第八章 基因工程与体外表达
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基因工程与体外表达
的核苷酸（DNA为dNTP，RNA为NTP）。
14
15
2. DNA聚合酶Ⅰ大片段
DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I)为DNA聚合酶I用枯草杆菌 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。
Published by AAAS
Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium (2010/5/20)
E. Pennisi Science 328, 958-959 (2010)
Life re-created. Blue colonies (top) indicate a successfully transplanted genome, with selfreplicating bacteria revealed in an electron micrograph.
2
Genetically modified crops
3
E. Stokstad Science 328, 295-a (2010) (2010)
Going green. Rather than plowing, farmers can control weeds by spraying biotech crops with herbicides, which lessens soil erosion and reduces fuel costs.
5. 几个小时之内，受体细菌内原 有DNA的全部消失，人造细胞不 断繁殖。新的生命诞生了。
6
第一节 基因克隆的工具酶
一、限制性核酸内切酶
5基因工程与体外表达
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葡聚糖（ （三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 葡聚糖 ） 外源DNA或重组质粒 或重组质粒DNA与DEAE葡聚 外源 或重组质粒 与 葡聚 糖混合， 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学 葡聚糖带有大量正电荷的化学 基团，可与 中带负电荷磷酸基团结合， 基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并 中带负电荷磷酸基团结合 粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源 粘附于细胞表面， DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用 进入细胞。此法简单、快速、有效， 进入细胞 于外源基因的短暂表达研究。 于外源基因的短暂表达研究。
34
二、表达载体 (一) 原核表达载体 一 表达载体中含有复制起始位点、 表达载体中含有复制起始位点、抗性 基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结 合位点和转录终止信号. 合位点和转录终止信号
35
36
37
(二) 真核表达载体 二
载体中含有原核复制起始位点、 载体中含有原核复制起始位点、抗生素 抗性基因、多克隆位点。 抗性基因、多克隆位点。还含有真核表达 元件,包括启动子 增强子和poly (A) 加尾 包括启动子、 元件 包括启动子、增强子和 信号。 信号。
8
9
10
11
2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶Ⅰ 聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of 聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶 DNA polymerase I)为DNA聚合酶 用枯草杆菌 聚合酶I用枯草杆菌 为 聚合酶 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 裂解后产生的大片段， 蛋白酶 裂解后产生的大片段 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 片段（ 段也称为 片段 ）。
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葡聚糖（ （三）DEAE-葡聚糖（ DEAE-Dextran）法 葡聚糖 ） 外源DNA或重组质粒 或重组质粒DNA与DEAE葡聚 外源 或重组质粒 与 葡聚 糖混合， 糖混合，DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学 葡聚糖带有大量正电荷的化学 基团，可与 中带负电荷磷酸基团结合， 基团，可与DNA中带负电荷磷酸基团结合，并 中带负电荷磷酸基团结合 粘附于细胞表面，借助细胞内吞过程促进外源 粘附于细胞表面， DNA进入细胞。此法简单、快速、有效，常用 进入细胞。此法简单、快速、有效， 进入细胞 于外源基因的短暂表达研究。 于外源基因的短暂表达研究。
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二、表达载体 (一) 原核表达载体 一 表达载体中含有复制起始位点、 表达载体中含有复制起始位点、抗性 基因 、克隆位点 、启动子 、核糖体结 合位点和转录终止信号. 合位点和转录终止信号
