哺乳动物细胞蛋白表达FAQ
介绍哺乳动物细胞中涉及到蛋白质表达调控的重要分子和机制
介绍哺乳动物细胞中涉及到蛋白质表达调控的重要分子和机制蛋白质是生命体内承担重要功能的分子之一，它在细胞中的表达调控对于生物体的正常功能发挥至关重要。
在哺乳动物细胞中，蛋白质表达调控涉及到许多重要的分子和机制。
本文将介绍哺乳动物细胞中涉及到蛋白质表达调控的一些重要分子和机制。
一、转录调控因子转录调控因子是一类能够结合到DNA上的蛋白质，它们通过与DNA结合，可以促进或抑制基因的转录过程。
在哺乳动物细胞中，转录调控因子的种类繁多，包括转录激活因子和转录抑制因子等。
其中，转录激活因子可以结合到基因的启动子区域，促进RNA聚合酶的结合，从而增强基因的转录水平；而转录抑制因子则可以结合到启动子区域，阻碍RNA聚合酶的结合，进而抑制基因的转录。
通过转录调控因子的作用，细胞可以根据需要调整特定蛋白质的表达水平，以适应环境的变化。
二、转录后调控除了转录调控因子对基因转录的直接调控外，转录后调控也是哺乳动物细胞中重要的蛋白质表达调控机制。
在转录后调控过程中，已经转录合成的mRNA分子会经历剪接、剪切、修饰等一系列的调控步骤，从而影响mRNA的稳定性、转运、翻译效率等。
剪接是一种常见的转录后调控过程，通过剪接，可以选择性地删除或保留mRNA分子中的特定区域，从而产生多种不同的转录产物。
此外，mRNA的修饰如甲基化、磷酸化等也可以对蛋白质的表达调控产生影响。
三、翻译调控因子除了在转录过程中的调控外，蛋白质的表达调控还涉及到翻译过程中的调控机制。
在翻译过程中，参与到蛋白质合成的核糖体需要与甘蓝油酸调控磷酸化因子（TOR）等翻译调控因子相互作用，从而调整蛋白质的合成速率。
TOR因子被认为是一种关键的翻译调控因子，它能够感知细胞内的营养状态，并据此调节蛋白质的合成速率。
当细胞处于营养匮乏状态时，TOR因子的活性降低，从而抑制蛋白质的合成；而当细胞处于富足营养状态时，TOR因子活性增加，加速蛋白质的合成。
四、miRNA调控miRNA是一类短小的非编码RNA，在哺乳动物细胞中广泛参与到蛋白质表达的调控过程中。
哺乳动物细胞诱导表达蛋白流程
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选择合适的哺乳动物细胞系，如 HEK293、CHO 等。
哺乳动物细胞重组抗体表达概述
哺乳动物细胞重组抗体表达概述单抗和多抗定义蛋白结构表面可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇（又称抗原表位见右图）。
它一般由 6-12 个氨基酸或碳水基团组成，可以是由连续序列组成或不连续的蛋白质三级结构组成。
一个抗原可以有许多不同的抗原决定簇，因此，机体可以产生多种不同的抗体。
由单一 B 淋巴细胞产生仅识别一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。
由多种 B 细胞产生，受到多种抗原决定簇刺激并可与多种抗原表位结合的抗体称为多克隆抗体。
单抗与多抗的区别可参考单抗与多抗的区别。
重组抗体生产根据基因序列制备得到单抗，通过构建稳定表达细胞系满足对抗体量的生产。
重组抗体和免疫抗体制备抗体的生产有两种方式。
①利用重组蛋白的方式获取接近天然条件下的重组蛋白（或多肽），通过刺激动物免疫系统，最终获得抗体。
②利用哺乳动物细胞生产，在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体上，进行重组抗体的表达。
刺激动物免疫系统可以生产单抗或多抗，这种方法成功率高且抗体效价较好。
而通过序列进行重组抗体表达，针对特定基因只能生产单抗。
两种生产方式在作用原理和流程等方面都有一定的区别和联系，具体如下：哺乳动物细胞重组抗体生产刺激动物免疫系统制备单抗两种方式制备单抗综述1.抗原的制备：通过刺激动物免疫系统生产单抗前提是要获得抗原，抗原可以是可溶性蛋白，多肽。
可溶性蛋白通过重组蛋白生产得到。
多肽作为抗原与载体偶联免疫小鼠，用多肽进行筛选，如不能进行抗体筛选，需偶联另一种载体进行筛选；2.免疫动物：免疫动物一般选用 6 周龄的小鼠，根据自己制定的实验方案操作。
