第8章 动物基因工程
动物遗传学 第十一章 动物基因工程
3、质粒的拷贝数：高拷贝质 粒可以有10～100个拷贝，低 拷贝只有1～4个拷贝。
4、质粒的不亲和性：也称不 相容性，两种或两种以上亲缘 关系密切的不同质粒不能够在 同一宿主细胞中稳定地共存。
5、质粒的宿主范围：窄宿主范围质粒(只能在一种特 定的宿主细胞中复制)和广宿主范围质粒(复制起始点 不特异，可以在许多细菌细胞中复制)。
SV40病毒
1、优点
基因组是由5224bp 构成的双链、共价闭 合的DNA小分子；
其复制和转录已很 清楚； 感染率高，每细胞感染病毒的量也很多；
DNA复制的量大，能产生大量外源基因所编码的蛋 白质；
能提供完整的真核基因转录所需的成分。
2、对猴细胞的裂解侵染
初期：在侵染的最初8h， 病毒颗粒去掉外壳，DNA 向寄主细胞核移动；
基因组DNA文库(genomic DNA library)：是指一个 包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。 基因组文库构建的基本步骤： ①细胞染色体大分子DNA的提取和大小片段的制备； ②载体DNA的制备； ③载体与外源大片段连接； ④体外包装及基因组DNA文库的扩增； ⑤重组DNA的筛选和鉴定。
λ噬菌体两种生长途径
溶菌性生长
溶源性生长
三、科斯质粒(Cosmid)
由DNA的Cos区与质粒 构建，容量35～40kb，又 叫粘性质粒。 环状双链DNA。 特点：①含质粒的抗性 标记如Amp，Tet；②带 Cos 区 ， 可 进 行 体 外 包 装 ；③一个或多个酶切位点 ；④分子量小，容量大/筛 选AP平板。
第8章动物细胞培养制药工艺-2
2、悬浮培养
细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长 的培养过程。
优点：操作简单，培养条件相对均一，传 质和传氧较好，容易放大培养。
缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易 失去标记而降低免疫能力。
适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂 交瘤
借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细 胞的特性。
8.3.3 培养基质量的控制
培养用水质 缓冲液 生理盐水和平衡盐溶液 其他成分配置
1、培养用水质
必须适用纯净水配置培养基 水存放时间不宜超过2周 普通水必须除去各类元素、有毒或有害物
质及微生物和热源，达到纯净水标准。
2、缓冲液
弱酸与弱酸盐：碳酸/碳酸氢钠体系 弱碱与弱碱盐：磷酸二氢钠/磷酸氢二钠体
优点：容易更换全部培养液，如从血清培养基到 无血清培养基；可改变培养液与细胞的比例；容 易灌注培养，高密度和产物分泌表达。
缺点：需要更大空间；细胞活性无法检测ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ过程 参数检测和控制困难；放大困难而且昂贵。
最初采用滚瓶培养，现仍用于疫苗等生产。
•非贴壁细胞处于悬浮状态；而贴壁细胞则 在瓶内壁上贴附生长形成单层细胞。 •优点：表比面积增加，处于衡态转动，增 加气体交换。 •缺点：劳动强度大，操作较繁杂，占用空 间体积大，产量低，不宜控制和监测培养 环境变化。
一般培养液中含量为1~4mmol/L
八年级生物下册-第5单元基因工程(课件)济南版
03
生物信息学对基因工程的贡献
通过生物信息学分析，可以更加准确地了解基因的结构和功能，为基因
工程提供更加精确的设计方案。
数据库资源利用和数据分析方法
数据库资源
包括基因序列数据库、蛋白质结构数据库、代谢途径数据库等，为基因工程提供丰富的数据资源 。
数据分析方法
包括序列比对、聚类分析、主成分分析、代谢组学分析等，用于挖掘基因工程数据中的有用信息 。
转基因技术在农业、医学等领域应用实例
农业领域应用实例
抗虫棉、抗病水稻、抗旱玉米等转基因作物的培育和推广，提高了作物的产量和品质，减少了农药的使用量，降 低了农业生产成本。
医学领域应用实例
利用转基因技术生产重组蛋白药物、基因工程疫苗等，为疾病治疗提供了新的手段和方法。同时，转基因动物模 型的建立也为医学研究提供了重要的实验材料。
载体选择与构建
载体类型
01
常用的基因工程载体包括质粒、噬菌体、病毒等，根据实验需
求选择合适的载体。
载体构建
02
对载体进行改造，如添加启动子、终止子、选择标记等，以便
于外源基因的插入和表达。
载体与外源基因的连接
03
