哺乳动物细胞分离纯化 共20页
哺乳动物组织基因组DNA提取
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二、核酸分离纯化的一般步骤
破碎细胞→去除蛋白质、多糖、脂类等生物大分
子→沉淀核酸→去除盐类、有机溶剂等杂质→纯
化干燥→溶解。
核酸提取方案，应根据具体生物材料和待提取核 酸分子的特点而定。对于某特定细胞器中富集的 核酸分子，采用先提取细胞器后再提取目的核酸
分子的方案，可获得完整性和纯度两方面质量均
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四、实验步骤(Experimental
（二） 破碎、酶解细胞（过夜）
冰浴处理生理盐水 玻璃匀浆器
Procedures)
冰冷的生理盐水清洗（3次）
配制工作液
组织匀浆液
称取0.2g肝脏
剪碎
酶解液
2ml匀浆液
玻璃匀浆器匀浆 离心
组织细胞液
移至1.5ml离心管 无菌水
吹散 加400ul
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核酸的分离纯化、测定及 研究方法
一、 分离核酸的一般原则
因为遗传信息全部贮存在核 酸的一级结构中，故完整的一级 结构是保证核酸结构与功能研究 的基础。
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（一）核酸的分离和纯化时应遵循两个原则
① 保证核酸一级结构的完整性；
② 排除其它分子的污染。
（二）核酸的纯度要求
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溶液的配制
摩尔质量的计算:
质量(g) 分子量 ÷体积(L) ＝摩尔体积（mol/L） 5 mol／L NaCl 分子量58.44 x ÷0.05(L) ＝5（mol/L） x＝ 14.61（g） 58.44 (1) 5mol/L氯化钠（NaCl）：
通过紫外透射仪检测凝胶，然后获取图 片。并将产物条带与已知分子量的标淮条带 进行比较，便可以对合适分子量大小的产物 进行鉴定。
细胞分离与纯化.ppt
2.利用细胞体积和密度进行分离纯化的方法
（1）牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)
由于BSA是血清蛋白，它对细胞活性的影响很小，是早期应用连续 或不连续密度梯度分离细胞的最常用介质，但BSA黏度很高，分离细胞 必须长时间离心，且用量大，费用高，故现在已经部分被其它分离介质 取代。
1.解离（散）组织制备细胞悬液过程中的细胞分离
将用于体外细胞培养的动物组织材料制备成细胞悬 液，然后接种并培养，是原代培养的最常规方法。
由于从体内切取的大多数组织（少数结缔组织如血 液、骨髓、淋巴等除外），均是由细胞和少量的细胞间 质（后者内一般含有纤维成分）紧密结合而成的实体组 织。如果直接将所取的组织块用来培养（此即为植块培 养），在培养的组织块大于1 mm3时，培养过程中只有位 于植块周边的细胞容易获得营养而存活和生长发育。
为了获得大量细胞培养物，必须将组织解离，将组织 块内部细胞与细胞之间的“组织关系”解除，将细胞“解 放”，使之成为分离（离散）的细胞，这个过程即为细胞 分离（离散）或分散（cell dissociation)。
细胞分离（离散）或分散并不等于细胞分离和纯化， 但是，细胞分散是细胞纯化的前提。目前所建立的体外分 离和纯化细胞的方法，绝大多数是从细胞悬液中进行分离 和纯化的。
分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养之前进 行，有时候，分离和纯化细胞的过程还贯穿在原代与继 代培养的过程之中，甚至主要依靠培养过程实现分离与 纯化细胞的目的。
培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在培养物 中的比例如何，常常是衡量某一培养工作是否成功的重 要指标。
四、细胞分离与纯化
根据所要分离纯化的对象和目的不同，可以采用不同 的细胞分离纯化方法，从简单的手工操作技术到使用自动 控制的特别是电脑控制的尖端仪器。
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
《分子生物实验》教学课件：实验二 哺乳动物白细胞DNA分离
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白（DNP）形 式存在于细胞核中。环绕着8个组蛋白构成核小体
从细胞中提取DNA 时，要先把DNP抽提出来，再把P除去， 再除去细胞中的糖，RNA及无机离子等，从中分离DNA 。
DNA提取的几种方法
（1）水抽提法
利用核酸溶解于水的性质，将组织细胞破碎后，用低 盐溶液除去RNA，然后将沉淀溶于水中，使DNA充分 溶解于水中，离心后收集上清液。在上清中加入固体 氯化钠调节至2.6M。加入2倍体积95%乙醇，立即用 搅拌法搅出。然后分别用66%、80%和95%乙醇以及 丙铜洗涤，最后在空气中干燥，既得DNA样品。此法 提取的DNA中蛋白质含量较高，故一般不用。为除蛋 白可将此法加以改良，在提取过程中加入SDS。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
三、主要仪器及试材
实验器材：高速冷冻离心机，高压灭菌锅，离 心管，枪头，移液器，恒温水浴摇 床，冰箱等
试剂及作用