用已经制备的抗原免疫小鼠，使其分泌 B 淋巴细胞，进行下一步的融合；3.细胞融合：实验前准备好骨髓瘤细胞，骨髓瘤细胞与 B 淋巴细胞按照一定的比例融合，形成杂交瘤细胞；4.杂交瘤细胞选择培养筛选：用 HAT 筛选①培养基筛选融合成功的杂交瘤细胞；5.融合细胞的单克隆生长鉴定：采用有限稀释法或其他方法进行杂交瘤细胞的克隆培养，通过鉴定最终得到能够生产单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞哺乳动物重组抗体在以上流程的基础上进行1.构建稳定表达细胞系：对上述实验得到的抗体测序得到抗体的序列，利用哺乳动物细胞生产重组抗体的方式表达，筛选可稳定表达的细胞系。
哺乳动物蛋白表达服务安全操作及保养规程
哺乳动物蛋白表达服务安全操作及保养规程1. 引言蛋白表达是生物技术和药物研究领域中常用的技术手段之一。
其中，哺乳动物蛋白表达系统（Mammalian Protein Expression System）被广泛应用于产生高质量、大规模和复杂蛋白的表达。
为确保实验室工作人员的安全和保障实验的顺利进行，本文档旨在提供哺乳动物蛋白表达服务的操作规程和相应的保养方法。
2. 实验室安全操作规程2.1 实验室准备•确保实验室和设备的干净整洁。
•配备必要的个人防护装备，包括实验服、手套、面罩等。
•检查实验室安全设施的正常运行，如消防设备、通风系统等。
2.2 实验前准备工作•阅读相应的实验方案和操作指南，并严格按照步骤进行操作。
•准备所需的试剂和材料，确保其完整，没有过期。
2.3 实验操作•在进行哺乳动物蛋白表达实验时，应在无菌条件下进行，避免细菌和其他污染物对实验结果的影响。
•严格按照实验方案中指定的操作步骤进行，不得随意修改或省略步骤。
•注意实验室中的温度和湿度，以确保实验条件的一致性。
•避免交叉污染，必要时进行相应的清洗和消毒操作。
2.4 废弃物处理•废弃物应按照实验室规定的方式进行分类和处理，避免对环境和人体造成不良影响。
•使用过的试剂瓶、培养皿等需要彻底清洗后再进行回收或处理。
2.5 实验后整理•清理实验台、仪器设备等，确保实验室的整洁和安全。
•妥善保管实验数据和样本，避免遗失或被他人利用。
3. 蛋白表达设备保养规程3.1 设备清洁•定期对蛋白表达设备进行清洁，避免污染和腐蚀。
•使用合适的清洁剂和工具进行清洗，不得使用腐蚀性和有毒性的化学品。
•清洗后，应彻底冲洗干净，避免残留物对实验结果的干扰。
3.2 设备维护•按照设备说明书和操作手册进行定期的维护和保养。
•定期检查设备的运行状态，如有问题及时进行维修或更换。
•注意设备的电源和线路安全，确保其正常工作。
3.3 蛋白表达培养基的制备•按照实验方案和培养基配方准确称取和配置培养基。
哺乳动物细胞表达系统表达策略
一、概述在生物医学研究领域，哺乳动物细胞表达系统被广泛应用于蛋白质表达、疫苗研发、疾病治疗等多个方面。
然而，由于哺乳动物细胞表达系统的复杂性和不稳定性，研究人员不断探索新的表达策略，以获得更高效、更稳定的表达效果。
本文将就哺乳动物细胞表达系统的表达策略进行探讨，介绍目前常用的表达策略，并分析其优缺点。
二、哺乳动物细胞表达系统常用的表达策略1. 质粒转染法质粒转染法是最常见的哺乳动物细胞表达策略之一。
该方法通过将感兴趣的基因克隆入表达载体，然后转染至哺乳动物细胞中，利用哺乳动物细胞的表达机器来合成蛋白质。
质粒转染法操作简便，成本较低，适用于初步筛选基因表达情况。
2. 病毒载体介导的表达病毒载体介导的表达策略利用改良过的病毒载体携带外源基因，并将其导入哺乳动物细胞，以实现高效表达。
这种表达方式具有高效率和稳定性，适用于大规模基因表达和蛋白质生产。
3. 融合蛋白表达融合蛋白表达是一种常用的策略，通过将目标蛋白与融合标签结合，提高其稳定性和溶解性，使其更容易在哺乳动物细胞中表达和纯化。
4. 基因组集成技术基因组集成技术是近年来出现的一种新策略，通过将外源基因整合到哺乳动物细胞基因组中，实现长期高效的表达。
这种策略可以提高蛋白质表达的稳定性和可控性，适用于需要长期大量表达的研究领域。
5.化学修饰策略化学修饰策略是指通过对基因序列进行合成优化、蛋白质工程、修饰剂添加等手段，改善蛋白质表达效率和稳定性。
这种策略在提高蛋白质溶解性、减少蛋白结构的折叠和聚集等方面具有一定优势。
三、各种表达策略的优缺点分析1. 质粒转染法优缺点优点：操作简便、成本低、适用于常规表达实验缺点：表达水平和稳定性有限，不适用于大规模蛋白质表达和纯化2. 病毒载体介导的表达优缺点优点：高效率、稳定性好、适用于大规模蛋白质生产缺点：病毒安全性、成本较高、用于基础研究时操作复杂3. 融合蛋白表达优缺点优点：提高蛋白质稳定性和溶解性、易于纯化缺点：可能影响蛋白质的生物活性和功能4. 基因组集成技术优缺点优点：长期高效表达、提高表达稳定性和可控性缺点：操作复杂、潜在的遗传毒性5.化学修饰策略优缺点优点：改善蛋白质表达效率和稳定性缺点：操作繁琐、可能影响蛋白质的天然构象和活性四、结论与展望当前，哺乳动物细胞表达系统的表达策略多种多样，各自具有一定的优缺点。
