叶下珠提取物对急性乙型肝炎小鼠乙型肝炎病毒复制及其抗原表达的影响

叶下珠提取物对急性乙型肝炎小鼠乙型肝炎病毒复制及其抗原表达的影响目的观察叶下珠提取物在小鼠急性乙型肝炎病毒（HBV）感染模型中对HBV复制及其抗原表达的影响。

方法C57b/6小鼠尾静脉注射1.3倍HBV真核表达质粒（pHBV1.3），20 μg/只，建立小鼠急性HBV感染模型。

实验小鼠随机分为正常组、病毒组及中药高、中、低剂量组，感染后第1日起，给药组分别给予相应剂量药物灌胃，连续3 d。

感染后第4日，化学发光法检测血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎e抗原（HBeAg）水平，PCR检测血清HBV-DNA 含量；免疫组化法检测肝组织乙型肝炎核心抗原（HBcAg）、HBsAg表达。

结果中药各剂量组均能明显降低感染小鼠血清中HBsAg、HBeAg含量，与病毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；中药高剂量组显著降低血清中HBV-DNA水平，与病毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01），中药中、低剂量组血清HBV-DNA 含量降低，但与病毒组比较差异无统计学意义（P>0.05）；中药高剂量组明显抑制了肝组织了HBcAg及HBsAg的表达（P＜0.05）。

结论叶下珠提取物明显抑制小鼠急性HBV感染模型小鼠HBV的复制与表达，具有直接抗病毒作用。

标签：叶下珠提取物；乙型肝炎病毒；复制；表达；水动力法；小鼠乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是危害人类健康的重要致病因子，HBV感染所致的慢性乙型肝炎常常会发展成为肝纤维化、肝硬化甚至肝癌，导致全球每年约有100万人死于乙肝相关疾病[1]。

我国是HBV感染的高发区，有效的抗HBV感染的治疗在全世界尤其在我国显得尤为迫切[2]。

目前对HBV感染的治疗主要依赖于非特异性的治疗药物如干扰素和核苷类似物，但由于不良反应较大、病毒变异逃逸等问题，治疗效果不很理想。

叶下珠是近年来发现可抗HBV感染的中药，具有直接抑制病毒蛋白表达、降低病毒滴度的作用，是为数不多的能够具有直接抗病毒作用的药物，且抗HBV-DNA的效果优于虎杖、五味子等中药[3]。

我们的前期研究也在HBV体外瞬时转染细胞系中，检测到叶下珠水提物能剂量依赖性地抑制HBV-DNA复制及乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、乙型肝炎核心抗原（HBcAg）表达。

为了进一步明确叶下珠在体内模型中的抗病毒作用，本实验运用高压水动力法建立了小鼠急性HBV感染模型，在此基础上观察叶下珠提取物对HBV复制及其抗原表达的影响，从而进一步明确叶下珠的抗病毒作用，为其临床运用提供依据。

1 实验材料1.1 质粒与动物pHBV1.3为含1.3倍HBV ayw型全基因组真核表达载体，重庆医科大学感染性疾病分子生物学实验室馈赠。

C57b/6小鼠30只，7～9周龄，雌性，体质量18～20 g，清洁级，重庆医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK20120001。

1.2 药物叶下珠醇提物，外观为棕色粉末，西安金绿生物工程技术有限公司制备并提供质检报告，批号BW2012013B，由西北大学生命科学院检测符合2010年版《中华人民共和国药典》标准。

1.3 主要试剂与仪器去内毒素的质粒大量提取试剂盒（德国Qiagen公司），HBsAg Ⅱ和乙型肝炎e抗原（HBeAg）检测试剂盒、HBV核酸定量检测试剂盒（德国Roche公司），鼠抗人- HBs单克隆抗体、兔抗人-HBc多克隆抗体、DAB检测试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）。