通过DNA连接酶将外源基因与载体连接起来，形成重组载体。
转化与筛选方法
转化方法
将重组载体导入受体细胞的方法包括化学转化、电转化、基 因枪等。
第七章动物基因工程
第七章动物基因工程
世界第一只转基因动物：转入生长激素基因的小鼠
世界首只转基因灵长类动物——安迪
2001年１月１１日，美国科学家宣布培育出了世界上首只转基因猴“安迪”。此项成果将为人类最终战胜糖尿病、乳腺癌、帕金森氏症和艾滋病等顽症提供帮助。
在“安迪”体内的是一种绿色荧光蛋白（ＧＦＰ）标志基因。研究人员共对２２４只猴子的卵母细胞进行了转基因处理，接着对挑选出的４０个转基因卵母细胞进行人工授精，然后把这４０个受精卵分别植入２０只代孕猴妈妈的子宫中，结果共有５只猴妈妈怀孕。但其中有三只小猴不幸夭折，还有一只未获成功，只有“安迪”不仅产下后身体健康，而且转基因特征明显。
转入荧光蛋白基因的兔子和鼠
2000年，法国科学家利用基因技术“制造”出了一只可以发出绿色荧光的兔子“Alba”。应用了受精卵显微注射技术，从水母身上采集了荧光蛋白，基因改良后，使它的发光率比原先提高了两倍，再将该基因植入到了兔子的受精卵中，由此培养出了会发光的兔子Alba。
第一节动物基因转移的选择标记
一、嘌呤和嘧啶的生物合成
嘌呤核苷酸生物合成途径
从头合成途径
5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）AMP、GMP
补救合成途径：次黄嘌呤核苷（HR）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）、GMP
嘧啶核苷酸生物合成途径
从头合成途径
尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）
补救合成途径
胸腺嘧啶核苷（TR）胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）
二、胸腺激酶基因选择系统
选择TK+细胞的培养基含有次黄嘌呤(hypoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷(thymidne)，所以叫做HAT选择法。
第8章分子克隆与基因工程
第8章
分子克隆与基因工程
基因本身就是一个产业
•Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）
•Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）
•Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司
（1998年9月）
转让225种基因的开发权
种基因的开发权（
基因工程试剂的高回报
•碱性成纤维细胞生长因子231元/ug •红细胞生成素1072元/ug •白细胞介素-2 410元/ug •巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug •胰岛素10.2元/mg
基因工程的概念
从某种生物基因组中分离感兴趣的基因从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，，或是用人工合成的方法获取基因或是用人工合成的方法获取基因，，利用DNA 体外重组体外重组，，经过一系列切割经过一系列切割，，加工修饰，连接反应形成重组DNA 分子分子，，再将其转入适当的受体细胞转入适当的受体细胞，，以期获得基因表达的过程.
基因工程技术及其应用
供体细胞
目的基因
载体
重组DNA分子
转化细胞
受体细胞
多肽药物疫苗、抗体基因治疗基因诊断 转基因动物(畜牧业、渔业 生物反应器)转基因植物(农业、林业 生物反应器)
冶金、环保轻工、食品
基因工程(gene engineering)常和以下名称混用:•遗传工程(genetic engineering);
•基因克隆(gene cloning);
•分子克隆(molecular cloning);
•基因操作(gene manipulation);
•重组DNA技术(recombination DNA technique)
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题
题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论
1.名词解释：
基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?