哺乳动物细胞表达 PPT课件
载体的选择取决于外源基因的导入方式和其调控元 件是否有利于转录和翻译。真核生物基因高表达载体 必须具有如下调控元件：
①原核DNA序列，包括能在大肠杆菌中自身复 制的复制子，便于筛选含萤组细菌的抗生素抗性基因， 以及便于目的基因插入的限制性酶切位点。
②启动子和增强子； ③剪接信号； ④终止信号和polyA加尾信号。
• 稳定表达系统是指载体进入宿主细胞并经选择培 养，载体DNA稳定存在于细胞内，目的蛋白的表达 持久、稳定。由于需抗性选择甚至加压扩增等步骤， 稳定表达相对耗时耗力。
诱导表达系统是指目的基因的转录受外源小分子诱 导后才得以开放。早期实验常使用糖皮质激素、重 金属离子等诱导体系来调控基因表达，但存在特异 性低和毒性高等诸多缺点；
COS细胞是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿 主，其重组载件易于组建，便于使用，而且对插入 DNA的量或者采用基因组DNA 序列的情况都没有什 么限制，便于通过检测表达情况来确证cDNA的阳性 克隆，也利于快速分析引入克隆化cDNA序列中的突 变。
CHO细胞则利于外源基目的稳定整合，易于大 规模培养，能在无血清和蛋白的条件下生 比， 是用于真核生物基因表达软为成功的宿主细胞。 已用于多种复杂的重组蛋白的生产，但其产量 较低，一般仅占细胞蛋白的2.5%，而用细菌 表达可获得占总蛋白50%的蛋白表达水平.
质粒载体则是借助于物理或化学的作用导人细胞内。依据 质粒在宿主细胞内是否具有自我复制能力，可将质粒载体 分为整合型和附加体型载体两类。 整合型载体无复制能力，需整合于宿主细胞染色体内方能 稳定存在。而附加体型载体则是在细胞内以染色体外可自 我复制的附加体形式存在。 整合型载体一般是随机整合入染色体，其外源基因的表达 受插入位点 的影响，同时还可能会改变宿主细胞的生长 特性。相比之下，附加体型载体不存在这方面的 问题， 但载体DNA在复制中容易发生突胞表达载体的必要元件包括：一个
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势
蛋白质表达在动物细胞中的应用利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质的优势蛋白质是生命机体中最重要的组成部分之一，在生物学、医学和工业领域都具有广泛的应用。
蛋白质表达则是将基因信息转化为蛋白质的过程，这一过程对于基础研究和工业化生产都具有重要作用。
在动物细胞中，蛋白质表达利用哺乳动物细胞表达重组蛋白质具有一系列优势。
一、哺乳动物细胞表达的优势哺乳动物细胞是表达重组蛋白质的理想载体，其优势主要有以下几点：1.真核生物中的哺乳动物细胞能够在所有重组蛋白质修饰过程中提供最高水平的质量。
由于哺乳动物细胞在体内合成蛋白质时，可以发生多种复杂的修饰过程，例如酰化、糖基化和磷酸化等。
这些修饰可以提高蛋白质的稳定性、可溶性和生物活性，使重组蛋白质更加适合用于医学和工业方面。
相比之下，原核生物（如大肠杆菌）表达的蛋白质缺乏这些修饰过程，因此其生物活性和稳定性较低。
此外，哺乳动物细胞中的重组蛋白质也很少产生抗原性，因此更适合用于医学应用。
2.哺乳动物细胞中的蛋白质折叠和修饰过程更加类似于人类和其他哺乳动物中蛋白质合成的过程。
由于哺乳动物细胞与人类和其他哺乳动物有很大相似性，因此表达的重组蛋白质更符合人类进化历史和生物学功能。
这也意味着可以更好地预测重组蛋白质在生理环境下的稳定性和效力，缩短临床试验的时间和成本。
3.哺乳动物细胞表达的重组蛋白质能够以天然状态的形式分泌到培养基中。
重组蛋白质如果能够以天然状态的形式分泌到培养基中，可以节省纯化步骤和工艺流程，降低生产成本，提高重组蛋白质的产量和纯度。
而哺乳动物细胞中的重组蛋白质通常能够实现这一点。
此外，哺乳动物细胞的培养和维护工艺已经比较成熟，使用更加方便。
二、哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法哺乳动物细胞表达重组蛋白质的方法有多种，主要有以下几种：1.哺乳动物细胞内表达哺乳动物细胞内表达是将重组质粒导入哺乳动物细胞内部，利用细胞自身的基因转录、转译和修饰等机制，表达出重组蛋白质。
