双水相萃取ppt
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双水相萃取详细资料PPT(44张)
（四）影响物质分配平衡的因素
主要有聚合物的分子量和浓度/pH/演的种类 和浓度/温度等。适当的选择各参数即在最 适条件下，可达到较高的分配系数和选择 性
成相聚合物的相对分子质 量
当聚合物相对分子质量降低时，蛋白质易 分配于富含该聚合物的相中。
例如：PEG/DX系统中当PEG的分子量降低时，会
双水相萃取
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形
成均相的高聚物水溶液
• 聚合物的不相容性：两种聚合物分子间存在斥力，在 达到平衡后，分成两相，两种聚合物分别进入到一相 中。
• 高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相容 性
• 高聚物与无机盐溶液也能形成两相，这是由于盐 析作用。
• 生化工程中，多应用聚乙二醇—-葡聚糖和聚乙二 醇-无机盐系统。
盐类的影响
在双水相聚合物系统中，加入电解质，首 先阴阳离子会有不同的分配。
盐的正负离子在两相间的分配系数不同， 由于各相应保持电中性，因而在两相中形 成电位差，这对带电生物大分子的分配， 产生很大的影响。
K-＞1 分配在上相 K+≈1 分配在下相
在pH6.9时溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。当 加入NaCl时，其浓度低 于50mmol/L时可见上 相电位低于下相电位， 使溶菌酶分配在。
只有当P和Q达到一定浓度才能形成两相
《双水相萃取技术》课件
影响因素
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料，如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ，如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全，穿戴 适当的实验服和护目镜， 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用，可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单，分离速度 快，可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质，对 环境友好，符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理，提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率，评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析，了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程，对于一些难以分离 的物质，如蛋白质、酶等，能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ，以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系，确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中，设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀，确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
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双水相萃取的原理及应用 ppt课件
羧甲基纤维素钠 丙醇
系
聚合TPE 的基本原理
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相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系
ppt课件
ATPE 的基本原理
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相图:相平衡时物系的组成, 温度与压力的关系
双节线(bi-nodal)： 图中的曲线。双节线 以下的区域为均相区, 以上的区域为两相区， 即ATPS 。 系线(tie line)： 双节线上连两点的直线。 K点： K点为临界点，表示两 相差别消失。
5）中草药成分的提取 甘草、银杏液、黄芩苷等的有效成分分离。 谢涛等利用 PEG 4000/ K2HPO4 组成的双水相体
系从三七中萃取三七皂苷,回收率为 96 %。
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ATPE 的应用
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双水相萃取的应用
5）中草药成分的提取 ( 1 )将 PEG和 K2HPO4 配成一定浓度的浓溶液; ( 2)在常温下, 取三七浓缩液置于10ml的离心试管中, 加入一定体积的成相物质浓溶液,振荡摇匀,在离心 机中以一定转速离心 5min, 使其分相;
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ATPE 的基本原理
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ATPE 的基本原理:
反胶团萃取：利用表面 活性剂在有机相中形成的 反胶团（reversed micelles），从而在有机 相内形成分散的亲水微环 境。
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ATPE 的基本原理
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ATPE 的基本原理:
反胶团萃取：使生物分子在有机相（萃取相） 内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了生物 分子，特别是蛋白质类生物活性物质难于溶解 在有机相中或在有机相中发生不可逆变性的现 象。 超临界萃取：
ppt课件
ATPE 的基本原理
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双水相萃取的应用
目前，用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程 也达到相当规模，I-Horng Pan等人利用PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分 离纯化β-木糖苷酶，该酶主要分配在下相，下相 酶活回收率96.3%，纯化倍数33。
双水相萃取(精选双水相萃取PPT,超级有用)概论
双水相萃取原理示意图
基本原理
双水相萃取与一般的水—有机物萃取的原理相似, 都 是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同, 物质进入双水相体系后, 由于 分子间的范德华力、疏水作用、分子间的氢键、分子与 分子之间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的浓度不 同, 从而达到分离的目的。
溶质(包括蛋白质等大分子物质、稀有金属以 及贵金属的络合物、中草药成分等)在双水相体系 中服从Nernst分配定律:
[3]Kula M R, Krone K H, Hustedt H. Advances in biochemical Engineering, edited by Fiechte A, Berlin, Heideberg, New York 1982,24:73~118 [4] Hustedt H, Krone K H, Menge U, et al. Protein recovery using aqueous twophasw system[J]. Trends in Biotechnol, 1985,31(6):139
在水溶液中，聚合物的长链分子通过氢键同周 围的水分子发生强烈地相互作用，每一个氧原子 结合两个水分子，使溶液中的PEG分子被一层高 度有序的水合作用层所包围。葡聚糖虽无与PEG 类似的结构，但同样，分子中的羟基通过氢键作 用在分子周围形成水分子层。
基本原理
某些水溶性聚合物溶液与某些盐溶液混合， 两者浓度达到一定值时，也会分为两相，形 成聚合物-盐双水相系统。机理不清楚。一 种解释为‘盐析’作用。
[12] Silva L H M dMeirelles A J .Protein Partitioning[J].J.Chem.Eng.Data,2001,46(2):251-255. [13] Salabat A,Abnosi M H,Motahari A.Investigation of Amino Acid Partitioning in Aqueous TwoPhase Systems Containing Polyethylene Glycol and Inorganic Salts[J].J.Chem.Eng.Data,2008,53(9):2018—2021.