SDS（十二烷基硫酸钠）：溶解细胞膜上的脂类与 蛋白质，使细胞膜裂解，并解离细胞中的核蛋白， 使与DNA双链紧密结合的组蛋白分开和变性，破 坏蛋白质的二级和三级结构，使其容易被蛋白酶水 解。另外，还能与蛋白质结合而沉淀。
六、实验结果处理
提交“哺乳动物白细胞DNA分离”实验报 告（统一格式、纸张）
七、思考题
哺乳动物白细胞DNA分离的原理 及各种试剂的作用。
30μl左右至终浓度100μg/ml，10％SDS
150μl至终浓度0.5%，55℃水浴消化过夜
加入等体积的Tris.Cl饱和酚，轻轻 摇匀10-20min，10000g离心10min
转移上层水相至另一离心管中（重复此步骤一次）
加入等体积苯酚/ 氯仿/ 异戊醇（25: 24: 1），轻轻摇动10-20min以混匀
哺乳动物细胞表达ppt课件
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌表 达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
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3 表达系统
根据目的蛋白表达的时空差异，可将表达系统分为
与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在 于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖 基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能， 因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能 方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开 始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年 间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工 程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结 构和功能研究中亦起了极为重要的作用。
件如何优化、整合的染色体位点多么ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ适，其外源 基因表达量都是有限的。因此，通过增加目的基因 拷贝数来获得高表达重组药物的CHO细胞工程株是 基因工程药物研究中不可或缺的一步。
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5 宿主细胞的改造 随着对细胞周期、细胞凋亡、信号传导，以及细胞周
期的调控机制等各方面机理认识的不断深入，可以通过 载体的系统优化，将编码细胞生长刺激因子、黏附因子、 扩展因子、抗凋亡因子、转录翻译的反式作用因子以及 其他细胞生长存活所必需的成分的基因和顺式表达调控 元件敲人宿主细胞，以提高其表达；
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载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复制 的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
真核哺乳动物细胞标签蛋白纯化
真核哺乳动物细胞标签蛋白纯化简介哺乳动物表达系统的突出优点是表达蛋白可正确折叠以及进行糖基化等翻译后修饰，表达产物具有生物活性，已成为表达和生产蛋白质药物，基因工程抗体，疫苗抗原和研究用目的蛋白功能的首选表达体系。
哺乳动物表达体系蛋白表达的主要流程为：PCR扩增目的片段——将基因片段克隆到表达载体上——细胞转染——细胞株的筛选和培养——纯化目的蛋白解决方案1、查找目的基因序列由于引物是根据目的基因序列来设计的，所以查找到目的基因序列是设计引物的第一步。
查找目的基因序列可以在多个网站上查到，也可以在文献中查找。
这里介绍的是比较常用的NCBI网站查找基因序列的方法。
NCBI 是美国国家生物技术信息中心，网站上具有多个生物数据库，是生物学研究常用的网站。
1.1打开NCBI网站，在下拉框选择Gene，输入目的蛋白名称；（这里以p65为例）1.2 找到对应物种，也可以选择右侧框中的物种查找；1.3 页面往下拉，找到mRNA and Protein(s)，选择正确的isoform，NMxxx表示mRNA序列，NPxxx表示蛋白质序列；1.4 新页面往下拉，点击CDS，点击右侧FASTA，即可得到目的基因的mRNA序列，复制粘贴到新的文本，以备使用。
2、选择合适的表达载体常用的真核表达载体有pCMV，pcDNA等。
表达载体一般包括启动子，多克隆位点，抗性基因，标签基因等等。
表达载体的选择原则：1）启动子是否为真核启动子；2）标签基因是否是我们需要用的标签。
常用的标签的标签有His，GST，MBP，Strep，Flag标签等，标签选择如下：3、设计引物设计引物也有多个软件可以使用，这里介绍的是常用的Primer 5软件。