哺乳动物细胞表达系统原理
哺乳动物细胞表达系统原理
哺乳动物细胞表达系统是一种用于生产重组蛋白和基因治疗的有效工具。
其原理主要基于哺乳动物细胞具有促使蛋白正确折叠和实现复杂修饰的功能，使得表达的蛋白更接近天然状态。
哺乳动物细胞表达系统有两种主要方式：瞬时转染表达和稳定转染表达（稳定细胞系构建）。
瞬时转染表达是指在短时间内表达出一定量的蛋白。
外源基因不整合到宿主染色体上，随着细胞的生长不断丢失，表达小量蛋白的过程。
这种方法简捷，实验周期短。
稳定转染/稳定细胞株筛选则是指将构建好的质粒线性化，在导入到培养好
的哺乳动物细胞内，通过一定的转染方法实现质粒与细胞的融合。
线性化的质粒进入到宿主细胞后，与细胞自身的基因组进行整合，同时随着细胞的生长繁殖而生长，过程中在经过一系列的筛选鉴定，排除未正确融合的重组子，或不能稳定表达下去的重组子，最终筛选出可以稳定表达的细胞株。
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哺乳动物细胞表达系统
据文献报道，在不断提高的选择压力下，dhfr及侧翼序列 能扩增至上千个拷贝，大大增加目的基因的表达水平。
真核表达载体-启动子
外源基因在哺乳动物细胞中的表达与多种因素有关，主要 是启动子和增强子的强弱以及它们之间的搭配。
常用的高等哺乳动物受体细胞
迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规 模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细 胞（CHO），其优势有如下几个方面： 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
Pei等用该细胞株表达分泌型的基质金属蛋白酶MMPI3，发现 高表达的阳性细胞克隆可占转染细胞的5％~l0％，其中一个 克隆的表达量可占细胞上清总蛋白的l5％~20％，在细胞单层 贴壁培养情况下表达量达10 mg/L。
对细胞株选择性地进行遗传改造
BHK/vl6细胞株是稳定表达单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白 的BHK细胞，由于VP16的转录激活作用，载体中的HSV 早期启动子在该工程细胞中有很高的活性。
Clontech公司开发的Tet-off系统中的启动子则由CMV启动 子的核心序列和7个Tet阻遏蛋白结合位点组成。
这些启动子在诱导前后活性可相差4个数量级。
真核表达载体-启动子
在哺乳动物细胞中已发现存在大量在低氧环境中可诱导转录 的基因，如编码红细胞生成素(EPO)、转铁蛋白、血红素加 氧酶-1等的基因，它们都有一个共同的顺式作用元件 (CGTG )，有利于在5’或3’侧翼区的低氧诱导作用因子1(HIF-1)和低氧反应增强子(HRE)结合，激活靶基因的转录， 在低氧浓度下可使重组蛋白大量表达。
哺乳动物细胞蛋白表达—细胞的培养
活性蛋白整体方案哺乳动物细胞蛋白表达—细胞的培养摘要：本文主要介绍了哺乳动物细胞培养的相关知识，主要包括细胞培养的基本原则，HEK293和CHO细胞培养的方法以及细胞的冻存，复苏。
随着细胞基因工程的不断发展，目前有多种生物表达系统都能够大规模的生产重组蛋白，主要分为原核和真核两类。
真核表达系统又包括：酵母表达系统，哺乳动物细胞表达系统，昆虫杆状病毒。
相比之下，哺乳动物细胞表达系统最突出的优点是能够促进蛋白的正确折叠和糖基化等翻译后修饰，从而保证蛋白的天然活性，目前已成为表达和生产部分蛋白药物、基因工程抗体等目的蛋白的首选宿主。
细胞培养基本原则1.合适的细胞培养基合适的细胞培养基是细胞在体外生长最重要的条件，培养基不仅提供给细胞生长繁殖需要的基础物质，还维持细胞生长的整个环境，不同的细胞有不同的生长习性，因此要选择合适的培养基2.优质血清目前，多数的合成培养基都有添加血清，常用的血清有小牛血清、马血清等。
血清中含有细胞生长所必须的生长因子，作为哺乳动物细胞培养的附加物，血清十分昂贵且存在多种问题，因此人们在不断寻找可以替代血清的物质3.无毒无菌的生长环境体外生长的细胞缺乏对微生物和有毒物质的抵御能力，一旦被污染，会导致细胞死亡，无毒无菌的培养环境是必要条件4.温度与气体环境细胞生长需要恒定的温度，同时气体（氧气与二氧化碳）也是哺乳动物细胞培养的所必须的物质，HEK293和CHO 的细胞培养一般是37℃，5%的二氧化碳环境。