3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？
基础研究：
基因工程克隆载体的研究
基因工程受体系统的研究
目的基因的研究
基因工程工具酶的研究
基因工程新技术的研究
应用研究：
基因工程药物研究
转基因动植物的研究
在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究
第二章基因克隆的工具酶
1.名词解释：
限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
大学《基因工程学》教学大纲
《基因工程学》课程教学大纲
（Genetic Engineering）
一、课程说明
课程编码：02200200
课程总学时（理论总学时/实践总学时）：48（48/0）
周学时（理论学时/实践学时）：4（4/0）
学分：3
1．课程性质：
专业必修课。
2．适用专业与学时分配：
适用生物技术专业。
教学内容与学时分配
3．课程教学目的与要求：
本课程的授课对象是生物技术专业的本科生。
课程简介：
《基因工程》是生物技术专业的专业必修课程。其以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段而建立起来的一门技术学科。基因工程兴起于20世纪70年代初，它的问世带动了生物技术的兴起和发展，是现代生物技术的核心内容。基因工程课程的主要内容包括基因的分离、基因的克隆、基因的表达、植物基因工程、动物基因工程、药物基因工程和基因治疗等。它是生命科学学院生物技术专业本科生的主干专业课程之一，它是生物工程（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程）中最重要的课程，其它三大工程是建立在基因工程基础之上的，同时也为生物技术制药等后继学科奠定了重要的理论基础。
课程目标：
设置本课程是为了让生物技术专业的学生理解和掌握基因工程的技术原理，通过本课程学习，掌握基因操作的工具酶，基因克隆常用载体，目的基因的分离与合成，重组体的构建，重组体向宿主细胞的导入，重组体克隆的筛选与鉴定以及克隆基因的表达，同时了解基因工程在生物学领域中的应用与发展前景。对学生达到毕业要求贡献如下：
1）了解基因工程学的历史、发展和前沿知识。
2）掌握基因工程学的基础理论、基本知识和基本技能；
第八章基因工程与体外表达
因此，当载体的多克隆位点没有插入外 源DNA片段时，α互补能正常进行，产生有活 性的β-半乳糖苷酶。 能使人工底物X-gal变 成蓝色, 产生蓝色菌斑或菌落。如果载体的多 克隆位点插入了外源DNA片段，导致产生无α 互补能力的氨基端片段, 带重组体的细菌形成 白色菌斑或菌落。
55
（二） 免疫学方法 如果克隆基因的产物是已知的，并且
有聚合酶活性 有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
8
9
10
11
2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of
DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
21
22
第二节
基因克隆的载体
质粒、噬菌体、粘粒、病毒载体
23
一、质粒（plasmid） 质粒是存在于多数细菌和某些真核
生物染色体外的双链环状的DNA分子。
质粒含有复制起始点，此复制起始点 与其他一些顺式调控因子构成复制子，能 利用细菌染色体DNA复制和转录的同一套 酶系统，在细菌体内独立地进行自我复制 及转录。
（四） PCR技术 PCR技术具有高度的灵敏度和特异
性，能在极短的时间内将目的基因扩增至 数百万倍，通过琼脂糖凝胶电泳，可直接 观察到产物的存在。
基因工程总结
基 因 工 程
第一章 绪论
基因工程的诞生
Boyer-Cohen 实验,1973年斯坦福大学的S. Cohen 小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5
质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。
第一次成功的实现了基因克隆实验。
基因工程：是在体外将核酸分子插入病毒、质粒、或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先
没有这类分子的寄主细胞内，而能持续的繁殖。
遗传工程：指以改变生物有机体性状特征为目标的遗传信息量的操作。
它包括常规的选择育种、基因工程等不同的技术层次，它的范围广泛。
基因工程诞生的基础:
理论基础：1、遗传物质基础问题: 基因的分子载体是DNA 而不是蛋白质
1944年Avery 等人在肺炎链球菌转化实验：发现遗传信息的携带者是DNA 而不是蛋白质；
1952年Alfred Hershy 和Marsha Chase 进一步证明遗传物质是DNA 。
2、基因的自我复制和传递问题： DNA 分子的双螺旋结构模型； 半保留复制机制 1953年
Watson 和Crick 在FranKlin 和Wilkins 的X 射线工作的基础上提出了DNA 分子结
构的双螺旋模型； 1958年Meselson 和Stahl 提出了DNA 半保留复制模型
3、遗传信息的流向和表达问题： 中心法则、操纵子学说、遗传密码的破译
1960年Ochoa 发现中心法则
1961年Nirenberg 破译了遗传密码；
1961年Jacob 和Monod 提出了调节基因的操作子模型
课程标准
《基因工程》课程标准