电化学发光全自动免疫分析仪cobas E601、480 PCR 扩增仪（德国Roche公司）。

2 实验方法2.1 药物制备叶下珠全草，采自川西大雪山，购自安徽亳州药材市场，清洗2遍后脱水烘干，粉碎过40目筛后直接投料；50%乙醇、60 ℃提取2 h，共提取3次，用板匡（滤网规格300目）过滤后，常压浓缩，制得流浸膏；粉碎机粉碎喷粉，添加辅料糊精混合，使用不锈钢磁体筛网80目过筛，超高温灭菌消毒，薄层色谱硅胶板检测药材斑点进行质量控制。

最终的提取物每克相当于原药材3 g。

称量药物粉末，溶于灭菌的PBS中，配成0.5、0.25、0.125 g/mL的药物溶液。

2.2 造模与分组5 s内尾静脉高压注射pHBV1.3质粒20 μg/只（溶于1.6 mL PBS缓冲液中），建立小鼠急性HBV感染模型。

小鼠随机分为5组，每组6只。

正常组注射PBS 缓冲液1.6 mL/只；病毒组注射pHBV1.3 20 μg/只；中药高、中、低剂量组，在注射pHBV1.3后第1日，分别予叶下珠提取物0.5、0.25、0.125 g/mL 1 mL灌胃，连续3 d。

2.3 血清乙型肝炎表面抗原、e抗原含量测定感染后第4日，摘除小鼠眼球取血，孵出血清后，电化学发光法检测血清中HBsAg、HBeAg含量，临界值指数（COI）<1为阴性。

2.4 血清乙型肝炎病毒DNA含量测定感染后第4日，摘眼球取血，PCR荧光探针法检测血清中HBV-DNA水平，PCR扩增仪扩增，Fosun复星诊断，按HBV核酸定量检测试剂盒说明操作。

2.5 肝组织乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎病毒表面抗原表达测定感染后第4日，断颈处死小鼠，剪开腹腔，取出肝脏，用锋利刀片切取5 mm×6 mm大小的组织块，4%多聚甲醛固定后，常规石蜡切片，分别孵育鼠抗人- HBs （稀释度1∶100）、兔抗人-HBc（稀释度1∶50）后，按DAB检测试剂盒操作，组织切片予苏木素染色。

采集图像，镜下观察并计数。

3 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行分析。

实验数据均以—x±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间均数比较用t检验。

P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果4.1 小鼠急性乙型肝炎病毒感染模型的建立与鉴定水动力法注射pHBV1.3后第1、4、7日进行检测，小鼠血清HBsAg含量分别为20.21±1.86、14.11±1.20、4.62±0.89，说明小鼠感染模型建立成功，HBsAg 在注射后第1日表达量最高，然后逐渐降低，感染后第10日检测HBsAg为阴性。

4.2 叶下珠提取物对血清乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎e抗原和乙型肝炎病毒DNA含量的影响感染后第4日（用药3 d后），中药各剂量组血清HBsAg含量明显降低，与病毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；药物对HBsAg的降低作用随药物浓度升高而增加，高剂量组HBsAg降低至阴性表达。

病毒组HBeAg呈阳性表达，中药各剂量组HBeAg均阴性表达。

中药各剂量组血清HBeAg水平明显降低，与病毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

中药各剂量组均降低了感染后HBV-DNA含量，但仅高剂量组HBV- DNA含量与病毒组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

结果见表1。

4.3 叶下珠提取物对肝组织乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎病毒表面抗原表达的影响HBcAg是病毒在肝脏中复制的指标，免疫组化显示其在肝细胞的胞核、胞浆中均有表达，与病毒组比较，中药高剂量组肝组织HBcAg表达量明显降低（P ＜0.05），中药中、低剂量组变化不明显，与正常组相似，见图1。

HBsAg表达在肝细胞胞浆中，与病毒组比较，中药高剂量组中HBcAg表达量明显降低（P ＜0.05），中药中、低剂量组变化不明显，见图2。

5 讨论HBV感染细胞及动物模型是研究HBV的主要途径，由于HBV感染的高度种属特异性，其感染模型的建立是HBV研究中的难点。

一直以来，HBV研究受到缺乏合适的动物感染模型的限制。

土拨鼠肝炎病毒（WHV）慢性感染的土拨鼠和鸭乙肝病毒（DHBV）感染的北京鸭是常用的研究HBV的体内模型，但其局限在于感染的肝炎病毒为WHV或DHBV，与HBV有一定差异，使对乙型肝炎的发病机理和机体应答的研究受到限制。