哺乳动物蛋白表达细胞的培养哺乳动物蛋白表达常用的细胞有HEK293（人胚肾细胞）和CHO（中国仓鼠卵巢细胞）。
这两种细胞的应用最为广泛，是在真核系统蛋白表达中最常用的细胞，具有以下特点：1）具有准确的转录后修饰功能，表达蛋白在任何方面都最接近天然状态2）具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白整合稳定3）具有较高的耐受剪切力和渗透压能力，表达水平较高活性蛋白整体方案4）CHO属于成纤维细胞，是一种非分泌细胞，自身很少分泌内源蛋白，有利于目的蛋白的分离纯化5）HEK293细胞具有更高的生长密度更快的生长速度，易培养，易转染HEK293细胞培养1.原代培养：用一定量的PBS缓冲液轻轻洗涤细胞，加入0.05%的胰蛋白酶消化，接种0.5x106个/ml的细胞密度于10ml DEME培养基中（含有10%的牛血清），37℃，180rpm震荡悬浮培养，培养2-3天后传代。
哺乳动物蛋白表达系统.docx
哺乳动物细胞表达系统背景简介哺乳动物细胞表达系统以哺乳动物细胞作为宿主进行蛋白表达生产，具有转录后修饰、蛋白 正确折叠与装配等功能，表达的蛋白更接近天然状态，并且很多蛋白可以经哺乳动物细胞分泌到 细胞外，这利于蛋白的别离。
如果缺少正确的转录后修饰，可能影响蛋白质的稳定和配体结合, 进而增加免疫原性，因此正确的转录后修饰对于治疗蛋白的生产非常重要。
但是哺乳动物表达系 统也具有细胞系生长缓慢、生长环境要求严格、易污染、费用高昂等缺点。
哺乳动物细胞已经成 为治疗蛋白生产的主力军，生产的治疗蛋白有上百种。
非洲绿猴肾细胞（COS ）适合于小规模的 单抗制备，如果要大规模地生产，最常用的是中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）细胞。
图1、哺乳动物细胞表达系统生产重组蛋白的流程示意图。
转染哺乳动物细胞的转染有瞬时转染和稳定转染两种。
瞬时转染不会将载体整合到宿主基因组 中，可以快速生产少量的蛋白，瞬时转染还可以帮助测试比拟不同的载体，这对建立稳定表达细 胞系非常有必要。
瞬时转染方法有氮化钙法、磷酸钙法、DEAE —葡聚糖法、PEI 法和电穿孔法 等。
瞬时转染适用的细胞系有COS （非洲绿猴肾细胞）、BHK （叙利亚仓鼠肾细胞）、HEK 293 （人胚肾细胞293）等等。
这几个细胞系能进行快速转染，可以悬浮培养，还能在不含血清的培 养基中生长，这有助于表达蛋白的纯化并减少污染的可能性。
当用PEI 法对HEK293细胞系进Host cell lineTransfectionRepeat with increasing drug concentrationsExpression vector TTTTTTT lllllll©Single Cell Cloning or ILimiting Dilution fPreliminary clone evaluation and Expansion of selected clones行瞬时转染，可以得到50-80%成功表达GFP (绿色荧光蛋白)的重组子。
哺乳动物细胞中蛋白质表达的调控
哺乳动物细胞中蛋白质表达的调控蛋白质是细胞中最为关键的分子之一，起着多种生物学功能，如代谢调节、的信号转导、运输物质、维持细胞器和细胞结构及参与免疫等。
在哺乳动物体内，蛋白质的合成受到多种机制的调控，包括转录后修饰、翻译控制和降解。
一、转录后修饰的调控转录后修饰是指在转录过程后，通过RNA加工、成熟和转录后修饰对mRNA的稳定性和转化率进行调控。
1.剪接调控在剪接调控中，典型的转录后修饰方式是剪接，是前体mRNA合成后的重要调节步骤。
由于人类基因组中的多个基因可编码不止一种蛋白，剪接可以对不同基因的同一前体mRNA产生不同效果.剪接方式的多样性使得一个基因可以编码大量不同的蛋白，使得一批基本的基因可以执行多样的功能任务。
2. mRNA稳定性的调节在转录后的修饰中，还包含mRNA稳定性计数的调节途径。
RNA 加工和生物降解控制了特定RNA的表达，核糖核酸合成的稳定性和去除维持mRNA的稳定性都会影响此类蛋白的表达。
mRNA稳定性调节的机制包括CpG岛、microRNA、3'非翻译区域及其相应的识别蛋白。
二、翻译控制的调控经过转录后修饰的RNA被翻译成蛋白质.哺乳动物细胞中的翻译调控包括了促进和抑制翻译的机制。
