哺乳动物细胞分离纯化
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哺乳动物细胞分离纯化
纯化分离的目的
去除表达产物中非目的基因表达的杂蛋白以及非蛋白组分的 杂质，以得到单一条带的目的蛋白。 去除内毒素；蛋白酶；核酸等污染物。 浓缩目的蛋白至较高的浓度。 保存目的蛋白到合适的缓冲液中，去除对蛋白质功能或保存 有影响的试剂。
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染， 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
表达位置对层析的影响
表达位置
分泌表达
优点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性 内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。 3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
缺点
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。 2. 培养基营养成分未完全消耗， 长时间放置容易感染细菌。 3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。 需要细胞破碎，离心等处理。 细胞破碎过程中易引入外源 性内毒素，破碎过程比较剧 烈，可能会破坏蛋白质结构。 细胞破碎后释放较多杂质， 增大纯化难度。
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上， 且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行 分离。 3. 疏水相互作用色谱：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质 与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来进行分离。 4. 凝胶过滤色谱：利用分子通过凝胶填料大小不同对其进行 分离。
14KD
蛋白质A层析色谱
注意事项
1. 样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。离心下来的上 清经过一个0.45μm的滤膜过滤。 2. 来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下， 可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应 该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。 3. 对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要 向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘 氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。 4. 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子避免柱子 保存在低pH的环境中。
*组氨酸融合蛋白与Ni2+螯合后填料的结合示意
金属螯合层析色谱
分离操作
镍溶液：0.1M Ni2SO4 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 加入0.5个柱体积的0.1M Ni2SO4。 3. 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 4. 上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 5. 用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子。 6. 用5倍柱体积的较低咪唑浓度（50mM）的洗脱缓冲液进行预洗脱。 7. 重复步骤6，使用更高的咪唑浓度直到目的蛋白都被洗脱下来。 8. 用10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子，亲和柱可以进进行新一轮的纯化， 并且几乎不需要再次加载金属，如果是纯化用同样的HIS6标记的融合 蛋白。
重力柱的应用
装柱和分离过程
1. 2. 3. 4. 装入下筛板并用去离子水润洗空柱体。 接好下堵头，取合适体积的填料并用移液器吹打均匀，加入空柱体。 继续加入去离子水让填料沉降完全，装入上筛板。 保持一定的液面高度，盖上盖子完成装柱。
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1
2
3
4
重力柱的应用
分离操作SOP
FC亲和标签实验流程 样品预处理： 20ml培养上清补加20mMPB，调pH至7.4. Buffer A：PBS, pH7.4 Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0 Protein A填料载量比较低，1ml填料可以结合2mg左右FC标签蛋白，根据 表达量选用合适的Protein A亲和柱。（不可用NaOH来控内毒或者清洗） PBS平衡后上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡液平衡亲和柱（尽可 能提高平衡体积，至少10ml）。平衡后用buffer B洗脱，分别收集洗脱液。 洗脱液的收集管预先加入一定量的1M Tris，pH9.0调节pH值，洗脱完成后 用Buffer A重新平衡柱子。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
金属螯合层析色谱
常用的亲和色谱层析：金属螯合层析（Chelating Sepharose Fast Flow） 原理：螯合的Sepharose，当带有Ni2+离子时，如果形成氨基酸残基的复 合物，特别是组氨酸残基被暴露在蛋白质表面时，可以选择性的结合蛋白 质。(His)6融合蛋白可以很容易的结合到亲和柱上，然后用含有咪唑的缓 冲液进行洗脱。
重力柱的应用
注意事项
1. 细胞项目进行重力柱实验时可能会同时进行多根，为避免弄混样品， 一定要做好相应标记，摆放重力柱和上样液以及相应收集液的顺序要 一一对应。每完成一个收集液，立即做好标记，以免收集液过多混肴。 2. 细胞项目多为亲和层析，为防止非特异性吸附，样品里一定要加入尽 可能高浓度的NaCl以提高洗脱纯度；同时上样后的平衡液要尽可能加 大平衡的体积，以便冲洗掉非特异性吸附的杂蛋白。 3. 哺乳细胞表达的蛋白存在糖基化修饰问题，所以SDS-PAGE表观分子 量可能会偏大，或者有多条偏大的条带都有可能是目标蛋白，检测判 断时要注意辨别。
金属螯合层析色谱
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
破碎上清 流穿样品 洗脱样品1 MK 洗脱样品2 洗脱样品3 洗脱样品4
120KD 90KD 60KD
40KD 30KD 20KD
14KD
金属螯合层析色谱
注意事项