而HBV转基因小鼠的病毒基因均是整合在宿主染色体上的，没有经过和靶细胞受体结合穿透的过程，与自然感染不同，无法检测到细胞内cccDNA，应用也受到限制。

因此，在体内模型方面，需要建立类似于HBV自然感染的动物模型，以解析药物对HBV复制及表达的影响。

而水动力法小鼠乙肝模型的建立，为人们建立跨种属的HBV体内模型提供了新的思路，是目前研究miRNA作用中常用的体内动物模型[4]。

1999年，Zhang 等[5]提出可通过尾静脉注射含HBV全基因组的裸质粒使外源基因在小鼠肝细胞内高表达，这种转染外源质粒的方法又称为水动力法。

我们曾在水动力法小鼠乙肝模型上，成功观察了RNA干扰对HBV复制的抑制作用[6]。

因此，本课题采用水动力法乙肝小鼠为体内模型，观察叶下珠提取物体内抗病毒效果。

前期实验表明，pHBV1.3在体外HepG2细胞系及小鼠体内模型中，能有效地启动HBV的复制，具有肝细胞特异性[7-8]。

本实验利用高压水动力法将pHBV1.3导入小鼠体内建立急性HBV感染模型，C57b/6小鼠感染率为100%。

在小鼠急性HBV感染的模型中，宿主对HBV的感染是一急性自限性的过程，C57b/6小鼠尾静脉注射pHBV1.3 20 μg后第1日HBsAg表达量最高，持续4 d 高表达后逐渐降低，第7日仍有阳性表达。

考虑到药物作用时间，我们选择感染后第4日观察叶下珠提取物对HBV复制、表达的影响。

结果表明，中药各剂量组均有效抑制了血清HBsAg的表达，中药高剂量组血清HBsAg表达为阴性；中药各剂量组均明显降低了HBeAg的表达至阴性，可能与本模型中HBeAg的表达量较低有关。

定量检测HBV-DNA的结果表明，中药各剂量组均可降低血清中HBV-DNA的水平，其中中药高剂量组对HBV-DNA的抑制最明显，与病毒组比较差异有统计学意义。

肝组织内HBcAg表达是HBV复制的标志，因此，我们运用免疫组化法检测了叶下珠提取物对小鼠肝组织中HBcAg的表达，结果表明药物对肝细胞内HBcAg的表达显示出明显的抑制作用，同样，药物也明显降低了肝组织中HBsAg的表达。

综上，本实验结果表明，叶下珠提取物在体内HBV 感染的小鼠急性肝炎模型中能明显抑制病毒的复制与表达，具有明确抗病毒作用。

目前，叶下珠抗HBV感染作用是中药治疗乙肝中研究的热点，国内不同产地、品种的叶下珠属植物提取物均有抗HBV作用[9]。

以叶下珠为主要成分的复方制剂，如复方苦味叶下珠胶囊、叶下珠复方等，均显示了较好的临床疗效[10-11]。

本实验为叶下珠提取物及其复方制剂用于临床治疗乙肝提供了实验依据，并为进一步研究叶下珠及其提取物抗病毒作用的具体环节和分子机制提供了良好的基础。

参考文献：[1] Neuveut C，Wei Y，Buendia MA. Mechanisms of HBV-related hepatocarcinogenesis[J]. J Hepatol，2010，52（4）：594-604.[2] Férir G，Kaptein S，Neyts J，et al. Antiviral treatment of chronic hepatitisB virus infections：the past，the present and the future[J]. Rev Med Virol，2008，18（1）：19-34.[3] 米志宝，张习坦，陈鸿珊，等.中草药抗鸭乙肝病毒的效果[J].中西医结合肝病杂志，1994，4（4）：24.。