设计引物的基本原则是：1）引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；2）引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；3）引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右；4）3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，否则容易导致错配；5）以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定
动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定郝春霖（武汉大学药学院，2009302590232）摘要：采用盐溶法和有机溶剂抽提分离纯化猪肝基因组DNA，并利用紫外吸收和二苯胺显色法进行核酸定量和纯度测定。
制备的样品A260/ A280值在1.8附近，纯度较高。
但由紫外吸收法数据计算出样品DNA浓度远大于二苯胺显色法的计算结果，本文对数据差异做了相关讨论。
Abstract：The genomic DNA of poker liver were isolated and purified by salting-in and organic agent extraction method. In order to determine the quantitative and to test the fineness of our sample, it has been reacted with diphenylamine to produce the color product and exposed to the UV to find its O.D value. The A260/ A280 value of the sample is about 1.8, which indicates itself highly purified. However, the data of the two different methods are so different that it confuses us. This essay discusses the differences deeply and analyzes the reasons for the results.关键词：猪肝盐溶法抽提基因组DNA 紫外吸收法二苯胺Key words:poker liver salting-in method extract genomic DNA UVpcx diphenylamine引言：制备组织基因组DNA在基因结构和功能的研究中扮演着重要角色，是分子生物学研究中最重要的实验操作技术之一，样品分离纯化的程度对后续实验结构起到决定性作用；而不同种类生物的基因组DNA提取方法各异，同一生物的不同组织或器官也因其细胞结构及成分差异，而需采用不同的提取方法。
第九章生物物质分离与纯化 ppt课件
SDS PAGE of Purification
10 micrograms loaded in each lane
六、最后加工 包括结晶和枯燥
Industrial Scale up
To transfer the pilot scale results into a commercially feasible production setting.
经过参与一些中性盐，导致胶体出现凝聚的不稳定的景 象。表征电解质凝聚才干的大小用凝聚价，即使胶粒 发 生凝聚作用的最小电解质的浓度。因此反离子价数越高 该值就越小，凝聚才干就越强。常用的凝聚剂为明矾， AlCl3·6H2O, FeCl3, ZnSO4, MgCO3。采用凝聚的方 法得到的凝聚体颗粒比较小。
改动发酵液的性质，以利于固液分别。经过酸化、加热、 以降低发酵液的黏度。
经过参与絮凝剂，使细胞或溶解的大分子聚结成较大的 颗粒。絮凝剂为人工合成的高分子聚合物，如聚丙烯酰 胺和聚乙烯亚胺衍生物，天然的有机高分子物质，如壳 聚糖和葡聚糖的聚糖类，明胶和海藻酸钠，以及由微生 物产生的物质如糖蛋白、粘多糖、纤维素和核酸等，絮 凝法常可得到粗大的絮团。
Supercritical Fluid Extraction
6; 固体吸附： 是物质从液相〔发酵液〕到固相〔吸附剂〕发生物质的转移。此法 用于蛋白质、核酸、氨基酸、抗生素等物质的分别和提取。 按照吸附剂的作用原理：分为三大类。 A物理吸附： 依托范德华力的作用。吸附剂可用活性炭、硅藻土、硅胶、分子筛 和氧化铝等。 B静电吸附： 借助静电引力吸附物质。主要为合成的树脂。 C: 亲和吸附： 在树脂上嫁接一个能与要分别的物质发生特异性反响的配基。
二、发酵液的固液分别
经过固液分别，去除了发酵液中的固相 物质，为后续过程提供廓清或干净的原 料液体。通常采用的单元操作为过滤和 离心。
哺乳动物细胞分离纯化21页PPT
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染 ，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出 来。
常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上，
且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行
物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液（
0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