双水相萃取ppt
4.2、蛋白质双水相萃取与酶促反应
Enzymetic reaction
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
enzyme
substrate
product
双水相萃取技术的发展趋势
解决易乳化、相分 离时间长、成相聚 合物的成本较高、 水溶性高聚物粘度 较大且不易定量控 制等问题
1
4
与其它技术结合 的多元化利用
3.1、 蛋白质双水相萃取体系常用聚合物
聚乙二醇 -葡聚糖
聚乙二醇 -磷酸盐
无毒原则
3.2、影响蛋白质分配系数的因素
两相的 两相溶 组成
液的比 例
聚合物的分子 质量、浓度、 极性及离子的 种类、浓度、 电荷等
温度、 蛋白质的 pH值 分子质量、等 电荷、极 性
在很大的浓度范围内，被 分离蛋白质的分配系数与 浓度无关，而与被分离蛋 白质的性质及选定的双水 相系统的性质有关
3 ）无机盐的循环
一种方法是将含磷酸钠的盐相冷却到6 ℃， 使盐结晶析出，然后用离心机分离收集；另一 种 是用电 渗析法 、膜分 离法回 收盐类 或除 去 PEG 相的盐。双水相萃取所用的设备一般都是 其他两相体系如水-有机溶剂体系所通用的设备， 商业化的混合器-沉淀器系统以及离心分离机已 成功应用于双水相萃取。用磁性分离等新技术 也可提高两相分离。尽管刚开始应用时，大多 数双水相萃取是间歇式的，但此技术更适合于 错流萃取的连续生产，这样可有效利用空间和 时间，尤其是在与其他分离技术如凝胶过滤、 膜分离等相结合使用时。
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双水相萃取技术的应用概 况及进展
姓名：白玮丽 学号：s1210002 专业：生物化工
Contents
《双水相萃取技术g》PPT课件
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11
1.2.2 疏水作用
PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水 性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点 处的分配系数maa测算
l酸的相对疏水性(relative hydrophobicity)， 是通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的，并设 疏水性最小的甘氨酸的RH＝0。所以上式中 B为
聚丙二醇、聚乙二醇 甲基纤维素
羧甲基纤维素钠盐
磷酸钾、硫酸铵、硫酸钠 硫酸镁、酒石酸钾钠
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5
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
图分别为PEG/葡萄糖(Dx)和精P选EpGpt/磷酸钾(KPi)系统的典型相图 6
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分 成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似 服从杠杆规则，即
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二 醇(polyethylene glycol,略作PEG)/葡聚糖 (dextran，略作Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纤维素 (methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采 用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富 含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合 物与无机盐的混合溶液也可形成双水相。
双水相萃取技术
1.1 双水相系统 1.2 双水相中的分配平衡 1.3 影响物质分配平衡的因素 1. 4 双水相系统的应用
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1
1.1 双水相系统
• 基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需 经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的 活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素 特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并 且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采 用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法 可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。
双水相萃取ppt
天然植物药用有效成分的分离与提取
中草药是我国医药宝库中的瑰宝 ,已有数千 年的历史 ,但由于天然植物中所含的化合物 众多 ,特别是中草药有效成分的确定和提取 技术发展缓慢 ,使我国传统中药难以进军国 际市场。因此 ,采用具有较高选择性和专一 性的双水相萃取技术对中草药有效成分的 提取是一项很有意义的工作。利用双水相 萃取中草药有效成分具有代表性的工作是 对黄岑甙和黄岑素的分离。
抗生素的分离与提取
数抗生素都存在于发酵液中 ,提取工艺路线复杂 ,能耗 高 ,提取过程易变性失活。而双水相萃取在抗生素中具 有较大的应用价值 ,萃取提取涉及到各类抗生素。β 内酰胺类抗生素是抗生素家族中应用最多的一类 ,主要 由青霉素类和头孢菌素类构成。对青霉素进行工业化意 义的双水相萃取是结合传统工艺溶媒萃取法进行的。先 以 PEG2000/ (NH4) 2SO4系统将青霉素从发酵液中提取 到 PEG相 ,后用醋酸丁酯(BA)进行反萃 ,再结晶 ,处理 1000ml 青霉素发酵液 ,得青霉素晶体 7. 228g ,纯度 84. 15 % ,三步操作总收率 76. 56 %。