1.转录后修饰的影响对于mRNA转录后修饰的影响可能通过其3'非翻译区域（UTR）和结构域来实现.蛋白质会通过本身的同功酶及人体份子机制族来组合，因此结构域的存在表示着私有性能和机体相关性。
2.翻译启动因子和调制因子翻译启动因子和调控因子以多样的方式影响翻译速率并控制蛋白质表达。
翻译启动因子在新的肽链中的串成起到重要的作用。
eIF2，eIF3和eIF4组 sont des facteurs de la traduction. Ils lient le ribosome à l'ARNm et au complexe tRNAs/GTP/Mét-ATP。
哺乳动物细胞表达系统
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基因 3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。 SV40的早期和晚期PolyA. 牛生长激素基因PolyA. 人工合成PolyA.
IRES
IRES(internal Ribosome entry site)内部核糖体切入 位点,可从一个mRNA翻译二个ORF。
高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
遗传标记 编码产物
筛选药物
作用机理
APH-
氨基糖苷磷酸转移酶 G418
APH灭活G418
DHFR HPHTK-
二氢叶酸还原酶 潮霉素B磷酸转移酶 胸腺嘧啶核苷激酶
氨甲喋呤 潮霉素B 氨甲喋呤
DHFR变体抗氨 甲碟呤
HPH灭活潮霉素 B
TK合成TMP
XGPRTADA-
黄嘌呤过控制 tet 的浓度来控制基因表达的水平。
▪ 应用于研究基因不同水平的表达对细胞,个体发育的影响
有何不同。
作用机制示意图
四环素调控表达系统构成元件
▪ 四环素阻遏子（Tet repressor protein,TetR） ▪ 四环素操纵子（Tet operator DNA Sequence, TetO） ▪ 单纯疱疹病毒Vp16转录活化区(Vp16 activation domain,AD) ▪ 四环素调控反式激活子（Tetracyeline-Controlled
transactivator .tTA）TetR与Vp16组成融合表达蛋白。
哺乳动物细胞表达系统
动物基因工程原理
特点与优势
哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白 质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型 糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分 子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然 的高等生物蛋白质分子。
哺乳动物细胞表达系统的应用
哺乳动物细胞表达系统的应用哺乳动物细胞表达系统是在哺乳动物细胞中表达外源蛋白的一种常用方法。
这种系统的应用非常广泛，包括基础科学研究、药物开发、生物制药等多个领域。
以下是哺乳动物细胞表达系统的一些主要应用：
1.基础科学研究：
•蛋白功能研究： 通过在哺乳动物细胞中表达外源蛋白，研究者可以深入了解蛋白质的结构、功能和相互作用。
•信号转导研究： 使用哺乳动物细胞表达系统可以模拟细胞内的信号传导途径，帮助研究人员理解细胞信号调控的机制。
2.药物开发：
•蛋白药物生产： 许多生物制药品，如重组蛋白、抗体和疫苗，需要在哺乳动物细胞中表达并进行生产。
•药物靶点验证： 通过在哺乳动物细胞中表达目标蛋白，可以进行新药靶点的验证和筛选。
3.疾病研究：
•疾病模型： 利用哺乳动物细胞表达系统，可以构建疾病相关蛋白的细胞模型，用于研究疾病的发病机制和筛选潜在治疗方法。
•蛋白标记： 将蛋白质标记为荧光蛋白或其他标记物，用于追踪细胞内的特定蛋白。
4.细胞工程：
•基因治疗： 利用哺乳动物细胞表达系统可以生产基因治疗药物，用于治疗一些遗传性疾病。
•细胞药物输送： 将药物载体或纳米颗粒表达在哺乳动物细胞中，用于细胞药物输送研究。
5.病毒研究：
•病毒复制机制： 使用哺乳动物细胞表达系统可以研究病毒的生命周期、复制机制和与宿主细胞的相互作用。
•疫苗研发： 通过表达病毒蛋白，可以进行病毒样粒子 VLP）疫苗的研发。
这些应用表明，哺乳动物细胞表达系统在科学研究和药物开发中具有重要作用，能够提供生产复杂蛋白和进行多方面生物学研究的有效工具。
