乙型脑炎病毒的生物反应器培养及其灭活和纯化_苑志刚

中国生物制品学杂志 2014 年 10 月第 27 卷第 10 期 Chin J Biologicals October 2014，Vol. 27 No. 10
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· 技术方法 ·
乙型脑炎病毒的生物反应器培养及其灭活和纯化
苑志刚，刘岩，陈立新，韩慧丽，吴洋，李春艳，杨屹
长春生物制品研究所有限责任公司，吉林 长春 130062
中图分类号： R373. 3 + 1 R392-33 文献标识码： A 文章编号：1004-5503（2014）10-1309-04
DOI:10.13200/ki.cjb.000618
Culture of Japanese encephalitis virus in bioreactor and its inaห้องสมุดไป่ตู้tivation and purification
Corresponding author: YANG Yi，E-mail:yy9108047@ Abstract： Objective To culture Japanese encephalitis virus（JEV） in a large scale in NBS 14 L bioreactors，inactivate and purify the harvest and provide a reference for large-scale production of inactivated JEV vaccine（Vero cells）. Methods Vero cells were cultured at a high density in NBS 14 L bioreactor using FibralCel DISKⅠ carrier，into which JEV（P3V2） seeds were inoculated at MOIs of 0. 01，0. 1 and 0. 3 and subjected to perfused culture. Three batches of virus liquids were harvested and determined for titer，then inactivated with formaldehyde at various concentrations（100，200 and 400 ng ／ ml） at 4 and 25 ℃ and with β-propionolactone（BPL） at various ratios（BPL ∶ virus liquid were 1 ∶ 2 000，1 ∶ 4 000 and 1 ∶ 8 000） at 4 ℃ respectively. The inactivated virus liquid was inoculated to Kunming mice to verify the inactivation efficacy. The virus harvest was concentrated by ultrafiltration using an ultrafilter with entrapped relative molecular mass of 100 000 ， and purified by Sepharose 4FF chromatography. Results Three batches of Vero cells were cultured，at a platform density of about 1. 6 × 107 cells ／ ml. The titers of three batches of virus harvest were 8. 4，8. 1 and 7. 9 lgLD50 ／ ml respectively. The virus was completed inactivated with 200 ng ／ ml formaldehyde at 4 ℃ for 12 h，while the immunogenicity was qualified. After purification by Sepharose 4FF chromatography，more than 99% of proteins in the three batches of concentrated virus liquids were removed，while the recovery rate of antigen was more than 95%. Both the residual Vero cell protein and DNA met the requirements in Chinese Pharmacopoeia（Volume Ⅲ，2010 edition）. Conclusion JEV was cultured in a large scale in bio-reactor，and the recovery rate of antigen in the virus after purification by chromatography was high，which provided an experimental basis for large-scale production of inactivated JEV vaccine（Vero cells）. Key words： Japanese encephalitis virus（JEV）；Inactivated vaccine；Vero cells；Bioreactor；Column chromatography