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
第四章 萃取-双水相萃取.ppt.Convertor
第二节双水相萃取主要内容一、概述二、物质在两相中的分配三、双水相萃取工艺流程四、双水相萃取技术的应用一、概述过滤和离心技术（取决于分离颗粒的尺寸或密度差异）难于进行收集微生物的细胞器、分离除去细胞碎片、提取和浓缩胞内物质的操作。
萃取已广泛用于液液分离，但一般的有机溶剂萃取难于分离蛋白质：（1）许多蛋白质有极强的亲水性，不溶于有机溶剂；（2）蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
在一定条件下，水相也可形成两相甚至多相。
使将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中成为可能。
1、最早的双水相萃取现象:1896年Be jerinck，把明胶与琼脂或把明胶和可溶性淀粉的水溶液混合，可分为两相（大部分明胶/大部分琼脂），聚合物的“不相溶性”。
多种不相溶的聚合物可得到多相体系。
原因？（1）聚合物的空间阻碍作用，相互间无法渗透。
（2）聚合物与无机盐可形成聚合物-盐双水相。
2、双水相萃取的优势（见表，有一系列数据说明问题）3、双水相萃取的特点：(1) 条件温和，保留产物活性；(2) 含水量高，表面张力低，耗能少(3) 大分子及小分子（红霉素、氨基酸等）萃取；(4) 易于放大(5) 影响因素复杂；(6) 成本高4、两水相体系形成聚合物混合时，是分层或成一相，取决于两种因素：一是体系熵增加，表明系统混沌程度的量，与分子数量有关；二是分子间作用力，与分子量有关，分子量越大，分间作用力也越大。
分子之间作用力：（1）A-A >A-B 相分离（2）A-A<A-B 混合（3）A-B>>A-A凝聚复合5、两水相体系类型两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）6、相图（见课件中图）理解：双结线(TKB)；；结点(T/B)；临界点(K)；系线(TB)上相（T，轻相）；下相（B，重相）当M点下移时，系线长度缩短，两相差别减小，到K点时，系线长度为0，两相差别消失而成为一相。
《两水相萃取法》PPT课件
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当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别 减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
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双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
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三、分配理论
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如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物 的最佳方法。
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如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精 制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。
PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔 径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
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如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
实验可很方便地在10 ml有刻度的离心试管中进 行。如检定工作跟得上，则在几天内就可求得所需的 萃取条件。但有时液体粘度比较大，用吸管操作时容 易引起误差，需要注意。
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（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。
大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
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（六）、荷电PEG作为成相聚合物
生物分离工程-双水相萃取 66页PPT文档
醇沉法: 通过乙醇沉降发酵浓缩液，去除其中生物大分子 缺点：乙醇用量较大，且沉降过程中1,3-丙二醇损失
硫酸铵沉降法: 通过硫酸铵沉降去除发酵液中生物大分子 缺点：盐用量较多，1,3-丙二醇沉降过程中有损失
醇沉+硫酸铵沉降= 新型双水相萃取
萃取1,3-PD的双水相系统
实验材料： 有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等 无 机 盐：磷酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钠、 碳酸钠等
2 双水相体系的系线和相图的制作
在双水相体系组成成分确定以后,首先要配制双水相