1. 咪唑在280nm处有吸收，当监测吸光度时，需要以洗脱缓冲液作为空 白。 2. 在较低的pH值的条件下，金属离子的丢失是非常明显的。如果是对同 样的蛋白质进行纯化，在每次纯化之间没有必要将柱子剥离，进行 5~10次纯化后，需要对色谱柱进行剥离和再充电。 3. NaOH和Ni2SO4会反应发生沉淀，需注意剥离Ni离子后才能冲洗NaOH。
MK 120KD 培养上清 流穿样品 洗脱样品1 洗脱样品2
90KD
60KD
40KD
30KD 20KD
金属螯合层析色谱
纯化示例2
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： 2SXA细胞培养后细胞破碎 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
重力柱的应用
分离操作SOP
His亲和标签实验流程 样品预处理：20ml培养上清加入20mM PB,500mM NaCl调节pH至7.5。 Buffer A：20mM PB,500mM NaCl, pH7.5 Buffer B：20mM PB,500mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5 根据样品中含有目标蛋白的量来确定使用的His柱类型（理论上1mlHis填 料至少可以结合10mg蛋白）：通常20ml细胞液用0.2ml填料的重力柱，如 果目标表达很好，可以增加填料体积，或改用1ml预装柱。用buffer A平衡 缓冲液处理。上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡buffer平衡柱子 （至少10ml）。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱，并分别 收集洗脱液。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液 （0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
胞内表达
1. 样品可以选择合适的缓冲体系。 1. 2. 完全去除培养基成分的影响， 2. 可以保存较长时间。 3. 细胞破碎后体积较小，回收时 3. 间短。
蛋白质A层析色谱
常用的亲和色谱层析：蛋白质A(Protein A Sepharose Fast Flow) 原理：蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合 IgG的Fc区域。作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，使得这 些区域可以结合游离的IgG分子。一分子的蛋白质A可以至少结合两分子的 IgG。
蛋白质A层析色谱
纯化示例
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
细胞培养液
MK 120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
流穿样品
洗脱样品
20KD
纯化分离的目的
去除表达产物中非目的基因表达的杂蛋白以及非蛋白组分的 杂质，以得到单一条带的目的蛋白。 去除内毒素；蛋白酶；核酸等污染物。 浓缩目的蛋白至较高的浓度。 保存目的蛋白到合适的缓冲液中，去除对蛋白质功能或保存 有影响的试剂。
纯化的方法
原则：利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染， 而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。 常用方法： 1. 色谱层析 2. 沉淀 3. 透析 4. 电泳 5. 差速离心
表达位置对层析的影响
表达位置
分泌表达
优点
1. 样品预处理简单。 2. 预处理过程短不会引入外源性 内毒素，一般不会对目标蛋白 结构造成破坏。 3. 大量杂质留在细胞内，样品成 分相对纯净。
缺点
1. 某些蛋白可能会受到培养基 成分的影响。 2. 培养基营养成分未完全消耗， 长时间放置容易感染细菌。 3. 样品体积较大，需要较长的 浓缩时间。 需要细胞破碎，离心等处理。 细胞破碎过程中易引入外源 性内毒素，破碎过程比较剧 烈，可能会破坏蛋白质结构。 细胞破碎后释放较多杂质， 增大纯化难度。
色谱层析
常用的色谱层析： 1. 免疫亲和色谱：蛋白质与特异性配基配对到色谱基质上， 且蛋白质与配基间具有可逆的相互作用。 2. 离子交换色谱：利用不同的蛋白质表面净电荷的差异进行 分离。 3. 疏水相互作用色谱：蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白质 与疏水层析介质疏表面可逆的相互作用来进行分离。 4. 凝胶过滤色谱：利用分子通过凝胶填料大小不同对其进行 分离。
14KD
蛋白质A层析色谱
注意事项
1. 样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。离心下来的上 清经过一个0.45μm的滤膜过滤。 2. 来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下， 可以结合到蛋白质A上。如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应 该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。 3. 对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要 向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘 氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。 4. 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子避免柱子 保存在低pH的环境中。
*组氨酸融合蛋白与Ni2+螯合后填料的结合示意
金属螯合层析色谱
分离操作
镍溶液：0.1M Ni2SO4 结合缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM磷酸纳，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 加入0.5个柱体积的0.1M Ni2SO4。 3. 用10倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 4. 上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 5. 用5~10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子。 6. 用5倍柱体积的较低咪唑浓度（50mM）的洗脱缓冲液进行预洗脱。 7. 重复步骤6，使用更高的咪唑浓度直到目的蛋白都被洗脱下来。 8. 用10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子，亲和柱可以进进行新一轮的纯化， 并且几乎不需要再次加载金属，如果是纯化用同样的HIS6标记的融合 蛋白。
重力柱的应用
装柱和分离过程
1. 2. 3. 4. 装入下筛板并用去离子水润洗空柱体。 接好下堵头，取合适体积的填料并用移液器吹打均匀，加入空柱体。 继续加入去离子水让填料沉降完全，装入上筛板。 保持一定的液面高度，盖上盖子完成装柱。