课程编号：09060281
课程类别：必修
课程学时：56（理论32，实验24）
学分：3学分
一、课程的性质和任务
基因工程是获取、整理、破译、编辑和表达生物体遗传信息（基因）的一种操作平台与技术，它以细胞生物学、分子生物学和分子遗传学的基本理论体系为指导，在基因的分离克隆、基因表达调控机制的诠释、基因编码产物的产业化、生物遗传性状的改良乃至基因治疗等方面正日益显示出愈来愈高的实用价值。本课程的主要内容为基因工程概论、分子克隆单元操作、大肠杆菌基因工程、真菌基因工程、昆虫基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程、蛋白质工程等，将DNA重组技术归纳为切、接、转、增、检五大基本操作单元，进而按照受体细胞的生物学分类，逐一展开各系统基因工程的原理和应用。重点讲述基因工程技术应用的策略和思路，并力求以图解的方式取代繁琐的描述。本课程全程采用多媒体教学手段进行。
根据本科教学加强基础、注重素质、整体优化的原则，本门课程旨在为学生讲述基因工程的基本原理、单元操作与应用策略，学生学好本门课程可为从事生物、农业、环保、医药领域的研究与应用开发工作打下良好基础。
具体任务是：
（一）熟悉和掌握基因工程基本概念、基本原理、基本技术和典型设备。
（二）学会根据生产、科研要求和技术选择分子操作的技术和设备。
（三）了解基因工程在各领域的应用、新的知识与技术，了解其最新研究成果和发展状态。
二、本课程的基本内容：
第一章基因工程概论
（一）教学目的与要求
掌握基因工程的含义和主要内容以及基因工程诞生的理论基础与技术突破。了解基因工程的发展和在社会生产中的应用和安全性的问题。
分子遗传学8章基因操作技术及其应用
限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称 限制酶。是识别并特异性地切割双链DNA序列的一种核 酸内切酶。（“分子手术刀”）
发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所 有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊 断中重要的一类工具酶。
（五）重组体的筛选
(1) 抗药性标记选择
(2) 标志补救(marker rescue)
(3) 分子杂交法
原位杂交
Southern blot
四
环
素
标
记
筛
选
抗
药
标
记
蓝
白
斑
筛
选
标
志
补
救
重组DNA技术操作过程总结：
分
分离目的基因
切
限制酶切目的基因与载体
接
拼接重组体
转
转入受体菌
筛
筛选重组体
三、PCR技术：聚合酶链式反应 （polymerase chain eaction,PCR ）
GAATTC CTTAAG
AGATCT TCTAGA
AATTC G
EcoRⅠ+ Bg lⅡ
双酶切
A TCTAG
AATTC G
GATCT A
GAATTC CTTAAG
高中生物选修3知识点汇总
11.胚胎早期培养:无机盐
有机盐
维生素
激素 氨基酸 核苷酸 血清等
12.胚胎移植: 1)供受体生殖器官的生理变化相同,相同生理环境 2)处于游离态 3)不发生免疫排斥 4)可与受体子宫正常生理和组织联系 13.胚胎移植基本程序: 1)供受体选择处理 2)配种或人工受精 3)胚胎收集,检查,保存 4)移植 5)检查 14.胚胎的分割:桑葚胚或囊胚 15.胚胎干细胞(ES或EK): 1)特点:体积小,细胞质核大,核仁明显,具发育的全能性 2)体外:可增殖不分化 3)应用:细胞坏死,退化,功能异常引起的疾病,如帕金森,少年糖尿病,老年痴呆症等 4)分化诱导因子:诱导ES分化
5.卵裂期：透明带内进行，胚胎总体积略减小，细胞行有丝分裂 6.桑椹胚（32个），之前每个细胞都具全能性
7.囊胚：内细胞团 滋养层 8.透明带破裂：孵化 9.原肠胚： （细胞分化最旺盛）
发育成各种组织 胎膜 胎盘
内细胞团表层细胞 下方细胞 内胚层
外胚层 包围的原肠腔
10.体外受精 1)卵母细胞采集和培养 ①促性腺激素处理(小) ②已屠宰母畜卵卵巢中采集 ③超声波探测仪…用真空泵吸取 2)精子采集和获能 采集:①假阴道法②手握法③电刺激法④ 获能:①培养法②化学诱导法:肝素或钙离子载体
选修三重要知识点整理
第一章
基因工程
1.限制性核酸内切酶（限制酶）
第8章 基因工程药物
9
基因工程药物的优点
1、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质， 改造成新药 胰岛素 2、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达， 符合临床和研究需要 3、改造生理活性物质，提高其活性：速效、长效 4、可以挖掘和开发更多的新药，获得新物质
10
8.1.3 基因工程药物的研发过程
1、实验室研究阶段（discovery，research） 2、基因工程药品的开发阶段（development） 3、基因工程药品的临床试验（commercialization）: Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期临床试验 4、新药申请和上市
原理：水相中加入溶于水的高分子化合物，形 成密度不同的两相体系。
形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子 的空间阻碍作用，无法形成均一相。 双聚合物：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)。该系 统上相富含PEG，下相富含Dx；
