8第八章 基因工程与基因体外表达

医学分子生物学
第八章 基因工程与基因体外表达
南华大学生物化学与分子生物学教研室
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• 基因克隆的工具酶和载体 • 基因克隆的基本过程 • 真核细胞转染 • 基因的改造 • 克隆基因的表达
• 电子克隆
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DNA重组是细胞内广泛存在的自然现象
B淋巴细胞受到外来抗原的刺激后，免疫球蛋白基因 发生重组，产生新的抗体，以对抗外来的抗原；
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二、表达载体
(一) 原核表达载体
表达载体中含有复制起始位点、抗性基 因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结合位点和 转录终止信号。
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multiple cloning site
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(二) 真核表达载体
含有原核复制起始位点、抗生素抗性 基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、 增强子、克隆位点、 转录终止信号和poly (A) 加尾信号.
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(四) M13噬菌体 (M13 phage)
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。 感染细菌 后，经过复制转变为双链的复制型（RF）。复制型 M13可用作克隆载体。
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(五) 病毒载体
逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、 EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒 载体均已质粒化，病毒载体质粒主要由病 毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子组成。
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第四节 真核细胞转染
一、真核细胞转染的方法与基本原理
（一）磷酸钙沉淀法（calcium phosphate co-precipitation）
使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙 混合，形成微小颗粒，并加入到宿主细胞中， 使这些颗粒沉积在细胞表面，以利于宿主细 胞摄取这些颗粒。
病毒或噬菌体侵入宿主细胞后，整合入宿主细胞的 基因组中；
生殖细胞在减数分裂过程中姊妹染色体之间的互联 与交换；
细胞受到物理、化学因素的刺激后，DNA断裂、重 组。如：t(14;18)染色体易位。
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基因工程 (gene engineering) 基因操作 (gene manipulation) 分子克隆 (molecular cloning) 基因克隆 (gene cloning) DNA重组(recombinant DNA)
5 ́ -CTGCA
G-3 ́
3 ́ -G
ACGTC-5 ́
SmaⅠ沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端：
5 ́ -CCCGGG-3 ́ 3 ́ -GGGCCC-5 ́
5 ́ -CCC 3 ́ -GGG
GGG-3 ́ CCC-5 ́
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有些限制性内切酶识别序列为8个或8个以上碱基对。 NotⅠ：其识别序列为GCGGCCGC， SfiⅠ：其识别序列为GGCCNNNNNGGCC。
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（四）脂质体介导的基因导入
DNA
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（五）显微注射法（microinjection）
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二、 转染细胞的筛选
( 一) TK-细胞突变株筛选转染细胞
细胞内TTP的合成有两条途径 从头合成 可被氨基喋呤阻断 补救合成 胸苷激酶(TK)是关键酶
能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备 载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自 身连接，提高重组效率。
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6. 末端脱氧核苷酸转移酶
（terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT )
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第二节 基因克隆的载体
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4. T4 DNA连接酶（T4 DNA ligase）
催 化 双 链 DNA 一 端 3ˊ-OH 与 另 一 双 链 DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键， 使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接 起来。
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5. 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）
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二、载体的选择与准备
几种常用克隆载体的比较
比较内容 克隆容量 基因组DNA文库 cDNA文库 亚克隆 序列分析 E.coli表达
质粒 <10 kb
+ + + +
λ噬菌体 <22 kb
+ + + +
黏性质粒 40～50 kb
+ -
M13噬菌体 <1 kb + + -
注：+表示可用；-表示不可用
（四）平端连接
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四、外源DNA导入宿主细胞
（一）转化（transformation） （二）感染（infection） （三）转染（transfection）
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五、目的基因的筛选和鉴定
外源基因导入宿主细胞后，筛选含有 目的基因的阳性克隆并加以扩增。
所用的方法主要有遗传学方法、免疫 学方法、核酸杂交法、PCR等。
（1）分子量相对较小，能在细菌内稳定存 在，有较高的拷贝数。
（2）具有一个以上的遗传标志，便于对宿主 细胞进行选择，如抗生素抗性基因， β-半乳糖苷酶基因（Lac Z）等。
（3）具有多个限制性内切酶的单一位点（多 克隆位点），便于外源基因的插入。
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载体是携带目的基因，使其在宿主细 胞内复制或表达的DNA分子。
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一、常用的克隆载体
(一)质粒（plasmid） 是存在于多数细菌和某些真核生物染
色体外的双链环状的DNA分子。一般只能 容纳小于10 kb的外源DNA片段。
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作为克隆载体的质粒应具备下列特点：
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基因工程是指在体外对DNA分子按 照既定的目的和方案，对DNA进行剪切和 重新连接，然后把它导入宿主细胞，从而 能够扩增有关DNA片段，表达有关基因产 物，进行DNA序列分析，基因治疗，研究 基因表达的调节因子，以及研究基因的功 能等。
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第一节 基因克隆的工具酶
杂交、 洗膜、 显影
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（四） PCR技术
具有高度的灵敏度和特异性，能在极 短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通 过琼脂糖凝胶电泳，可直接观察到产物的存 在。