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(二) 真核表达载体 二
载体中含有原核复制起始位点、 载体中含有原核复制起始位点、抗生素 抗性基因、多克隆位点。 抗性基因、多克隆位点。还含有真核表达 元件,包括启动子 增强子和poly (A) 加尾 包括启动子、 元件 包括启动子、增强子和 信号。 信号。
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2. DNA聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶Ⅰ 聚合酶 DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of 聚合酶Ⅰ大片段 聚合酶 DNA polymerase I)为DNA聚合酶 用枯草杆菌 聚合酶I用枯草杆菌 为 聚合酶 蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段，这个片 裂解后产生的大片段， 蛋白酶 裂解后产生的大片段 段也称为Klenow片段（Klenow fragment）。 片段（ 段也称为 片段 ）。
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基因工程与体外表达课件
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
5.同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G CCTAG
+
GATCC G
A+
TCTAG
GATCT A
二、其他常用的工具修饰酶
• DNA聚合酶Ⅰ • DNA聚合酶Ⅰ大片段 • 反转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团 • 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
四、人工化学合成
一是作为领导干部一定要树立正确的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
二的混合 体与载体进行连接，使每一个cDNA分子都与一 个载体分子拼接成重组DNA，将所有重组DNA 分子引入宿主细胞并进行的 权力观 和科学 的发展 观，权 力必须 为职工 群众谋 利益， 绝不能 为个人 或少数 人谋取 私利
（三） PCR扩增特定基因 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业试剂
第十三章-基因工程与基因体外表达
第十三章基因工程与基因体外表达第一节基因克隆一．限制性核酸内切酶二．基因克隆中具有不同功能的工具酶第二节基因克隆中特定的DNA载体一．常用克隆载体（质粒和病毒）二．表达载体将外源基因带入宿主并进行表达第三节基因克隆的过程一．获取目的基因二．选择和准备载体三．DNA片段的连接四．重组DNA导入宿主细胞进行扩增五．筛选与鉴定第四节真核细胞基因转染一．真核细胞转染的方法与原理二．转染细胞利用抗性标记进行筛选第五节利用重组DNA技术对基因进行改造一．对特定基因的定点诱变二．利用基因定点诱变技术改变基因工程蛋白的特性第六节克隆基因在适当的宿主细胞表达一．大肠杆菌表达系统二．哺乳动物细胞外源基因的表达三．其他宿主细胞中也表达制备真核蛋白第七节电子克隆本章重点:掌握：DNA克隆概念，限制性内切酶的定义及其特点，基因载体的种类。
重组DNA技术的基本过程，目的基因获取的方法，外源基因与载体的连接方式，重组DNA分子导入受体菌的方式，重组体筛选的方法。
熟悉：基因组DNA文库和cDNA文库的概念，目的基因表达体系的种类及其特点了解：自然界基因转移的方式：接合作用、转化及转导作用、转座；重组有两种类型，即位点特异性的重组和同源重组本章难点两种类型基因重组的机理；限制性内切酶的作用特点，基因载体的种类；重组DNA技术的基本环节中，目的基因的获取方法，外源基因与载体连接的方法，重组DNA导入受体菌的方法，重组体的筛选方法，以及原核和真核表达体系的优缺点比较核心词：DNA重组基因克隆载体宿主细胞基本概念：DNA重组（DNA recombination）：不同来源DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子的过程。
基因克隆（gene cloning）：主要是进行制备DNA片段，并通过载体将其导入受体细胞，在受体细胞中复制，扩增，以获得单一DNA分子的大量拷贝的过程。
基因工程（genetic engineering）：基因克隆后，利用克隆基因表达，制备特定的蛋白质或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。
外源基因表达与基因工程药物ppt课件
➢ 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等
➢ 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
➢ 目的： ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
• 粘性质粒(cosmid)
粘性质粒