28
5、反胶团萃取： 反胶团：是表面活性剂分散在连续的有机溶 剂中，自发形成的纳米尺度的一种聚集体。
• 1957年英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研 究人员Jean Indenmann首次发现，利用灭活的 流感病毒作用于鸡胚绒毛尿囊膜后，可使细胞 产生一种干扰病毒繁殖的可溶性物质，称为干 扰素。
• 普遍存在：脾脏、肝脏、肾脏、骨髓等；可被 多种因素诱发分泌，如病毒，双链RNA等。
50
动物基因工程—DNA重组技术及步骤
破译遗传密码，即核
尼
酸链上3个相连的核苷酸决
龙
定一种氨基酸。
伯
格 至此，人们对基因概
念的认识逐渐清晰。
基因的概念及其结构
1、基因概念及其发展
基因：是控制生物性状的遗传物质的功能和结构单位，是有遗传效应的DNA片段
。
举例：不同生物的基因数目。
种类
基因组大小（bp） 基因数目
支原体
1.0×106
定的性状。 2、基因是有遗传效应的DNA片段，每个DNA分子上有许多个基因。所谓遗传效
应是指具备发育、表现出某性状的信息。 3、基因位于染色体上呈线形排列，染色体是基因的载体。 4、基因的脱氧核苷酸的排列顺序包含着遗传信息，对于某个基因来说其脱氧核苷
酸的排列顺序是固定不变的，而不同的基因的脱氧核苷酸的排列顺序又是不同的。 5、线粒体和叶绿体中的DNA分子上也有基因。 6、一个基因有两条单链，但只有其中一条含有遗传信息。
-30～-25
编码区
结构基因
外显子：具有编码意义
内含子：无编码意义（ 5'GT、 3'AG；GT -AG法则）
前导区
TATA框
非编码区
尾部区 调控区
启动子 增强子 终止子
CAAT框
GC框：调节转录的活动。 mRNA裂解信号(AATAAA)加尾识别信
动物基因编辑知到章节答案智慧树2023年浙江大学
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第一章测试
1.人类历史上第一个批准的生物技术药物（）。
参考答案:
重组人胰岛素
2.1985年，中国科学院朱作言课题组获得了（），比美国相同研究早了3年。
参考答案:
转基因鱼
3.至今为止，美国批准可食用的转基因动物有（）。
参考答案:
转基因三文鱼;抗热应激基因编辑牛;α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除猪
4.全球第一家生物技术公司是Genentec。（）
参考答案:
对
5.比利时蓝牛和皮埃蒙特牛的Myostatin基因天然有突变，造就了它们肌肉发
达的独特性状。（）
参考答案:
对
第二章测试
1.动物基因工程实验中常用的限制性内切酶为（）型限制性内切酶。
参考答案:
Ⅱ
2.识别相同的核苷酸序列，但在不同的位点切割DNA双链的限制性内切酶是
（）。
参考答案:
异裂酶
3.已知目的基因的基因信息后，可以通过（）获得目的基因。
参考答案:
从基因文库中PCR扩增;人工合成;提取mRNA进行RT-PCR扩增;提取基因组进行PCR扩增
4.NCBI是一个非盈利性全球质粒共享信息库。它负责保存和提供质粒。科学
家发表文章如果涉及到质粒，会发一份到NCBI保存，其他科学家如果需要这个质粒，可以向NCBI索取。（）
参考答案:
错
5.人类基因组计划中构建基因组文库所用的载体是BAC（细菌人工染色体）。
（）
参考答案:
对
第三章测试
1.1999年（）完成了世界第一头体细胞克隆牛“艾米”。
参考答案:
杨向中
2.在早期两栖类动物克隆中，（）进行了第一例体细胞克隆实验，并因此获
得了诺贝尔奖。
参考答案:
第八章微生物遗传
普遍性转导的三种后果：
流产转导
完全转导
外源DNA被降解，转导失败。
局限转导（又叫特异转导）：
specialized transduction
• 局限性转导是噬菌体对寄主特定基因进行的有效 转移
• 溶原菌经诱导后，少数前噬菌体从宿主染色体脱 落时产生错误切割，把宿主的某些基因整合到噬 菌体的基因组上，当这样的噬菌体侵染另一宿主 菌时，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配 对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上， 使受体菌获得了供体的这部分遗传特性，从而形 成转导子。
移到另一个细胞中。 转导噬菌体：能将细菌宿主的部分染色体和质粒 DNA带到另一个细菌的噬菌体。获得了由噬菌体携 带来的供体菌DNA片段的受体细胞称为转导子。在
转导中被转移的染色体片段称为转导因子。
细菌转导的类型：
普遍 转导 局限 转导 完全转导
流产转导 低频转导
高频转导
普遍转导（generalized transduction）
因子、Tn因子）
三、染色体外的遗传成分
质粒：
1、致育因子(Fertility factor，F因子) 2、抗性因子（Resistance factor，R因子） 3、产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid） 4、毒性质粒（virulence plasmid） 5、代谢质粒（Metabolic plasmid）
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“十二五”普通高等教育国家级规划教材
供体超排处理 IVF产生胚胎 重组基因DNA制备
原核胚胎收集
原核显现技术
注射用DNA制备
DNA显微注射 注射后胚胎暂培养 受体同期化处理 胚胎移植
