第三节 细胞及其组分的分离纯化和分析

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步骤： 1、等电聚焦电泳：
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2、在垂直于第一次电泳的方向上进行 SDS－PAGE电泳
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原理： 利用颗粒大小的不同: 差速离心法
速度区带离心法 利用颗粒密度的不同: 等密度离心法
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1、差速离心法：用于分离大小、形状不同显 著的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分离
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2、速度区带离心法：用于分离大小差别不 显著的组分
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流式细胞分选仪
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4. 计算机系统：将收集的光信号转换成 数字信号再进行处理分析
数据显示：
①直方图：横标以道数表 示，代表所测荧光或散 射光强度纵标表示细胞 的相对数 优点：可定性，可定量 缺点：只能显示一个参 数于细胞之间的关系
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②二维图：横、纵标分别表示与细胞有关 的两个独立参数，平面上的每个点表示 同时具有相应坐标值的细胞存在。 优点：显示两个独立参数与细胞相对数 之间的关系，反应信息量大 缺点：细胞 点密集的地 方难以显示 它的精细结 构
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③ 二维等高图：等高图上每连续曲线代表 具有相同细胞数的细胞群，即等高。曲 线层次越高，代表的细胞数越多。
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（二）、样品的制备
1.制备单个细胞悬液 分离不同类型的细胞后用蛋白水解酶
（胰蛋白酶、胶原酶）消化细胞间结合物质 或用金属离子螯合剂（乙二胺四乙酸 EDTA） 除去细胞互相粘着所依赖的Ca2+，然后用轻 微的机械方法即可制备成单个细胞悬液。
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3、等密度离心法：
按细胞组分的浮力密度不同进行分离的 方法。适用于大小、形态相似而密度不同的 组分。常将样品通过高浓度的蔗糖或氯化铯 的密度梯度沉降在达到与自身密度相等的位 置就停滞不再向下沉降。此方法直接证明了 DNA的不保留复制。
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三、层 析
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1、纸层析
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2、柱层析：使蛋白质混合液通过含有多孔固 体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用 被不同程度的滞留，这样可在柱底将它们分 别收集。
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2. 细胞固定、染色
活细胞无需固定，死细胞用甲醛、乙 醇、丙酮固定。流式细胞标本一般可不 染色，但要观察细胞内特殊分子（如DNA， RNA）则需染色。
3. 细胞分选
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流式细胞分选仪
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二、细胞组分的分级分离
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聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－亚甲双丙烯酰胺聚合而成
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五、双向电泳 目的：单向SDS－PAGE电泳分辨力差，只能 分开50左右种的蛋白。双向电泳可分辨1000 种以上的蛋白质，一般为2000～15000种。
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常用方法： 离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析
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四、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）
电泳（electrophoresis）: 在含有蛋 白质分子的溶液里加上电场，蛋白质就会 按照它的净电荷、大小和形状，以一定的 速度在电场中移动，这一技术叫电泳。