用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞系
用于重组蛋白表达的哺乳动物细胞系随着重组蛋白类药物种类、性质等需求的不断变化，相应的蛋白表达系统也不断改进。
目前，用来表达重组蛋白药物的宿主系统包括微生物、昆虫细胞和哺乳动物细胞等。
由于哺乳动物细胞对蛋白的翻译后修饰作用，使其具有与人源蛋白分子结构更为接近的优势，因此其已经成为临床治疗蛋白的主要表达宿主，其中应用最广泛的是中国仓鼠卵巢细胞( CHO 细胞) 。
构建高效表达重组蛋白的哺乳动物细胞系已成为生产重组治疗蛋白的关键所在。
各种生物技术的快速发展，促进了哺乳动物细胞表达系统的不断完善。
哺乳动物细胞已经广泛用于重组蛋白的生产，原因在于哺乳动物细胞能够完成复杂的翻译后修饰，使蛋白药物更加稳定和有效。
1986 年FDA 批准了第一个由CHO 细胞表达的组织纤溶酶原激活剂( tPA) 作为治疗性蛋白，使得哺乳动物细胞生产重组蛋白得到了快速的发展。
哺乳动物细胞表达系统经过近 30 年的发展，其产物的表达量已由过去的 50 mg/L 提高到了 5 ～ 10 g /L，提高了 100 多倍。
CHO 细胞作为使用最广泛的表达宿主，具有以下优势: 第一，CHO 细胞能够在无血清培养基中悬浮生长，可以用于大规模反应器生产; 第二，通过基因扩增，CHO 细胞能克服哺乳动物细胞生产率低的缺陷; 第三，CHO 细胞表达的重组蛋白翻译后糖基化修饰与人源蛋白更接近; 最后，CHO 细胞能够抵抗人类病毒的感染，生产的产品安全性高。
重组蛋白作为生物制药的重要部分，全球每年的销售额约为120 亿美元。
随着时代的发展，对重组蛋白的需求不断增加，要求不断提高，这就需要改善哺乳动物细胞表达系统，进一步提高重组蛋白的表达量，增强细胞株的稳定性，降低生产成本的同时确保产品的质量和安全。
哺乳动物细胞系的发展包括表达载体构建、克隆筛选及分离、工程细胞改造、培养条件优化等方面。
1 哺乳动物细胞系用于重组蛋白药物生产的表达系统主要包括原核表达系统、酵母表达系统、植物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统，如图1 所示。
哺乳动物细胞表达重组蛋白
为增加转录产物的稳定性,表达载体中一般含有天然的
或人工合成的内含子序列。
转录终止序列
真核基因的hnRNA的加工过程需要PolyA信号,在目的基 因3’端加上PolyA,表达水平提高10倍以上。SV40的早期 和晚期Po源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备 以下条件： 细胞系特征：丧失细胞接触抑制和锚地依赖特征， 便于大规模培养。 遗传稳定性：外源基因多次传代后不至于丢失， 易于长期保存。 合适的标记：便于转化株的筛选和维持。 生长快且齐：分裂周期短，生长均一，便于控制。 安全性能好：不合成分泌致病物质，不致癌。
利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本
采用无血清／无蛋白培养基(SFM／PFM)来降低细胞培养和产 品纯化的成本。双无培养基
但SFM／PFM缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其 他细胞生长存活所必需的成分，在培养过程中细胞常表现出活力降 低、贴壁性差等现象，进而导致分泌目的蛋白的能力下降。
哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中， 常用的细胞系有 中国仓鼠卵巢细胞（CHO） 人胚肾细胞HEK293
中国仓鼠卵巢细胞（CHO的优势 遗传背景清楚，生理代谢稳定 与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确 基因转移和载体表达系统完善 耐受剪切力，便于大规模培养 被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞
我国从2000年开始逐渐发展了该项技术，虽然起步较 晚，基础较差，但经过努力实现了该项技术的突破。
经过20多年的发展，哺乳动物细胞制备重组 蛋白技术发生了巨大的变化。主要表现在
(1) 细胞培养时间延长，由过去的7天延长至21天； (2) 细胞密度增加， 过去：1-2X106细胞／毫升， 现在：1-1.5X107细胞／毫升； (3) 产量增加， 过去：10—20pg重组蛋白／细胞／天， 50一100mg重组蛋白／升， 现在：50-90pg重组蛋白／细胞／天， 1-5g重组蛋白／升。