蛋白质A层析色谱
纯化示例பைடு நூலகம்
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
细胞培养液 MK 流穿样品 洗脱样品 120KD 90KD 60KD
40KD
30KD
20KD
14KD
细胞的分离技术与细胞纯化最新优质ppt课件
? 三、等密度沉降分离法 ? 等密度沉降分离法主要根据细胞密度差异分离
细胞。
? 细胞或细胞器在连续梯度的介质中经足够大离 心力和足够长时间则沉降或漂浮到与自身密度 相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而 将不同密度的细胞或细胞器分离。
? 细胞在连续密度梯度离心介质中，受强离心 力作用下，细胞最后到达与其密度相同的分 离介质层面，并能保持平衡。
? ③溶液以2000g离心10min
? ④弃上清液，把粗提的细胞核悬浮于240ml溶 液A中，并通过4层纱布滤除粗渣。
? ⑤溶液以 2000g离心10min
? ⑥弃上清液，沉淀物悬浮于 240ml溶液中，以 2000g 离心10min
? ⑦弃上清液 ,沉淀悬浮于 190ml溶液B（2.2mol/L蔗糖， 10mmol/L Tris-HCl) 中
? 用免疫磁珠去除无关细胞使靶细胞得以纯化的 方法为阴性分离。
? 通过包被不同的抗体、配体，可进行几乎所有 细胞亚群的分离纯化。
? 该方法具有以下优点： ? ①细胞种类广；②分离纯度高达95%～99.9% ? ③细胞处理量大，可达109个细胞；④分选方式
灵活⑤细胞分离后仍保持很好的活力⑥易于获 得无菌的细胞悬液。
? 分离和纯化细胞的过程不仅仅是在原代培养 之前进行，有时候、分离和纯化细胞的过程 还贯穿在原代与传代培养的过程之中，甚至 主要依靠培养过程实现分离与纯化细胞的目 的。
? 培养物中细胞成分是否单一或者目的细胞在 培养物中的比例如何，常常是衡量某一培养 工作是否成功的重要指标。
? 根据所欲分离纯化的对象和目的不同，可采 取不同的细胞分离和纯化方法，从简单的手 工操作技术到使用自动控制的特别是电脑控 制的尖端仪器。
? 本法的优点是分离速度快，对单个细胞进 行快速定量分析与分选，分离的细胞仍保 持各种功能。
兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定
兔胸腺HMGN2的分离纯化鉴定【摘要】目的：分离纯化鉴定兔高迁移率非组蛋白N2(High mobility group chromosomal protein N2, HMGN2)。
方法：利用液氮研磨和5%高氯酸从新鲜兔胸腺组织获得酸溶性萃取物，经反相高效液相色谱（RP HPLC）分离得到HMGN2，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting对HMGN2进行分子量测定和特异性鉴定。
并利用琼脂糖弥散抑菌实验对其杀菌活性进行鉴定。
结果：利用上述方法分离纯化出高纯度的兔HMGN2。
对大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922有明显杀菌活性。
结论：建立简单分离高纯度的HMGN2的方法。
【关键词】兔胸腺；HMGN2；分离高迁移率非组蛋白(High mobility group chromosomal protein, HMG)是脊椎动物和非脊椎动物的细胞核中含量最为丰富的非组蛋白家族[9]，这一家族的成员普遍存在于高等真核生物中，目前HMG蛋白分为三个亚家族，分别为HMGA、HMGB和HMGN。
HMGN2为HMGN亚家族的成员，其基因位于染色体1q35,相对分子质量为，共由90个氨基酸组成。
已有研究表明，HMGN2结合于染色体的特异部位，是染色体纤维构成必不可少的部分[2,3]，参与DNA的复制和转录[1]，与转录活性基因有关[5]，能解开致密染色体的折叠结构从而有利于复制和转录的启动[6]。
本实验室首次发现HMGN2具有明显的抗菌活性[4]。
为了进一步研究HMGN2的生物学功能，我们利用琼脂糖弥散抗菌法鉴定内源性抗菌肽的方法，分离纯化兔胸腺HMGN2。
1 材料和方法实验材料主要材料:兔胸腺，致病性大肠埃希菌临床分离株54080、大肠埃希菌ATCC25922。
主要试剂:丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺，TEMED，蛋白质Marker为Merck产品；Tris、Tricine、琼脂糖、大豆培养基、三氟乙酸、溶菌酶、牛血清白蛋白（BSA）为Simga产品；乙腈为Fisher 产品；抗HMGN2多克隆抗体为Upstate产品；色谱纯水为Millipore 超纯水；考马斯亮兰R250为上海试剂厂进口分装产品；反应试剂盒BCA Protein Assay Kit为PIERCE公司产品；其余试剂为国产分析纯。
乳铁蛋白的分离与纯化
均可以得到LF。由图1可知峰l 显示样品的吸收峰峰值较小，说明LF含量较低，但是非
LF成分含量却很低,可以忽略,样品纯度比较高经SDSPAGE电泳检测仅出现一条可见的区带,相对分子质量为 9000u,对电泳凝胶进行扫描和计算机分析LF的纯度达 到92%,LF峰2和峰3显示样品的吸收峰峰值较大,说明 LF含量较高,但是样品不纯,含有其他成分,经SDS-PAGE 电泳检测结果为峰2样品中含有两种成分,峰3样品中含 有三种成分。峰IV则说明样品的各个成分含量都很低,经 SDS-PAGE 电泳检测可见条带非常不清晰.