也称柯斯载体。是带有粘性末端位 点的质粒, 柯斯质粒是人工建造的的含有 λDNA的cos序列和质粒复制子的特殊 类型的质粒载体。
粘性质粒
用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体 的cos末端及质粒重组而成的载体。cosmid载体带 有质的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬 菌体用于包装的cos末端等。
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
➢ 分类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）
➢ 作用： 与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰
系统，限制外源DNA，保护自身DNA。
➢ 命名：
Hin dⅢ
Haemophilus influenzae d株 流感嗜血杆菌d株的第三种酶
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
基因工程与体外表达
通过融合标签、调节表达条件等方法解决产物不稳定性和聚集问题。
发展前景和研究方向
1. 开发更高效的表达系统 2. 研究蛋白质折叠和组装机制 3. 优化蛋白质后翻译修饰 4. 应用多维组学技术解析产物结构和功能
蛋白质生产
体外表达可用于大量制备重组蛋白，用于医药和工业领域。
药物筛选和特异性抗体制备
体外表达可以用于药物筛选和特异性抗体的制备，为疾病治疗和诊断提供重要工具。
பைடு நூலகம்
常见的基因工程表达系统
大肠杆菌
是最常用的表达系统之一，具 有易操作、高表达的优点。
酵母
常用于表达复杂蛋白和进行药 物筛选。
哺乳动物细胞
可用于表达大型蛋白和进行临 床前研究。
体外表达系统的优缺点
1 优点
高效、可扩展、质量可控、表达产物天然结构和活性。
2 缺点
特异性低、成本高、难以表达复杂蛋白、不适用于大规模生产。
体外表达中的关键因素和挑战
1
选择合适宿主细胞
不同细胞具有不同的表达能力、转化效率和产量。
2
优化表达系统
包括选择合适的启动子、改进转染技术和优化培养条件。
3
克服产物聚集和稳定性问题
基因工程与体外表达
基因工程是利用分子生物学和基因组学的知识进行人为干预的技术。体外表 达是将外源基因导入宿主细胞中，通过细胞内机制使该基因产生表达产物。
基因工程的原理和技术
• DNA重组技术 • 质粒构建和转染技术 • CRISPR基因编辑技术 • 基因递送系统
体外表达的意义和应用
研究基因功能
通过体外表达，可以探究特定基因的功能和作用机制。
基因工程与基因体外表达共81页文档
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
基因工程与基因体外表达
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
•
7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
பைடு நூலகம்
•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
基因工程与基因体外表达
•
6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
•
7、心急吃不了热汤圆。
•
8、你可以很有个性，但某些时候请收 敛。
•
9、只为成功找方法，不为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
பைடு நூலகம்
•
10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
基因工程与体外表达_1828
是一类能识别和切割DNA分子中特定碱基顺 序的核酸水解酶 命名:以限制性内切酶来源的微生物学名进行命 名。通常第一字母（大、斜）代表该酶的微生 物属名；第二三字母（小、斜）代表微生物的 种名；第四个字母代表寄主菌的株或型；
限制性核酸内切酶的分类
Ⅰ类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两 种功能，但识别、切割位点不一致；
Bam HⅠ
5`
GGATCC
3`
3`
CCTAGG
5`
3、产生3`端突出的粘性末端
SacⅠ
5`
GAGCTC
3`
3`
CTCGAG
5`
少数有特殊性质的Ⅱ型酶
同功异源酶
来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相 同也可以不同，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
Kpn Ⅰ
GGATCC CCTAGG
GGTACC CCATGG
1. 质粒 (plasmid)
质粒是存在于细胞 染色体外的小型双链 DNA分子,2-200Kb之 间.本身含有复制功能 的遗传结构,能在宿主 细胞独立自主进行复制, 并在细胞分裂时,保持 恒定地传给子代细胞.
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,
会赋予宿主细胞一些遗传性状。
缺点:该载体一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入 过大,会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失.