wenku.baidu.com
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2
3
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重力柱的应用
分离操作SOP
FC亲和标签实验流程 样品预处理： 20ml培养上清补加20mMPB，调pH至7.4. Buffer A：PBS, pH7.4 Buffer B：0.1M Glycine，pH3.0 Protein A填料载量比较低，1ml填料可以结合2mg左右FC标签蛋白，根据 表达量选用合适的Protein A亲和柱。（不可用NaOH来控内毒或者清洗） PBS平衡后上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡液平衡亲和柱（尽可 能提高平衡体积，至少10ml）。平衡后用buffer B洗脱，分别收集洗脱液。 洗脱液的收集管预先加入一定量的1M Tris，pH9.0调节pH值，洗脱完成后 用Buffer A重新平衡柱子。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
金属螯合层析色谱
常用的亲和色谱层析：金属螯合层析（Chelating Sepharose Fast Flow） 原理：螯合的Sepharose，当带有Ni2+离子时，如果形成氨基酸残基的复 合物，特别是组氨酸残基被暴露在蛋白质表面时，可以选择性的结合蛋白 质。(His)6融合蛋白可以很容易的结合到亲和柱上，然后用含有咪唑的缓 冲液进行洗脱。
重力柱的应用
注意事项
1. 细胞项目进行重力柱实验时可能会同时进行多根，为避免弄混样品， 一定要做好相应标记，摆放重力柱和上样液以及相应收集液的顺序要 一一对应。每完成一个收集液，立即做好标记，以免收集液过多混肴。 2. 细胞项目多为亲和层析，为防止非特异性吸附，样品里一定要加入尽 可能高浓度的NaCl以提高洗脱纯度；同时上样后的平衡液要尽可能加 大平衡的体积，以便冲洗掉非特异性吸附的杂蛋白。 3. 哺乳细胞表达的蛋白存在糖基化修饰问题，所以SDS-PAGE表观分子 量可能会偏大，或者有多条偏大的条带都有可能是目标蛋白，检测判 断时要注意辨别。
金属螯合层析色谱
纯化示例
120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
20KD
14KD
金属螯合层析色谱
纯化示例1
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： OTIG细胞培养上清 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
破碎上清 流穿样品 洗脱样品1 MK 洗脱样品2 洗脱样品3 洗脱样品4
120KD 90KD 60KD
40KD 30KD 20KD
14KD
金属螯合层析色谱
注意事项
1. 咪唑在280nm处有吸收，当监测吸光度时，需要以洗脱缓冲液作为空 白。 2. 在较低的pH值的条件下，金属离子的丢失是非常明显的。如果是对同 样的蛋白质进行纯化，在每次纯化之间没有必要将柱子剥离，进行 5~10次纯化后，需要对色谱柱进行剥离和再充电。 3. NaOH和Ni2SO4会反应发生沉淀，需注意剥离Ni离子后才能冲洗NaOH。
MK 120KD 培养上清 流穿样品 洗脱样品1 洗脱样品2
90KD
60KD
40KD
30KD 20KD
金属螯合层析色谱
纯化示例2
结合缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，pH7.4 洗脱缓冲液：20mM PB，0.25M NaCl，500mM咪唑，pH7.4 样品： 2SXA细胞培养后细胞破碎 层析柱： Chelating (Ni2+) S Fast Flow
重力柱的应用
分离操作SOP
His亲和标签实验流程 样品预处理：20ml培养上清加入20mM PB,500mM NaCl调节pH至7.5。 Buffer A：20mM PB,500mM NaCl, pH7.5 Buffer B：20mM PB,500mM NaCl,500mM Imizadole,pH7.5 根据样品中含有目标蛋白的量来确定使用的His柱类型（理论上1mlHis填 料至少可以结合10mg蛋白）：通常20ml细胞液用0.2ml填料的重力柱，如 果目标表达很好，可以增加填料体积，或改用1ml预装柱。用buffer A平衡 缓冲液处理。上样，收集流出液。上样完毕，再用平衡buffer平衡柱子 （至少10ml）。平衡后用含有50mM、500mM的咪唑缓冲液洗脱，并分别 收集洗脱液。 收集方法：0.2ml重力柱：每个梯度分开收集：0.2ml，0.8ml，0.5ml 0.5ml重力柱：每个梯度分开收集：0.5ml，1.5ml，1ml
*蛋白A的分子结构
*典型的IgG结构
蛋白质A层析色谱
分离操作
结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0 洗脱缓冲液：100mM甘氨酸/100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3.0 中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.0 1. 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。 2. 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。 3. 上样，流速为0.5ml/min（1ml的柱子），收集流穿片段。 4. 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合 物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。 5. 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱液立即用中和缓冲液 （0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。 6. 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
胞内表达
1. 样品可以选择合适的缓冲体系。 1. 2. 完全去除培养基成分的影响， 2. 可以保存较长时间。 3. 细胞破碎后体积较小，回收时 3. 间短。
蛋白质A层析色谱
常用的亲和色谱层析：蛋白质A(Protein A Sepharose Fast Flow) 原理：蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合 IgG的Fc区域。作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，使得这 些区域可以结合游离的IgG分子。一分子的蛋白质A可以至少结合两分子的 IgG。
蛋白质A层析色谱
纯化示例
结合缓冲液：PBS,pH7.4 洗脱缓冲液：0.1M Glycine,pH3.0 样品：ANTPD-A/ANTPD-B 层析柱：Protein A Sepharose Fast Flow
细胞培养液
MK 120KD 90KD 60KD 40KD 30KD
流穿样品
洗脱样品
20KD