸腔积液及支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因表达较单一检测胸液中基因表达阳性率高，差异有统计学意义（P=0.031<0.05）2.2结果分析（见图1）在25例恶性胸腔积液组中，有14例可见MAGE-3特异性扩增条带，MAGE-3基因表达阳性率为56％；10例良性胸腔积液组中，均未见有MAGE-3特异性条带。

其敏感性、特异性分别为56％、100％。

经Fisher’s 确切概率检验，P=0.002<0.01,良、恶性PE 间MAGE-3的阳性率差异有统计学意义。

在25例恶性支气管肺泡灌洗液组中，有19例可见MAGE-3特异性扩增条带，MAGE-3基因表达阳性率为76％；10例良性支气管肺泡灌洗液组中，均未见有MAGE-3特异性条带。

其敏感性、特异性分别为68％、100％。

经Fisher’s 确切概率检验，P=0.000<0.01，良、恶性BLF 间MAGE-3的阳性率差异有统计学意义。

在25例恶性胸腔积液患者组中，MAGE-3基因表达阳性率为56％；25例恶性支气管肺泡灌洗液组中，MAGE-3基因表达阳性率为76％。

经χ2检验，P ＝0.136>0.05,两组间MAGE-3的阳性率差异无统计学意义。

12例患者胸液和灌洗液中MAGE-3基因表达均为阳性；2例患者胸液中MAGE-3基因表达阳性，灌洗液中表达阴性；7例患者灌洗液中MAGE-3基因表达阳性，胸液中基因表达阴性；联合检测PE 和BLF ，MAGE-3的阳性率为84％，明显高于恶性PE 组，差异有统计学意义（经χ2检验，P ＝0.031<0.05）；恶性PE ＋恶性BLF 组检测MAGE-3的阳性率与恶性BLF 组间比较无明显差异(P ＝0.480>0.05)。

组别阳性例数(N）阳性率(％)恶性组良性组恶性PE14056恶性BLF19076恶性PE ＋恶性BLF 21084aMAGE-3基因RT-PCR产物的电泳结果（图1）。

M 1234M图1MAGE-3基因PCR产物电泳图aFig.1electrophoretogram of MAGE-3nRT-PCR results注：a M：Low MW DNA marker-A；1：支气管肺泡灌洗液中MAGE-3基因；2：支气管肺泡灌洗液阴性对照；3：胸水中MAGE-3基因；4：胸水阴性对照M:Low MW DNA marker-A；1：bronchoalveolar lavage fluid MAGE-3gene；2：bronchoalveolar lavage fluid negative comparison；3：pleural fluid MAGE-3gene；4：pleural fluid negative comparison2．3MAGE-3基因测序随机抽取1例PCR扩增产物标本，与Genebank中公布的MAGE-3序列比较显示，所扩增的约235bp基因片段为MAGE-3基因。