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(五) 酶切鉴定
用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出 的菌落需进一步进行酶切分析，鉴定插入 片段的大小和插入方向。
TK+: 细胞生长 TK- 细胞导入含TK基因的载体: 细胞在HAT培养基生长
一、限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 从双链DNA内部特异位点识别并且裂
解磷酸二酯键。
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1. 限制性核酸内切酶的分类与特点
类型 限制性 修饰作用 识别位点 切割位点
Ⅰ型 有 有 特异 识别位点下游100到1000 bp
Ⅱ型 有 无 特异 可知、固定
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（二） 免疫学方法
如果克隆基因的产物是已知的，并且 在菌落或噬菌斑中表达，因而可用相应的抗 血清或单克隆抗体，通过放射免疫、化学发 光或显色反应进行筛选。
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（三） 核酸杂交法
菌落原位杂交的原理
将膜放置 平板表面 定位、揭起
变性、 中和、 固定
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三、DNA分子的体外连接
（一）黏性末端 （二）人工接头的使用 （三）加入同聚体尾 （四）平端连接
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（一）黏性末端
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（二）人工接头
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（三）加入同聚体尾
待克隆DNA片段
混合、退火
重组质粒
空白质粒
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（二）电穿孔法（electroporation）
将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯 中，在高频电流的作用下，细胞膜出现许多 小孔，使外源DNA能进入宿主细胞。
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（三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法
外源DNA或重组质粒DNA与DEAE葡聚 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的 化学基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团 结合，并粘附于细胞表面，借助细胞内吞 过程促进外源DNA进入细胞。
5ˊ→3ˊ聚合酶活性 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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Klenow片段的主要用途有： (1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。
(2) 通过补齐3ˊ端，使3ˊ末端标记。
5ˊ-G-OH
Klenow 5ˊ-GTT*A*A-OH
3ˊ-CAATT-OH d*ATP, dTTP 3ˊ-CAA T T-OH
end）。少数酶沿对称轴切断DNA，产生 平端或钝端（blunt end）。
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EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：
5 ́-GAATTC-3’ 3 ́-CTTAAG-5’
5 ́-G
AATTC-3 ́
3 ́-CTTAA
G-5 ́
PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：
5 ́ -CTGCAG-3 ́ 3 ́ -GACGTC-5 ́
(3) 在cDNA克隆中，第二股链的合成。
(4) DNA序列分析。
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3. 逆转录酶（reverse transcriptase）
一种RNA依赖的DNA聚合酶，即以RNA 为模板合成DNA， 合成方向为5ˊ→3ˊ延伸，无 3ˊ→5ˊ外切酶活性。
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(二)λ噬菌体
噬菌体(bacteriophage, phage)是感染细菌 的病毒， 用作克隆载体的噬菌体有两种。
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λZiplox载体
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(三)黏性质粒（cosmid）
是由λ噬菌体的黏性末端（cos区）与质 粒重新构建的载体，为双链、环状DNA。其 克隆容量可达40～50 kb。
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第三节 基因克隆的基本过程
基因克隆主要步骤： ① 制备目的基因和选择相关载体 ② 目的基因和有关载体进行连接 ③ 重组的DNA导入受体细胞 ④ DNA重组体的筛选和鉴定 ⑤ DNA重组体的扩增、表达和其他研究
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一、 目的基因的获得
（一）从基因组文库中获得 （二）从cDNA文库中获得 （三）PCR扩增特定基因 （四）人工合成
对一段特定的DNA而言，识别序列碱基对少的，则 切点数多，产生的片段小；而识别序列碱基对多的， 则切点数少，产生的片段大。
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二、其他常用的工具酶
1. DNA聚合酶Ⅰ (DNA polymerase I)
● 聚合酶活性 ● 3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性 ● 5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性
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（一） 遗传学方法
1. 插入灭活法
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2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列） 都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基 端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一 个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶 羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段 各自均无酶活性，但它们可以互补形成具有活性的β半乳糖苷酶，使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物， 出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA 片段，将使lac Z基因灭活，不能生成有活性的β-半乳 糖苷酶，结果菌落呈现白色。
Ⅲ型 有
有 特异 识别位点附近切割DNA， 切割位点很难预测。
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2．限制性内切酶的命名
EcoRⅠ E代表Escherichia属 co代表coli 种 R代表RY13株 Ⅰ代表从该菌株中首次分离
到的核酸内切酶
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wenku.baidu.com
3．限制性内切酶的识别和切割位点
通常是4～6个碱基对、具有回文序列 （palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位 切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末端（sticky
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
(large fragment of DNA polymerase I)
DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin) 裂解后产生的大片段，这个片段也称为Klenow 片段（Klenow fragment）。