体系, 而双水相体系的配制依据是体系的相图, 所以, 在配制双水相体系以前应先把该体系的相图(包括系线) 制作出来 以 PEG/(NH4)2SO4 体系为例: 从 PEG/(NH4)2SO4 的量可得出体系组成的质量分数,混合分相后,测出上相 和下相中PEG、(NH4)2SO4的含量, 由此可得到3个点即加 料点、上相点和下相点,然后调整PEG或(NH4)2SO4的量,重 将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线 连接起来组成双节曲线,而每1次的加料点、上相点和下 相点的连线则为系线。
85.1
3 9.99 10.26 0.031 322.3
93.1
93.8
95.1
99.8
85.9
表4. 2 在3000 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
KS
Y2,3-BD(%) Yacetoin(%) Rglucose(%) Rcells(%) R protein(%)
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
硫酸铵沉降法: 通过硫酸铵沉降去除发酵液中生物大分子 缺点：盐用量较多，1,3-丙二醇沉降过程中有损失
醇沉+硫酸铵沉降= 新型双水相萃取
萃取1,3-PD的双水相系统
实验材料： 有机溶剂：甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇等 无 机 盐：磷酸钾、磷酸氢二钾、硫酸铵、氯化钠、 碳酸钠等
2 双水相体系的系线和相图的制作
在双水相体系组成成分确定以后,首先要配制双水相
体系, 而双水相体系的配制依据是体系的相图, 所以, 在配制双水相体系以前应先把该体系的相图(包括系线) 制作出来 以 PEG/(NH4)2SO4 体系为例: 从 PEG/(NH4)2SO4 的量可得出体系组成的质量分数,混合分相后,测出上相 和下相中PEG、(NH4)2SO4的含量, 由此可得到3个点即加 料点、上相点和下相点,然后调整PEG或(NH4)2SO4的量,重 将得到的所有的上相点和下相点在坐标图上用光滑曲线 连接起来组成双节曲线,而每1次的加料点、上相点和下 相点的连线则为系线。
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表4. 2 在3000 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
KS
Y2,3-BD(%) Yacetoin(%) Rglucose(%) Rcells(%) R protein(%)
28.3和98.1% 乙醇/碳酸钠体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
15.1和94.3% 异丙醇/硫酸铵体系 发酵液中2,3-丁二醇的分配系数和回收率分别可达
生物工艺下游技术双水相萃取课件PPT
利用上式可确定不同ATPS的HF值.如 在pH = pI的ATPS中, pro的m0与HF值之 间呈线性关系, 则直线的斜率定义为该蛋 白质的HFS
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
图为蛋白质的m0与HF的实测关系图。 图的结果示：pro的HFS随NaCl浓度的增 大而增大。将盐对pro的HF影响上式得：
其中HFSsalt为盐增加而引起的HFS值增量。 因此，m的一般形式
系线： HF可通过测定疏水性已知的aa在其pI处的maa测算:
双节线上两点的直线。
双节线 均相区
临界点
两相区 系线
系线反映的信息
A 杠杆规则：系线上各点均 为分成组成相同，而体积 不同的两相。两相体积近 似服从杠杆规则
两水相萃取
杠杆定律 图中W0与NaCl浓度关系为:
这种现象在处理含细胞和固体微粒的料液时尤为严重,细胞或固体微粒容易集中在界面上,给萃取操作带来因难,但对于可溶性蛋白质.
RH-aa相对疏水性 是通过测定aa在水和已醇中溶解度的差别 确定的,并设疏水性最小的Gly的RH=0.所 以,上式中的B为:
mGAly 为TPGSl中y 分的配分系配系数数. 与所其以R, Hp值H=呈p线L 时性a关a系在, 直线的斜率就是该双水相系统的HF值.图 为测定实例.
Pro表面疏水性(HFS,
因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模 生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
其中双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术是近年来 出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可 以连续化，在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5 倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率 上还是成本上都要优越得多。
19.4 影响蛋白质m的综合因素
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双水相萃取原理
• 双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间 的选择性分配。当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后, 由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。物质在 双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下 • InK = InKm+InKe+In Kh+InKb+InKs+InKc 式中，Ke-----静电作用对溶质分配系数的贡献； Kh----- 疏水作用对溶质分配系数的贡献； Kb-----生物亲和作用对溶质分配系数的贡献； Ks----- 分子大小对溶质分配系数的贡献； Kc----- 分子构型影响对溶质分配系数的贡献； Km -----除上述因素外的其它因素影响对溶质分配系数的贡献。
