第8章 动物基因工程

一种酶，能将胸苷转换成为胸苷-磷酸。 在胸苷激酶基因选择系统中，必须用tk表型缺陷型(tk-) 细胞株作为宿主细胞。由于选择tk+细胞的培养基含有次黄 嘌呤(hupoxanthine)、氨基蝶呤(aminopterin)和胸苷 (thymidine)，所以叫做HAT选择法。
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（3）新霉素抗性选择系统
新霉素是细菌抗生素，它可以干扰原核生物的核糖体， 使其蛋白质合成不能正常进行，新霉素的一种类似物 G418(geneticin)对真核细胞和原核细胞均有毒性。细菌的新 霉素抗性基因(neo)能在真核细胞中表达，当neo基因与能有 效转录的真核DNA序列连锁时就能获得有效的表达。Neo基 因编码一种磷酸转移酶，这种酶能使G418失活。所以，当
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第一节 动物细胞基因工程
采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点：
①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接加
工成成熟的mRNA； ②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基化
类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白；
③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定性 和可重复性； ④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基中， 提纯工艺简单，成本低。
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二、哺乳动物的转基因操作
表 9-3 几种转基因技术效果比较
方法 基因准备 转基因的大小 定点整合 胚胎操作技巧要求 胎儿存活率 胚胎存活率 生后转基因比例 嵌合体发生频率 外源基因拷贝数 多位点插入 外源基因表达率 显微注射法 易 无限定 不可能 高 低~中等 中等 1~30% 中等 高 低 50% 逆转录病毒载体 法 难 <10kb 不可能 低 高 高 约100% 低 低 中等~高 可能出问题 精子介导法 易 无限定 不可能 低 中等 中等 约30% 低 低 中等 50% 胚胎干细胞法 中等 无限定 可能 低 高 中等 100% 高 可选择 可控制 高 体细胞核移植 中等 无限定 可能 高 低~中等 低 100% 无 可选择 低 50%
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2. 利用体细胞核移植 制备转基因动物 核移植(nuclear transfer，NT)通常是指 将外源性细胞核作为供
细胞表达了这种neo抗性基因后，就会在含G418的选择培养
基中存活，这种选择系统适用于所有的细胞类型。
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第二节 转基因动物
转基因动物（技术）是以动物个体作为基因受体
的基因表达技术。目的基因导入动物体之后，其行为 和表达调控与导入离体培养的动物细胞系有很大差别。
所以，即使单纯出于研究目的，动物细胞系也不能替
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1. 显微注射法
显微注射法 是用直径
80~100μm的细玻璃管将胚胎固
定，再用另一根直径1~5μm 的玻 璃管刺入细胞原核，把DNA溶
液直接注射到原核期胚胎的一个
或两个原核中。并直接移植到代 受体母畜的输卵管中；也可以转 移到适当培养液中，让它们继续 发育到桑椹胚或囊胚阶段，然后 再进行胚胎移植。
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3. 整合位点的优化
只有目的基因的整合位点处于染色体转录活跃区的
细胞形成的克隆才可高水平表达目的基因。
因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录活
跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需的 一步，主要通过以下几种策略实现。
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（2）二氢叶酸还原酶基因(dhfr)选择系统
外源基 因 转染dhfr -细胞 系 单克隆 培养
5 mM MTX
DHFR-MTX高效表达系统
单克隆 培养 转移
0.25 mM MTX
dhf r
0.05 mM MTX(氨甲喋 呤)
转移
单克隆 培养
转移
外源基因扩增至100 拷贝 单克隆 培养
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真核细胞转染方法
优点 方法 缺点
物理方法
光穿孔 冲击波 基因枪 简单，细胞伤害小 简单，可能用于临床 很有效 需专门仪器 需专门仪器 需专门仪器
电穿孔
显微注射 化学方法 磷酸钙共沉淀法 脂质体法 二乙铵乙基葡聚糖 生物学方法 反转录病毒法 原生质体融合法
适用于悬浮细胞
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一、动物细胞表达体系 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部分
组成。
1 表达载体 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒
载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞
膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ：
（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体
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第八章 动物基因工程
动物细胞基因表达技术
利用动物工程细胞大规模生产 蛋白多肽物质或作为药 物筛选研究的体外（in vitro）评价模型。 动物转基因技术 通过转基因动物个体进行动物遗传性状的改良或作为 药物筛选研究的体内（in vivo）评价模型及人体的基因治 疗。
代转基因动物。
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一、转基因动物概念 目前，对于转基因动物还没有一个简单而明确的定 义。为了正确理解什么是转基因动物，在这里我们只强 调所有转基因动物都是由于外源基因（包括同一物种的 DNA）导入动物的基因组而产生了可以遗传的改变。 这些可以遗传的改变包括：外源基因片段至少整合到一 条染色体的一个位点上；外源基因的插入使基因组中任 何一个基因的结构发生改变；外源基因的插入使染色体 发生重排；外源基因导入可以持久存在的遗传实体 等
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4 增加目的基因拷贝数
通过增加目的基因拷贝数来获得高表达重组药物的 工程细胞株是基因工程药物研究中不可或缺的一步。 目的基因的扩增常采用目的基因和选择标记基因共 扩增的方法。
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三、动物细胞转化方法与筛选
1 基因的导入方法 在真核细胞的表达研究中，细胞转染是一个关键 步骤。在基因治疗中，也需要用基因转移技术导入外 源基因。因此该技术的研究已越来越受到重视，至今 已开发了许多新的技术和方法。不同的细胞系，摄取 和表达外源DNA 的能力可相差几个数量级。因此如果 采用某种特定的细胞系，就务必比较几种不同方法的 效率。当前用于DNA转染哺乳动物细胞的主要方法见 下表。
BHK21 MDCK细胞
（5）Namalwa细胞 （6）Vero细胞 （7）鼠骨髓瘤细胞 （8）COS细胞
COS细胞
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二、动物细胞表达载体的构建
构建一个高效表达的哺乳动物细胞表达载体，应从表达
载体在染色体上整合位点的优化，转录翻译效率的提高以 及目的基因拷贝数的增加等方面综合考虑。 转录水平的调控元件 翻译水平的调控元件 整合位点的优化 增加目的基因拷贝数
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1. 转录水平 提高转录水平的因素 启动子 增强子 转录终止信号 多聚腺苷酸加尾信号
提高宿主细胞转录因子的表达水平
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2. 翻译水平
提高翻译效率的因素： Ploy（A）部分起“翻译增强子”的作用提高mRNA 翻译水平 内部核糖体进入位点（IRES）能使同一mRNA中除 第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 翻译增强子可提高翻译效率 使用宿主细胞偏好的密码子来对目的基因的密码子 进行优化
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（8）抗体转染法 利用抗体作为载体，介导基因进入表达特定表面抗原细胞 的方法为抗体转染（antifection）。 （9）其他 其他有超声波法，它的生物学效应是空化作用，超声过程 中形成的真空气旋在塌缩时产生局部高温、高压使气泡周围的
细胞受到影响，细胞膜发生可逆的通透性变化。其他外源
一是通过选择基因（如neo、dhfr）的弱化表达；
二是在载体上添加染色体上的某些特定序列，使表达 载体整合到宿主细胞的染色体后能模拟染色体的高转 录活跃区 ； 三是先将含有定点重组位点的选择标记基因整合在染 色体高表达区，然后将表达目的基因的表达载体和表 达重组酶载体共转染上述带有重组位点的细胞系。
微小金颗粒(或钨粉)很高的初速度，使其穿透植物细胞
壁而达到转移外源质粒子DNA 的目的。
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（4）电穿孔法 电穿孔(Electroporation)是指在高压脉冲的作用下
使细胞膜上出现微小的孔洞，从而导致不同细胞之间
的原生质膜发生融合作用的细胞生物学过程。 （5）磷酸钙转染法 磷酸钙转染法（calcium phosphate coprecipitation）是把含外源基因的质粒或已克隆化的基
其选择原理为：如果用叶酸的类似物氨基蝶呤(A)处 理细胞，二氢叶酸还原酶被抑制，不能使二氢叶酸还原
成四氢叶酸，其结果是培养基中的四氢叶酸因得不到补
充而逐渐耗尽，于是从dUMP合成TTP以及dATP和dCTP 的合成过程均被阻断。次黄嘌呤是dATP和dACP补救合成 途径的一种底物，培养基中含有这种物质时，细胞就能 越过氨基蝶呤的抑制作用，利用补救途径继续合成出这 些核苷酸。
因作为转染物，与磷酸钙转染液混合，加入到宿主细
胞的培养环境中，在磷酸钙转染液的媒介下能使转染 的DNA被整合到受体细胞的基因组中。
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（6）二乙铵乙基葡聚糖介导法 该方法是带正电的二乙铵乙基葡聚糖与核酸带负电的
磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。