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
基因克隆需要特定DNA载体
载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达 的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的DNA片段的 载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。 载体应具备以下特征： 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复 制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子 是否进入宿主细胞
限制性核酸内切酶的分类
Ⅰ类：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两 种功能，但识别、切割位点不一致；
Bam HⅠ
5`
GGATCC
3`
3`
CCTAGG
5`
3、产生3`端突出的粘性末端
SacⅠ
5`
GAGCTC
3`
3`
CTCGAG
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少数有特殊性质的Ⅱ型酶
同功异源酶
来源不同的限制酶，识别顺序相同，切割位点可以相 同也可以不同，这些酶称同功异源酶。
Bam HⅠ
Kpn Ⅰ
GGATCC CCTAGG
GGTACC CCATGG
1. 质粒 (plasmid)
质粒是存在于细胞 染色体外的小型双链 DNA分子,2-200Kb之 间.本身含有复制功能 的遗传结构,能在宿主 细胞独立自主进行复制, 并在细胞分裂时,保持 恒定地传给子代细胞.
特点
能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,
会赋予宿主细胞一些遗传性状。
缺点:该载体一般只能接受小于15kb的外源DNA片段.插入 过大,会导致重组体扩增减慢,甚至插入片段先进丢失.
① 合成cDNA ② 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
基因克隆需要特定DNA载体
载体是携带靶DNA片段进入宿主细胞，进行扩增和表达 的工具。其本质是DNA。用于克隆和扩增特定的DNA片段的 载体称克隆载体，用于表达外源基因的称为表达载体。 载体应具备以下特征： 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复 制。 2. 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3. 至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子 是否进入宿主细胞
(工程建筑套表)八章基因工程与体外表达
（工程建筑套表）八章基因工程与体外表达中南大学生物科学和技术学院分子生物学研究中心教案授课科目:医学分子生物学授课内容:基因工程和体外表达授课对象：医学七年制、八年制授课时数：6学时授课教师：曾海涛授课地点：授课时间：授课教材：医学分子生物学（21世纪高等院校教材）胡维新主编，北京：科学出版社，2007，第壹版第八章基因工程和体外表达壹、目的要求：掌握：常用克隆载体；基因克隆的基本过程；外源基因在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达的原理和方法。
熟悉：限制性核酸内切酶和其他常用工具酶的概念和特点；定点诱变技术原理。
了解：昆虫表达系统；酵母表达系统。
二、讲授重点：基因克隆的基本过程。
三、讲授难点：α－互补筛选；阳性转染细胞的筛选；定点诱变技术原理。
四、教学方法：多媒体教学五、教具：多媒体课件六、讲授内容：第壹节基因工程中的工具酶壹、限制性核酸内切酶（restrictionenzyme）限制性核酸内切酶是基因克隆中最重要的工具酶，主要从原核细胞中提取。
它是壹种核酸内切酶，能从双链DNA内部特异位点识别且且裂解磷酸二酯键。
1．限制性核酸内切酶的分类Ⅰ型酶具有限制和DNA修饰作用。
这种酶在非特异性位点,通常在识别位点下游100到1000bp处切割DNA。
Ⅱ型酶能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。
Ⅲ型酶和Ⅰ型酶壹样，具有限制和修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测。
2．限制性内切酶的命名EcoRⅠE代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株3．限制性内切酶的识别和切割位点通常是4～6个碱基对、具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ粘性末端（stickyend）。
如EcoRⅠ切割后产生5ˊ粘性末端.PstⅠ切割后产生3ˊ粘性末端.有壹些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或钝端（Bluntend）,如SmaⅠ.二、其他常用的工具酶1.DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseI)有聚合酶活性,3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性,5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。
基因工程与基因体外表达培训课件
➢ 技术水平：分子克隆(molecular clone) （即DNA 克隆）
细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
路漫漫其悠远
➢DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质 （同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的 DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA 分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细 胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提 取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。
H.W.Boyer,第一个基因工程产品(SS)
1997年,动物克隆: 克隆羊多莉 2001年，人类基因组计划
路漫漫其悠远
一、重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆
➢ 克隆(clone):来自同一始祖的相同副本或拷 贝的集合。
➢ 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
路漫漫其悠远
GGATCC CCTAGG
路漫漫其悠远
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
路漫漫其悠远
GCCTAG+ GATCGC 粘端切口
➢同功异源酶：
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
路漫漫其悠远
➢ 生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶 工程、细胞工程等。
➢ 基因工程(genetic engineering) —— 实现基因 克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
分子生物学-基因工程与体外表达
5’
53’ ’ CTTAA G5’
9
PstⅠ切割后产生3ˊ黏性末端：
5 ́ -CTGCAG-3 ́ 3 ́ -GACGTC-5 ́
5 ́ -CTGCA
G-3 ́
3 ́ -G
ACGTC-5 ́
有一些酶沿对称轴切断DNA，产生平端或 钝端（Blunt end）, 如SmaⅠ：
5 ́ -CCCGGG-3 ́ 3 ́ -GGGCCC-5 ́
8
3．限制性内切酶的识别和切割位点
通常是4～6个碱基对、具有回文序列 （palindrom）的DNA片段，大多数酶 是错位切割双链DNA，产生5ˊ或3ˊ黏性末 端（sticky end）。
如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端：
5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’
5’ G AATTC3’
34
（一） 遗传学方法
1.