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哺乳动物细胞蛋白表达FAQ
1、什么是质粒超螺旋，超螺旋对提高表达量有什么帮助？答：闭环DNA（closed circular DNA）没有断口的双链环状DNA，亦称为超螺旋DNA ，超螺旋比例90%以上是比较理想的真核表达质粒，较低的超螺旋比例会降低表达量近50%以上。
2、CHO细胞与293细胞有什么区别？
答：CHO细胞即中国仓鼠卵巢细胞，是目前表达外源蛋白最多最成功的细胞之一。
该细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，自身很少分泌内源蛋白，因此有利于目的蛋白的纯化分离；相较于其他细胞类型，CHO细胞是治疗性蛋白生产的主要宿主细胞的原因如下：（1）能在化学成分限定和无血清悬浮培养中稳定生长，
（2）该细胞基因组信息明确，在人类致病病毒应答方面表现出合理的安全性，
（3）能够表达与人相似的翻译后修饰。
此外，CHO细胞表达系统的最重要优势之一是能够容易的得到基因改造的细胞。
然而，因为糖基化模式与人类不完全相同，导致CHO细胞产生的重组蛋白在某些时候仍然表现出免疫原性。
HEK293细胞是真核蛋白表达常用的细胞之一，它具有以下优势：更快的生长速度，更高的生长密度、转染效率高，表达后修饰更接近人体蛋白的结构，可能会有潜在的人病毒污染。
3、常用的哺乳动物细胞蛋白表达系统是什么？原理是什
么？
答：我们常用的系统是2936e细胞配套PTT5(pAZ5)载体 HEK2936E 是在细胞的基因组中整合了EBV病毒的 nuclear antigen 1 (EBNA1),
该蛋白可以保证含有EBV病毒复制原点(EBV ori）的质粒在HEK293E
细胞株中复制，提高质粒的拷贝数，进而提高克隆在此种质粒上的外源基因的表达水平。
该系统比常规的293F细胞表达量要高。
4、导致哺乳动物细胞蛋白表达低或者不表达的原因有哪些？哪类蛋白不容易表达？
答：基因是否优化，有的蛋白稀有密码子较多，需要对应表达细胞进
行优化密码子。
蛋白本身就比较难做，比如细胞因子类的，衣壳蛋白类的，膜蛋白。
质粒质量：内毒素水平、有无蛋白和核酸污染、超螺旋比例、无盐苯酚等试剂
分子量较大或者太小：大于150KD表达会有一定的难度，小于5KD也会有难度。
有的表达量不低，但是纯化得率低（可溶性差，不挂住，不稳定，易降解）
难表达蛋白：细胞因子、激素、抗菌肽、衣壳蛋白、膜蛋白
5、促进蛋白表达的方式有哪些？
答：加可溶性标签GST,FC、加促表达标签GST、加表达量高的融合蛋白这些都是设计
选用高表达系统：比如293细胞较cho细胞转染效率要高，EXPI293或者Expicho系统表达较freestyle系统表达水平高，但是成本也较高。
表达优化：细胞系、质粒、转染试剂方面的实验优化
工艺优化：加辅料、低温、加葡糖糖、二次转染等方式提高表达量，延长表达时间。
6、是不是都能实现分泌表达？
信号肽位于分泌蛋白的N端。
一般由15～30个氨基酸组成。
包括三个区：一个带正电信号肽的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。
当信号肽序列合成后，被信号识别颗粒(SRP)所识别，蛋白质合成暂停或减缓，信号识别颗粒将核糖体携带至内质网上，蛋白质合成重新开始。
在信号肽的引导下，新合成的蛋白质进入内质网腔．而信号肽序列则在信号肽酶的作用下被切除。
信号肽只是一个搬运工具，它能够促进蛋白搬运到胞外区，有的蛋白
胞内的组织蛋白或者结构蛋白等分泌能力较弱的蛋白可能就不能被
信号肽酶切除。
7、哺乳动物细胞蛋白表达体系可表达的蛋白大小范围？
10kd-120kd。
分子量大于150KD，小于5KD表达是有难度的，但是昆虫系统对大分子蛋白表达是有优势的，目前我们接触过250KD的蛋白用昆虫杆状病毒表达系统表达成功。
8、什么情况下需要选择哺乳动物细胞蛋白表达体系来表达？
答：生物药蛋白、分泌蛋白、糖基化修饰高的蛋白、需要活性蛋白、内毒素要求控制的蛋白亚细胞定位在胞外的蛋白。
以上说明不代表昆虫不能做
9、表达得到的蛋白是有活性的么？
答：哺乳动物细胞蛋白表达系统表达的蛋白基本上有活性，但是蛋白不一样很多蛋白没有活性可能是蛋白本身原因，比如亲水性差，可溶性差，不稳定等。