乳铁蛋白的分子质量为90000u,纯度大约 为92%。采用3次盐析和1次凝胶层析的方
法。
第十一页，共18页。
试验方 法
乳样前期处理：
乳样在盐析和凝胶层析之前要进行前期处理,即除去脂 肪 和大量的酪蛋白,
物料的前期处理方法基本相同采用新鲜牛初乳通过离 心脱去脂肪(4℃，3000r/min、30min)得到脱脂乳， 将脱脂乳稀释后， 边搅拌边向其中加入 1mol/L 盐酸 溶液调整脱脂乳的 pH 值到 4.6(酪蛋白的等电点)，室温 放置 30min，离心除去酪蛋白(4℃、10000r/min、 30min)，得到的上清就是我们需要的乳清，用它来分 离 Lf
第九页，共18页。
超滤法
是一种基本的膜分离技术，其原理是根 据膜孔径不同可以实现不同分子质量和 分子形状的大分子物质的分离，非常适 合热敏性的功能性组分的分离。选用孔 径或截留分子量不同的一系列超滤膜， 可以以干酪乳清为原料生产 Lf基料。
第十页，共18页。
盐析法 和层析法
从牛初乳中分离纯化乳铁蛋白并利用电泳 和分光光度法检测其纯度和含量所获得的
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3. 细胞破碎后释放较多杂质， 增大纯化难度。
பைடு நூலகம்
蛋白质A层析色谱
常用的亲和色谱层析：蛋白质A(Protein A Sepharose Fast Flow) 原理：蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合 IgG的Fc区域。作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，使得这 些区域可以结合游离的IgG分子。一分子的蛋白质A可以至少结合两分子的 IgG。
物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液（
0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
蛋白质A层析色谱
纯化示例
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
3. 对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要 向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘 氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。
4. 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子避免柱子 保存在低pH的环境中。
金属螯合层析色谱
常用的亲和色谱层析：金属螯合层析（Chelating Sepharose Fast Flow ） 原理：螯合的Sepharose，当带有Ni2+离子时，如果形成氨基酸残基的复 合物，特别是组氨酸残基被暴露在蛋白质表面时，可以选择性的结合蛋白 质。(His)6融合蛋白可以很容易的结合到亲和柱上，然后用含有咪唑的缓 冲液进行洗脱。
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上，
且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行
分离。 3. 疏水相互作用色谱：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质
MK 120KD 90KD
培养上清 流穿样品 洗脱样品1 洗脱样品2
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。
2. 培养基营养成分未完全消耗 ，长时间放置容易感染细菌 。
3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。
1. 样品可以选择合适的缓冲体系 。
2. 完全去除培养基成分的影响， 可以保存较长时间。
3. 细胞破碎后体积较小，回收时 间短。
1. 需要细胞破碎，离心等处理。 2. 细胞破碎过程中易引入外源
物质都被冲洗出柱子。 6. 用5倍柱体积的较低咪唑浓度（50mM）的洗脱缓冲液进行预洗脱。 7. 重复步骤6，使用更高的咪唑浓度直到目的蛋白都被洗脱下来。 8. 用10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子，亲和柱可以进进行新一轮的纯化
，并且几乎不需要再次加载金属，如果是纯化用同样的HIS6标记的融 合蛋白。
金属螯合层析色谱
与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来进行分离。 4. 凝胶过滤色谱：利用分子通过凝胶填料大小不同对其进行
分离。
表达位置对层析的影响
表达位置 分泌表达
胞内表达
优点
缺点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性
内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。
3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
细胞培养液 MK 流穿样品 洗脱样品 120KD 90KD 60KD
40KD
30KD
20KD
14KD
蛋白质A层析色谱
注意事项
1. 样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。离心下来的上 清经过一个0.45μm的滤膜过滤。
2. 来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下， 可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应 该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。
*组氨酸融合蛋白与Ni2+螯合后填料的结合示意
金属螯合层析色谱
分离操作
镍溶液：0.1M Ni2SO4 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 加入0.5个柱体积的0.1M Ni2SO4。 3. 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 4. 上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 5. 用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD 20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
哺乳动物细胞分离纯化
纯化分离的目的
去除表达产物中非目的基因表达的杂蛋白以及非蛋白组分的 杂质，以得到单一条带的目的蛋白。 去除内毒素；蛋白酶；核酸等污染物。 浓缩目的蛋白至较高的浓度。 保存目的蛋白到合适的缓冲液中，去除对蛋白质功能或保存 有影响的试剂。
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染 ，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出 来。