插 入 灭 活 法
35
2. 蓝-白筛选（α互补）
许多载体（如M13系列、pUC系列、pGEM系列）
都含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和氨基
端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一 个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶 羧基端部分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段 各自均无酶活性，但它们可以互补形成具ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ活性的β-
第八章 基因工程与体外表达
Gene Engineering and Gene Expression
曾海涛 中南大学生命科学学院
分子生物学研究中心
1
目的要求 • 掌握：限制性核酸内切酶的概念与特
点；质粒载体的特点；基因克隆的基本 过程。 • 了解：其他常用工具酶的特点。 • 【重点】基因克隆的基本过程。
医学分子生物学习题集 - 中南大学生命科学学院
结构，在 3′端有
。
11. 原核生物基因组通常仅由一条
分子组成，只有一个
。
12. 操 纵 子 是 指 数 个 功 能 相 关 的
串联在一起，构成信息区，连同其上游的
______及其下游的
构成的基因表达单位。
13.原核生物基因组中编码
的基因多为单拷贝，但编码
的基因为多拷
贝。
14.原核生物基因组 DNA 分子中具有多种功能的识别区域，如
不被翻译 E. 都是断裂基因
25.人类基因组包含的染色体数目为
（）
A.22 B.23 C. 24 D. 26 E. 46
()
A．可以表达基因产物
B．能专一地与阻遏蛋白结合
C．是 RNA 聚合酶的结合部位 D．是 DNA 聚合酶的结合部位 E. 是结构基因
9. 不属于真核基因表达调控的顺式作用元件的是
（）
A．启动子 B．增强子 C．操纵子 D．沉默子 E. 反应元件
10.由 AATAAA 和富含 GT 或 T 序列共同组成的顺式作用元件是
（）
A.基因密度高
B.无操纵子结构
C.有多基因家族和假基因 D.多复制起点品 E.有大量重复序列
4. 以下哪项是真核生物基因组结构特点
（）
A．只有一个复制起点 B. 有大量重复序列 C. 大部分是编码序列
D. 有操纵子结构 E.转录的 RNA 为多顺反子
5.增强子的作用是
（）
A.增强 DNA 复制 B.增强基因转录 C.增强基因稳定性 D.增强 RNA 的稳定性
13.逆转录病毒的三个基本结构基因不包括
（）
A. gag pol enV B. U3 pol U5 C.PB DLS R D. U3 R U5 E. C PB DLS
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Bam HⅠ GGATCC CCTAGG Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
G + GATCC CCTAG G
A + GATCT A TCTAG
二、其他常用的工具修饰酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• DNA聚合酶Ⅰ大片段
• 反转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团 • 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA 的3’-OH上；或进行同聚物加尾。 • Taq DNA聚合酶
DNA片段。
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载 体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基 因是要表达的，则要选择合适的表达载体。
三、DNA分子的体外连接
1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接
非配伍末端连接
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
• 重组DNA导入受体菌
• 重组体的筛选和鉴定
• 重组体的扩增、表达和其他研究
一、成片段，每一
片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重 组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子
克隆的混合体，这样一个混合体称为基因。一、限制性核酸内切酶一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水 解酶 特异核苷酸序列 ： 大多为 4~6 bp 回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’ 3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’ 1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及 与DNA结合和裂解的特异性，限制性内切酶可分为三 型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
λgt 系列（插入型，适用cDNA克隆）
charon系列
（三） 粘性质粒(cosmid)
粘性质粒(cosmid)：又称粘粒，由λDNA的cos区与质 粒构成，双链环状DNA，克隆容量：40～50kb。
（四）M13噬菌体
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长6.5kb。
复制型M13可用作克隆载体。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
5.同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Southern印迹
目录
4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA
最大优点：产生单链DNA
为了便于克隆外源DNA片段，在野生型噬菌 体DNA的Ⅳ基因和Ⅱ基因之间插入一段lacDNA。包 括lac启动基因-操纵基因序列以及编码β -半乳糖 苷酶头145个氨基酸的序列，并插入了多克隆位点
序列。
M13mp系列包括M13mp2、M13mp10、M13mp18、 M13mp19等。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体 目的基因 自连