实验后代产出
基因整合检测
动物健康监测
原代转基因动物
生产大量F1动物
基因表达检测
基因纯合试验
建立转基因动物家系
建立转基因动物群体
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
4 增加目的基因拷贝数
通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的 工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。 目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共 扩增的方法。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
三、动物细胞转化方法与筛选
1 基因的导入方法 在真核细胞的表达研究中，细胞转染是一个关键 步骤。在基因治疗中，也需要用基因转移技术导入外 源基因。因此该技术的研究已越来越受到重视，至今 已开发了许多新的技术和方法。不同的细胞系，摄取 和表达外源DNA 的能力可相差几个数量级。因此如果 采用某种特定的细胞系，就务必比较几种不同方法的 效率。当前用于DNA转染哺乳动物细胞的主要方法见 下表。
DNA导入动物细胞的方法还有，微注射法（microinjection）、 原生质体融合法（protoplast fusion）和病毒感染法（viral
infection）等。
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
2 哺乳动物基因转移的遗传选择标记
（1）胸苷激酶基因（tk）选择系统
胸苷激酶 (thymidine kinase)是核苷酸合成代谢途径中的
“十二五”普通高等教育国家级规划教材
3. 整合位点的优化
只有目的基因的整合位点处于染色体转录活跃区的
细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。
因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录活
跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的 一步，主要通过以下几种策略实现。
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二、哺乳动物的转基因操作
表 9-3 几种转基因技术效果比较
方法 基因准备 转基因的大小 定点整合 胚胎操作技巧要求 胎儿存活率 胚胎存活率 生后转基因比例 嵌合体发生频率 外源基因拷贝数 多位点插入 外源基因表达率 显微注射法 易 无限定 不可能 高 低~中等 中等 1~30% 中等 高 低 50% 逆转录病毒载体 法 难 <10kb 不可能 低 高 高 约100% 低 低 中等~高 可能出问题 精子介导法 易 无限定 不可能 低 中等 中等 约30% 低 低 中等 50% 胚胎干细胞法 中等 无限定 可能 低 高 中等 100% 高 可选择 可控制 高 体细胞核移植 中等 无限定 可能 高 低~中等 低 100% 无 可选择 低 50%
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2. 利用体细胞核移植 制备转基因动物 核移植(nuclear transfer，NT)通常是指 将外源性细胞核作为供
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（8）抗体转染法 利用抗体作为载体，介导基因进入表达特定表面抗原细胞 的方法为抗体转染（antifection）。 （9）其他 其他有超声波法，它的生物学效应是空化作用，超声过程 中形成的真空气旋在塌缩时产生局部高温、高压使气泡周围的
细胞受到影响，细胞膜发生可逆的通透性变化。其他外源
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真核细胞转染方法
优点 方法 缺点
物理方法
光穿孔 冲击波 基因枪 简单，细胞伤害小 简单，可能用于临床 很有效 需专门仪器 需专门仪器 需专门仪器
电穿孔
显微注射 化学方法 磷酸钙共沉淀法 脂质体法 二乙铵乙基葡聚糖 生物学方法 反转录病毒法 原生质体融合法
适用于悬浮细胞
细胞表达了这种neo抗性基因后，就会在含G418的选择培养
基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。
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第二节 转基因动物
转基因动物（技术）是以动物个体作为基因受体
的基因表达技术。目的基因导入动物体之后，其行为 和表达调控与导入离体培养的动物细胞系有很大差别。
所以，即使单纯出于研究目的，动物细胞系也不能替
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1. 显微注射法
显微注射法 是用直径
80~100μm的细玻璃管将胚胎固
定，再用另一根直径1~5μm 的玻 璃管刺入细胞原核，把DNA溶
液直接注射到原核期胚胎的一个
或两个原核中。并直接移植到代 受体母畜的输卵管中；也可以转 移到适当培养液中，让它们继续 发育到桑椹胚或囊胚阶段，然后 再进行胚胎移植。
其选择原理为：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(A)处 理细胞，二氢叶酸还原酶被抑制，不能使二氢叶酸还原
