双水相体系萃取(精)

双水相萃取技术

早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉,这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility,从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS。

传统的双水相体系是指双高聚物双水相体系,其成相机理是由于高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。可形成双水相体系的聚合物有很多,典型的聚合物双水相体系有聚乙二醇(polyethylene glycol,略作PEG/葡聚糖(dextran,聚丙二醇(polypropylene glycol/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose/葡聚糖等。另一类双水相体系是由聚合物/盐构成的。此类双水相体系一般采用聚乙二醇(polyethylene glycol作为其中一相成相物质,而盐相则多采用硫酸盐或者磷酸盐。

萃取原理

双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示:

K= C上/ C下

其中K为分配系数,C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。

分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。其分配情况服从分配定律,即,“在一定温度一定压强下,如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里,达到平衡后,该物质在两相中浓度比等于常数”,分离效果由分配系数来表征。

由于溶质在双水相系统两相间的分配时至少有四类物质在两个不同相系统共存,要分配的物质和各相组分之间的相互作用是个复杂的现象,它涉及到氢键、电荷相互作用、范德华力、疏水性相互作用以及空间效应等,因此,可以预料到溶质在双水相系统中两相间的分配取决于许多因素,它既与构成双水相系统组成化合物的分子量和化学特性有关,也与要分配物质的大小、化学特性和生物特性相关。

大量研究表明,生物分子在双水相系统中的实际分配是生物分子与双水相系统间静电作用、疏水作用、生物亲和作用等共同作用的结果,形式上可以将分配系数的对数值分解为几项:

InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc

式中,Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献;

Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献;

Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献;

Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献;

Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献;

Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。

值得指出的是,这些因素中虽然没有一个因素完全独立于其它因素,但一般来说,这些不同的因素或多或少是独立存在的。

影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等。

双水相的优势

A TPE作为一种新型的分离技术,对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势:

(1含水量高(70%--90%,在接近生理环境的体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;

(2可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质(或者酶,还能不经过破碎直接提取细胞内酶,省略了破碎或过滤等步骤;

(3分相时间短,自然分相时间一般为5min~15 min;

(4界面张力小(10-7~10-4mN/m,有助于两相之间的质量传递,界面与试管壁形成的接触角几乎是直角;

(5不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发物质,对人体无害;

(6大量杂质可与固体物质一同除去;

(7易于工艺放大和连续操作,与后续提纯工序可直接相连接,无需进行特殊处理;

(8操作条件温和,整个操作过程在常温常压下进行;

(9亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。

虽然该技术在应用方面已经取得了很大的进展,但几乎都是建立在实验的基础上,到目前为止还没能完全清楚地从理论上解释双水相系统的形成机理以及生物分子在系统中的分配机理。

应用

双水相萃取技术已广泛应用于生物化学、细胞生物学、生物化工和食品化工等领域,并取得了许多成功的范例,主要是分离蛋白质,酶,病毒,脊髓病毒和线病毒的纯化,核酸, DNA的分离,干扰素,细胞组织,抗生素,多糖,色素,抗体等。

此外双水相还可用于稀有金属/贵金属分离,传统的稀有金属/贵金属溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境,对人体有害,运行成本高,工艺复杂等缺点。双水相技术萃取技术引入到该领域,无疑是金属分离的一种新技术。

目前,用此法来提纯的酶已达数十种,其分离过程也达到相当规模,I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶,该酶主要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍数33;

双水相体系分类

高聚物/高聚物双水相体系

高聚物/无机盐双水相体系

低分子有机物/无机盐双水相体系

表面活性剂双水相体系