载体自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作 用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制 造出粘性末端，再进行粘端连接。
四、将重组体DNA分子导入宿主细胞
1、转化
2.命名
• Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水号 举例： 流感噬血杆菌d株 （Haemophilus influengae d） Hind Ⅰ
Hind Ⅱ
Hind Ⅲ
5’AAGCTT 3’
Hind Ⅳ
3’TTCGAA 5’
3.识别和切割位点 回文结构 4～6 bp
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 出现两种末端 粘性末端 平头末端 粘端 平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端
粘端
4.同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
（二）λ噬菌体(λphage)
野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧
区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间
区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆）
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
二、表达载体
除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件—转录 和翻译所需的DNA序列。 （一）大肠杆菌表达载体 含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大 肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克 隆位点、转录终止信号。 1.启动子： trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子 中的操纵基因、SD序列融合而成。 λ 噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。 T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
若克隆基因的表 达产物与宿主菌 的营养缺陷互补, 那么就可以利用 营养突变菌株进 行筛选,这就是 标志补救.
α 互 补 的 检 测
目录
2、免疫学方法
利用特异性抗体检测表达产物
鸡的β肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法
3、核酸杂交法筛选特定DNA
原 位 杂 交
目录
第二节
基因克隆的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector)
为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽
链而特意设计的载体称为表达载体。
2.核糖体结合位点：SD序列
3.转录终止序列
(二)真核表达载体
真核表达载体至少要含两类序列： ①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复
制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因
标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的
大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制
繁殖得到足够使用的数量。
3、DEAE-葡聚糖法
4、脂质体介导基因转染
5、显微注射法
五、目的基因的筛选与鉴定
1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
λDNA
促进组氨酸合成
重组体
标 志 补 救
②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，
包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序
列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增
殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以 及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。
第三节 基因克隆的基本过程
• 制备目的基因和相关载体 • 目的基因与载体的连接
拷贝，或其表达产物。
基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其 相关的工作。
基 因 重 组 示 意 图
第一节 基因工程的工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端 cDNA合成 5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
（五）病毒载体
人类遗传病和肿瘤的基因治疗研究中，常
用的病毒载体有反转录病毒、 腺病毒、腺相 关病毒、HSV病毒。可将外源基因导入受体细 胞，以达到纠正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目 的。多数病毒载体已质粒化，病毒载体主要包 括病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子。
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
松弛控制型 (relaxed control)
在整个细胞周期中 随时都可进行复制 在细胞内一般在20 个以上, 甚至多达
数千个
克隆载体的的质粒应具备下列特点
分子量小，以容纳较大的外源DNA，有 较高的拷贝数； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称 为多克隆位点；便于外源基因插入。
第八章 基因工程与体外表达
克隆（clone） 无性繁殖 基因克隆(DNA重组、 DNA克隆、分子克隆): 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （复制子、重组体），继而通过转化或转染
宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细
胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子
盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq
G + GATCC CCTAG G
A + GATCT A TCTAG
二、其他常用的工具修饰酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• DNA聚合酶Ⅰ大片段
• 反转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶：去除5’端磷酸基团 • 末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)：将dNTP加到DNA 的3’-OH上；或进行同聚物加尾。 • Taq DNA聚合酶
DNA片段。
选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载 体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的基 因是要表达的，则要选择合适的表达载体。
三、DNA分子的体外连接
1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接
非配伍末端连接
同 一 限 制 酶 切 位 点 连 接
• 重组DNA导入受体菌
• 重组体的筛选和鉴定
• 重组体的扩增、表达和其他研究
一、成片段，每一
片段都与一个载体分子拼接成重组体DNA，将所有重 组体DNA分子都引入宿主细胞并进行扩增，得到分子
克隆的混合体，这样一个混合体称为基因。一、限制性核酸内切酶一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水 解酶 特异核苷酸序列 ： 大多为 4~6 bp 回文对称（palindrome sequence） 5’GAATTC 3’ 5’GGATCC 3’ 3’CTTAAG 5’ 3’CCTAGG 5’ 1.分类： 根据酶的基因、蛋白质结构、依赖的辅助因子及 与DNA结合和裂解的特异性，限制性内切酶可分为三 型，即Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。
λgt 系列（插入型，适用cDNA克隆）
charon系列
（三） 粘性质粒(cosmid)
粘性质粒(cosmid)：又称粘粒，由λDNA的cos区与质 粒构成，双链环状DNA，克隆容量：40～50kb。
（四）M13噬菌体
一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体，全长6.5kb。
复制型M13可用作克隆载体。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG G +GATCC CCTAG G
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GATCC G + G CCTAG
5.同尾酶 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Southern印迹
目录
4、PCR技术对特定DNA进行直接鉴定 5、利用限制性内切酶酶切图谱鉴定DNA
最大优点：产生单链DNA
为了便于克隆外源DNA片段，在野生型噬菌 体DNA的Ⅳ基因和Ⅱ基因之间插入一段lacDNA。包 括lac启动基因-操纵基因序列以及编码β -半乳糖 苷酶头145个氨基酸的序列，并插入了多克隆位点
序列。
M13mp系列包括M13mp2、M13mp10、M13mp18、 M13mp19等。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
T4 DNA连接酶 15º C
重组体 目的基因 自连
载体自连
3. 同聚物加尾连接
在末端转移酶(terminal transferase) 的作 用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制 造出粘性末端，再进行粘端连接。
四、将重组体DNA分子导入宿主细胞
1、转化
2.命名
• Smith和Nathame命名原则（1973）
属名 + 种名 + 株名 + 流水号 举例： 流感噬血杆菌d株 （Haemophilus influengae d） Hind Ⅰ
Hind Ⅱ
Hind Ⅲ
5’AAGCTT 3’
Hind Ⅳ
3’TTCGAA 5’
3.识别和切割位点 回文结构 4～6 bp
Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome)
GGATCC CCTAGG 出现两种末端 粘性末端 平头末端 粘端 平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端
粘端
4.同功异源酶： 来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
（二）λ噬菌体(λphage)
野生型λ噬菌体为双链线性DNA分子，两端各带12 个碱基的单链粘性末端。基因组分三个区域：左侧
区（含有包壳的病毒颗粒所需的全部基因）、中间
区（非必需区，但包含与重组有关的基因）、右侧 区（包含所有主要调控组分）。 系替换型载体，外源DNA：9 ～ 23kb 常用：EMBL 系列（置换型，适用基因组克隆）
GGATCC CCTAGG G CCTAG 目的基因用 Bam HⅠ切割
G CCTAG G CCTAG
Bam HⅠ切割反应
GATCC G 载体DNA用Bam HⅠ切割
+
GATCC G GATCC G
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG GGATCC CCTAGG
二、表达载体
除具有克隆载体的性质外，还带有表达构件—转录 和翻译所需的DNA序列。 （一）大肠杆菌表达载体 含复制起始位点、抗性基因、克隆位点，可以导入大 肠杆菌。表达载体中含启动子、核糖体结合位点、克 隆位点、转录终止信号。 1.启动子： trp-lac(tac)启动子：由trp启动子加上lac操纵子 中的操纵基因、SD序列融合而成。 λ 噬菌体PL启动子：一种温度诱导的启动子。 T7噬菌体启动子：表达效率很高的启动子。组氨酸缺陷 型大肠杆菌
无组氨酸 的培养基
若克隆基因的表 达产物与宿主菌 的营养缺陷互补, 那么就可以利用 营养突变菌株进 行筛选,这就是 标志补救.