双水相萃取技术
及其在生物医药上的应用ห้องสมุดไป่ตู้
双水相萃取技术
• • • • 双水相体系的概念与形成 双水相萃取原理 双水相萃取的技术特征 双水相萃取的工艺流程
双水相体系的概念与形成
• 传统的双水相体系是指双高聚物双水相 体系，其成相机理是由于高聚物分子的 空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形 成均一相，从而具有分离倾向，在一定 条件下即可分为二相。一般认为只要两 聚合物水溶液的憎水程度有所差异，混 合时就可发生相分离，且憎水程度相差 越大，相分离的倾向也就越大。
双水相萃取原则流程
连续双水相萃取
双水相萃取技术在生物医药上的应用
1.基因工程药物的分离与提取 2.酶工程药物的分离与提取 3.抗生素的分离与提取
4.天然植物药用有效成分的分离与提取
基因工程药物的分离与提取
目的的产物在转化液中的浓度很低 ,且对温度、 酸、碱和有机溶剂较敏感 ,容易失活和变性 ,若 以常规分离手段处理 ,产品的收率较低且纯度不 高 ,而双水相萃取技术可以保证产物在温和的条 件下得以分离和纯化。其中有代表性的工作是用 PEG4000/ 磷酸盐从重组大肠杆菌(E. Coli) 碎 片中提取人生长激素(hGH) ,采用三级错流连续 萃取 ,处理是为 15L/ h ,收率达 80 %。同样 , 用 PEG8000/ Na2SO4双水相系统从重组大肠杆菌 中分离 IGF - I,收率 90 %。
双水相体系相图
双水相萃取的技术特征
• • • • • • • • • • 含水量高(70％--90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性 物质失活或变性； 可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不 经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤； 分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min； 界面张力小(10-7～ 10-4mN／m)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形 成的接触角几乎是直角； 不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害； 大量杂质可与固体物质一同除去； 易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理； 操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行； 亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。 有生物适应性，组成双水相的高聚物及某些无机盐对生物活性物质无伤害，不会 引起生物物质失活或变性
酶工程药物的分离与提取
酶在医药方面的应用一是作为药用酶 ,二是用作化学合 成药物中的酶催化剂。迄今 ,双水相萃取技术已广泛应 用于生物大分子、细胞、细胞器、蛋白质、核酸、病毒、 细菌、蓝藻、叶绿素、线粒体、 菌体等的分离与提取 , 几乎所有的酶均可用此技术仅通过调节 pH、合物和盐的 种类或浓度 ,选择合适的分离条件就可进行理想的分离 纯化。目前双水相萃取技术已成功应用于已较大规模提 取纯化的酶有几十种 。其中成功地实现从微生物细胞碎 片中提取纯化甲酸脱氢酶 ,其分离经 4 次连续萃取 ,已 达处理 50kg 湿细胞规模 ,处理的酶蛋白含量已高达 150g ,收率为 90 %～100 % ,由于工艺简单 ,原材料成 本较低 ,产品的价格也有大幅度降低。
α 1 - 干扰素和β- 干扰素的提取则是双水相亲和萃取技术 的应用。提取α 1 - 干扰素是采用 PEG-磷酸酯/ 磷酸盐双 水相系统 ,经两次萃取从重组大肠杆菌匀浆液中提取 ,分 配系数达 155。较好的反萃取条件为 PEG- 磷酸酯、 酸 盐 pH6. 0 ,其技术优点是省去高速离心去除细胞碎片的步 骤 ,能耗较低 ,收率、 度均较高 ,最后α - 干扰素存在于磷 酸盐相 ,其中 PEG含量仅为 0. 5 %左右 ,这对进一步纯化 很有利。而采用 PEG- 磷酸酯/ 磷酸盐双水相可使β-干扰 素完全分配在上相 ,杂蛋白几乎全在下相 ,且β干扰素浓度 越高 ,分配系数越大 ,纯化因子高达350 ,收率 97 % ,用这一 技术与层析技术相结合组成了一套新的分离流程 ,已成功 地用于工业生产。
双水相萃取流程
• 无 机 盐 的 循 环 • PEG 的 循 环
• 目 的 产 物 的 萃 取
（1）目的产物的萃取：第一步细胞悬浮液经助磨剂破碎后， 与PEG和无机盐或葡聚糖在萃取器中混合，然后进入离心机分 相。第二步萃取是将目标蛋白质转入富盐相 ,方法是在上相中 加入盐 ,形成新的双水相体系 ,从而将蛋白质与 PEG分离 ,以 利于使用超滤或透析将 PEG的回收利用和目标产物的进一步加 工处理。若第一步萃取选择性不高 ,即上相中还含有较多杂蛋 白及一些核酸、 糖和色素等 ,可通过加入适量的盐 ,再次 形成 PEG/ 无机盐体系进行纯化。目标蛋白质仍留在 PEG相中。 (2) PEG的循环 ：在大规模双水相萃取过程中 ,成相材料的回 收和循环使用 ,不仅可以减少废水处理的费用 ,还可以节约化 学试剂 ,降低成本。PEG的回收有两种方法 ：一种是加入盐使 目标蛋白质转入富盐相来回收,另一种是将 PEG相通过离子交 换树脂 ,用洗脱剂先洗去 PEG,再洗出蛋白质。常用的方法是 将第一步萃取的 PEG相或除去部分蛋白质的 PEG相循环利用 (3)无机盐的循环 ：将含磷酸钠的盐相冷却 ,结晶 ,然后用离 心机分离收集其它方法有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去 PEG相的盐