成四氢叶酸，其结果是培养基中的四氢叶酸因得不到补
充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成TTP以及dATP和dCTP 的合成过程均被阻断。次黄嘌呤是dATP和dACP补救合成 途径的一种底物，培养基中含有这种物质时，细胞就能 越过氨基蝶呤的抑制作用，利用补救途径继续合成出这 些核苷酸。
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一、动物细胞表达体系 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分
组成。
1 表达载体 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒
载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞
膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ：
（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体
微小金颗粒(或钨粉)很高的初速度，使其穿透植物细胞
壁而达到转移外源质粒子DNA 的目的。
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（4）电穿孔法 电穿孔(Electroporation)是指在高压脉冲的作用下
使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致不同细胞之间
的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。 （5）磷酸钙转染法 磷酸钙转染法（calcium phosphate coprecipitation）是把含外源基因的质粒或已克隆化的基
因作为转染物，与磷酸钙转染液混合，加入到宿主细
胞的培养环境中，在磷酸钙转染液的媒介下能使转染 的DNA被整合到受体细胞的基因组中。
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（6）二乙铵乙基葡聚糖介导法 该方法是带正电的二乙铵乙基葡聚糖与核酸带负电的
磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。
（7）脂质体法 脂质体（liposome encapsulation）是由天然脂类和 类固醇组成的微球，
很有效 简单 简单，很有效 简单 很有效 适合悬浮细胞
需专门仪器
技术困难 不适合悬浮细胞 不适合悬浮细胞 仅用于瞬时表达 宿主范围限制 结果不稳定
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（1）光穿孔法
光穿孔法（optoporation）是利用激光产生的热量， 使细胞壁产生孔洞，将外源物质导入细胞。 （2）冲击波法 冲击波法（shock wave permeabilization）是利用 细胞受冲击后细胞膜通透性瞬时增加，使外源基因导入 细胞。 （3）基因枪法 基因枪（gene gun）法又叫微粒轰击法、生物发射 技术或高速微粒子发射技术。通过提供给包裹有DNA 的
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（3）新霉素抗性选择系统
新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体， 使其蛋白质合成不能正常进行，新霉素的一种类似物 G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新 霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达，当neo基因与能有 效转录的真核DNA序列连锁时就能获得有效的表达。Neo基 因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当
BHK21 MDCK细胞
（5）Namalwa细胞 （6）Vero细胞 （7）鼠骨髓瘤细胞 （8）COS细胞
COS细胞
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二、动物细胞表达载体的构建
构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达
载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以 及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。 转录水平的调控元件 翻译水平的调控元件 整合位点的优化 增加目的基因拷贝数
代转基因动物。
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一、转基因动物概念 目前，对于转基因动物还没有一个简单而明确的定 义。为了正确理解什么是转基因动物，在这里我们只强 调所有转基因动物都是由于外源基因（包括同一物种的 DNA）导入动物的基因组而产生了可以遗传的改变。 这些可以遗传的改变包括：外源基因片段至少整合到一 条染色体的一个位点上；外源基因的插入使基因组中任 何一个基因的结构发生改变；外源基因的插入使染色体 发生重排；外源基因导入可以持久存在的遗传实体 等
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第一节 动物细胞基因工程
采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点：
①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接加
工成成熟的mRNA； ②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化
类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白；
③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性 和可重复性； ④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中， 提纯工艺简单，成本低。
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（2）二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统
外源基 因 转染dhfr -细胞 系 单克隆 培养
5 mM MTX
DHFR-MTX高效表达系统
单克隆 培养 转移
0.25 mM MTX
dhf r
0.05 mM MTX(氨Leabharlann Baidu喋 呤)
转移
单克隆 培养
转移
外源基因扩增至100 拷贝 单克隆 培养
一种酶，能将胸苷转换成为胸苷-磷酸。 在胸苷激酶基因选择系统中，必须用tk表型缺陷型(tk-) 细胞株作为宿主细胞。由于选择tk+细胞的培养基含有次黄 嘌呤(hupoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷 (thymidine)，所以叫做HAT选择法。
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（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 （3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载体 （4）质粒载体
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2 宿主细胞 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞
几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着
一些不足，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿 主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 （1）BHK-21细胞 （2）CHO-K1细胞 （3）C127细胞 （4）MDCK细胞
一是通过选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达；
二是在载体上添加染色体上的某些特定序列，使表达 载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转 录活跃区 ； 三是先将含有定点重组位点的选择标记基因整合在染 色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表 达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系。
脂质体转染法可能的机理是阳离子脂 质体与带负电的基因依靠静电作用形成脂 质体基因复合物，该复合物因阳离子脂质 体的过剩正电荷而带正电，借助静电作用 吸附于带负电的细胞表面，再通过与细胞 膜融合或细胞内吞作用而进入细胞内，脂 质体基因复合物在细胞质中可能进一步传 递到细胞核内释放基因，并在细胞内获得 表达。
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1. 转录水平 提高转录水平的因素 启动子 增强子 转录终止信号 多聚腺苷酸加尾信号
提高宿主细胞转录因子的表达水平
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2. 翻译水平
提高翻译效率的因素： Ploy（A）部分起“翻译增强子”的作用提高mRNA 翻译水平 内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除 第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 翻译增强子可提高翻译效率 使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子 进行优化
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第八章 动物基因工程
动物细胞基因表达技术
利用动物工程细胞大规模生产 蛋白多肽物质或作为药 物筛选研究的体外（in vitro）评价模型。 动物转基因技术 通过转基因动物个体进行动物遗传性状的改良或作为 药物筛选研究的体内（in vivo）评价模型及人体的基因治 疗。