α 互 补 的 检 测
目录
2、免疫学方法
利用特异性抗体检测表达产物
鸡的β肌球蛋白的克隆和免疫学检测方法
3、核酸杂交法筛选特定DNA
原 位 杂 交
目录
第二节
基因克隆的载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计
的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector)
为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽
链而特意设计的载体称为表达载体。
2.核糖体结合位点：SD序列
3.转录终止序列
(二)真核表达载体
真核表达载体至少要含两类序列： ①原核质粒的序列，包括在大肠杆菌中起作用的复
制起始序列、能用在细菌中筛选克隆的抗药性基因
标志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的
大肠杆菌系统中筛选获得目的重组DNA克隆、并复制
繁殖得到足够使用的数量。
3、DEAE-葡聚糖法
4、脂质体介导基因转染
5、显微注射法
五、目的基因的筛选与鉴定
1、采用遗传学方法筛选特定的重组DNA (1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue)
抗 药插 性入 标失 记活 选法 择
( )
酵母咪唑甘油磷 酸脱水酶基因
λDNA
促进组氨酸合成
重组体
标 志 补 救
②在真核宿主细胞中表达重组基因所需要的元件，
包括启动子、增强子、转录终止和加poly-A信号序
列、mRNA剪接信号序列、能在宿主细胞中复制或增
殖的序列，能用在宿主细胞中筛选的标志基因、以 及供外源基因插入的单一限制性内切酶识别位点等。
第三节 基因克隆的基本过程
• 制备目的基因和相关载体 • 目的基因与载体的连接
拷贝，或其表达产物。
基因工程：为实现基因克隆所采用的方法及其 相关的工作。
基 因 重 组 示 意 图
第一节 基因工程的工具酶
常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端 cDNA合成 5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
（五）病毒载体
人类遗传病和肿瘤的基因治疗研究中，常
用的病毒载体有反转录病毒、 腺病毒、腺相 关病毒、HSV病毒。可将外源基因导入受体细 胞，以达到纠正遗传缺陷或杀死肿瘤细胞的目 的。多数病毒载体已质粒化，病毒载体主要包 括病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记， 以及pBR322的复制子。
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
松弛控制型 (relaxed control)
在整个细胞周期中 随时都可进行复制 在细胞内一般在20 个以上, 甚至多达
数千个
克隆载体的的质粒应具备下列特点
分子量小，以容纳较大的外源DNA，有 较高的拷贝数； 具有一个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； 具有多个限制内切酶的单一酶切位点，称 为多克隆位点；便于外源基因插入。
第八章 基因工程与体外表达
克隆（clone） 无性繁殖 基因克隆(DNA重组、 DNA克隆、分子克隆): 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子 （复制子、重组体），继而通过转化或转染
宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细
胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子
盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq