动物分子生物学实验

实验一分子生物学仪器的使用及原理

一、实验目的

1.学习认识分子生物学实验室的仪器设备

2.了解分子生物学仪器设备使用的注意事项

二、主要仪器设备

1.普通离心机

2.无菌操作台

3.高速冷冻离心机

4.PCR仪

5.恒温振荡摇床

6.真空干燥箱

7.恒温水浴锅

8.紫外分光光度计

9.微波炉

10.微量移液器

11.Eppendorf管

12.高压灭菌锅

13.电泳仪

14.凝胶成像系统

15.紫外仪

三、实验报告要求

写出分子生物学主要仪器设备的使用注意事项

实验二：质粒（pEGFP-N1）的提取与酶切

一. 实验目的

1.了解碱裂解法提取质粒的基本原理和主要应用，掌握碱裂解法提取质粒的实验方法和各种试剂在提取过程中的作用。

二. 实验原理

碱裂解法是利用细菌染色体DNA与质粒DNA结构的大小差异来分离质粒DNA的。碱性（pH 12.0～12.5）条件可以破坏碱基配对，宿主和质粒DNA的碱基之间的氢键被破坏。当条件恢复正常时（加入酸性试剂中和），共价闭合环状的质粒DNA会迅速准确地恢复配对，重新形成完全天然的超螺旋分子；而较大的细菌染色体DNA分子则难以复性，会交联形成不溶于水的线团结构，缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇沉淀、70 %乙醇洗涤即可获得质粒DNA。

三. 仪器设备

微量取液器（2 μL；20 μL；200 μL；1 000 μL），tip头，手掌型离心机，1.5 mL 离心管, 恒温水浴，制冰机，超净工作台，恒温培养箱。振荡器，离心机，金属浴，电泳仪，凝胶成像仪。

四．实验试剂

1.溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖；20 mmol/L Tris·HCl（pH = 8.0）；10 mmol/L EDTA（pH=8.0），高压蒸汽灭菌（121 ℃，0.105 Mpa）20 min。4 ℃贮存。

2.溶液Ⅱ（现用现配）：0.2 mol/L NaOH；1 g / L SDS。

3.溶液Ⅲ（pH

4.8）：每100 mL溶液中含5 mol/L乙酸钾60 mL；冰乙酸11.5 mL；H2O 28.5 mL。

4.RNase（10 mg / mL），LB液体培养基，氨苄青霉素，异丙醇，70 %（V / V）乙醇，无菌水。

五.实验步骤：

1.提取步骤：

1) 挑取LB固体培养基上生长的单菌落，接种于3-5mlLB（含氨苄）液体培养基中，37℃振荡培养12-14小时。

2) 取上述培养物移入1.5mlep管中，室温以8000r/min离心5分钟，弃上清，再加1.5ml上述培养养物于ep管中，室温以8000r/min再离心5分钟。

3) 弃上清液，将离心管倒置，使液体尽可能流尽。

4) 加溶液Ⅰ100μl，用力弹ep管，使菌体分散均匀；加溶液Ⅱ200μl，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离心ep管放置于冰上5分钟，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液逐渐变清）。

5) 加入150μl预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀，可在冰上放置10分钟。（溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒DNA复性，染色体和蛋白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使SDS-蛋白复合物沉淀。）然后，室温以12000r/min离心5分钟。

6) 抽取上清液于一新微量离心管（ep管）中，加无水乙醇900μl，冰浴20分钟，室温以13000r/min离心10分钟，放入净化工作台用风机吹干，加TE，定容至30μl，再加RNA酶5μl，37℃水浴30分钟。（-20℃保存备用）

酶切步骤：

1) 制胶：1%琼脂糖电泳：琼脂糖0.5克，TBE50毫升放电炉上使之融化，温度降到50摄氏度时加入EB冷凝后倒胶，30分钟后凝固，拔去梳子。

2) 加样：取已转化的感受态细胞溶液10微升，再加5微升上样液。

3) 电泳：电压40V和电流50mA 条件下，50分钟后用紫外灯观察（有无条带），若有条带跑出，进行抽提。

①加TE400微升、酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）400微升，用力弹匀。室温下，12500rpm离心10分钟。观察到液体分三层，取上层液于一新灭菌过的EP管中，再加氯仿400微升，然后室温下，12500rpm离心10分钟。

②取上清液，加无水乙醇900—1000微升、乙酸铵100微升，用力震荡。-20摄氏度下放置1-1.5小时，然后室温下，13000rpm离心5-10分钟。

③弃去上清液，加75%的酒精混匀。室温下，12500rpm离心5分钟。

④弃去上清，把EP管放入净化工作台用风机吹干后，用TE定容至30微升。

4) 酶切：30微升体系取上述液体15微升，加

多组分缓冲液 3微升

BSA 3微升

灭菌超纯水 7微升

HINDIII和BamHI 各1微升

以上操作皆在冰上，操作完后37摄氏度水浴3—4小时。

六、实验结果：

1.质粒提取过程中实验操作的注意事项。

2.质粒酶切过程中实验操作的注意事项。

实验三：PCR基因扩增

一、实验目的：

通过本实验学习PCR反应的基本原理和试验技术。

二、实验原理：

多聚酶链式反应的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。

1.变性：加热使模板DNA在高温下（94摄氏度）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2.退火：使溶液温度降低至50-60摄氏度，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。

3.延伸：溶液反应温度升至72摄氏度，耐热的DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的指导下，利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸，按5’-3’的方向复制出互补的DNA，即引物的延伸阶段。

上述三步为一个循环，即高温变性，低温退火、高温延伸三个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可以作为下一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可以扩增10的6次方-10的9次方。典型的PCR反应体系右如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热的Taq聚合酶。

三、试验所需器材和试剂

仪器：

1.PCR热循环仪

2.琼脂糖凝胶电泳系统

材料：

1.DNA模板（1400bp），

2.两个合成的DNA引物，

3.四种dNTP，

4.MgCl2，

5.琼脂糖，

6.DNA 相对分子质量标准，7、吸头，8.小指管。

试剂：

1.10*反应缓冲液；500mmol/L KCL、100mmol/L Tris-cl (PH 8.3)、15mmol/LMgCl2、0.1%的明胶。

2.4*dNTP 各1mmol/l

3.耐热的Taq聚合酶 1U/ul

4.DNA模板 1ng/ul

5.引物（浓度为 10 pmol/ul ）

上游：5'CCCaagcttGATCACTGTCCTTCTGCCAT3'

下游：5'CGggatccCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGC3'

四、实验步骤：

1.在0.5ml的ep管内配制25ul反应体系：

反应物体积（ul）

ddH

O 13.8

2

10*PCR缓冲液 2.5

2.5mmol/ldNTP 2.0

1.2

25mmol/l Mgcl

2

上游引物 1.5

下游引物 1.5

Taq 酶 0.5