1 材料与方法
1. 1 细胞及毒种 Vero 细胞和 JEV（P3V2）毒种均 由本公司疫苗研究室保存。 1. 2 实验动物 清洁级昆明小鼠，雌性，2 周龄，12 ～ 14 g，由本公司实验动物室提供，动物合格证号： 0016523。 1. 3 主要试剂及仪器 199 培养基购自北京清大天 一科技有限公司；新生牛血清购自武汉三利生物技术 有限公司；FibralCel DISKⅠ片状载体及 14 L 篮式生 物反应器购自美国 NBS 公司；ELISA 检测试剂盒购 自北京天坛生物制品股份有限公司；β-丙内酯购自 德国 SERVA 公司；Sepharose 4FF 介质购自美国 GE 公司。 1. 4 生物反应器的准备 向灭菌后的生物反应器中 加入 10 L 含 5%新生牛血清的 199 培养液，设定生物 反应器培养参数：温度为 37 ℃，pH 7. 2，搅拌速度为 100 r ／ min。 1. 5 Vero 细胞的接种及培养 向无菌验证合格的生 物反应器内分别接种约 5. 0 × 109 个 Vero 细胞 3批， 设定生物反应器细胞培养的工作参数：温度为 37 ℃， pH 7. 2，溶氧为 100%，搅拌速度为 100 r ／ min，灌流 培养。每天取样，应用生化分析仪检测培养基中的葡 萄糖含量，根据葡萄糖含量调整灌流速度。检测细胞 平台期密度，并计算增殖倍数。 1. 6 JEV 的接种、培养及收获 分别按 0. 01、0. 1 和 0. 3 MOI 将 JEV（P3V2）毒种接种至 3 个生物反应器内
的 3 批细胞上，37 ℃吸附 1 h；设定工作参数：温度为 34 ℃，pH 7. 6，溶氧为 80%，搅拌转速为 100 r ／ min，气 体通入控制模式为 4-gas。当葡萄糖含量低于 0. 3 g ／ L 时，开始灌流培养并连续收获病毒液（批号分别为 BD20121101、BD20121201 和 BD20121202），按照《中 国药典》三部（2010 版）中小鼠法检测病毒滴度，并 进行无菌及支原体检查。 1. 7 JEV 的灭活 1. 7. 1 甲醛灭活法 向 BD20121101 批病毒收获液 中分别加入 100、200 和 400 ng ／ ml 的甲醛溶液，分 别置于 4 ℃和 25 ℃环境下，于不同时间点取样，按照 《中国药典》三部（2010 版）要求进行病毒灭活验证 及免疫原性检测，病毒灭活验证结果要求小鼠全部健 存，免疫原性要求 100%保护。 1. 7. 2 β-丙内酯灭活法 病毒收获液中分别加入 1︰2 000、1︰4 000 和 1︰8 000（β-丙内酯︰病毒液） 的 β-丙内酯，置于 4 ℃灭活，于不同时间点取样，按 照《中国药典》三部（2010 版）要求进行病毒灭活验 证及免疫原性检测。 1. 8 JEV 的纯化 1. 8. 1 超滤浓缩 用截留相对分子质量为 10 万的 超滤器超滤浓缩 3 批病毒收获液，采用 ELISA 检测 试剂盒检测抗原含量，Lowry 法检测浓缩前后样品中 的蛋白质含量，计算蛋白去除率和抗原回收率。 1. 8. 2 柱层析 采用 AKTA 纯化系统，使用 Sepharose 4FF 介质对病毒浓缩液进行柱层析纯化，检测 A280 值。收集洗脱峰，采用 ELISA 法检测抗原含量；按照 《中国药典》三部（2010 版）附录Ⅸ B 中的方法检测目 的峰的 Vero 细胞 DNA 残留量（应不高于 100 pg ／ 剂）， 采用 Lowry 法检测层析前后样品中的蛋白质含量， ELISA 法检测牛血清白蛋白残留量和 Vero 细胞蛋 白质残留量，计算蛋白去除率和抗原回收率。
摘要： 目的 利用 NBS 14 L 篮式生物反应器大规模培养乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV），并对病毒 收获液进行灭活和纯化，为乙型脑炎灭活疫苗（Vero 细胞）的大批量生产提供参考。方法 用 NBS 14 L 篮式生物反 应器，以片状载体 FibralCel DISKⅠ为载体，进行 Vero 细胞高密度培养，分别按 0. 01、0. 1 和 0. 3 MOI 接种 JEV（P3V2） 毒种，灌流培养，收获 3 批病毒液，检测病毒滴度；分别使用不同浓度的甲醛（100、200、400 ng ／ ml）于 4、25 ℃和不同 浓度的 β-丙内酯（β-丙内酯︰病毒液分别为 1︰2 000、1︰4 000、1︰8 000）于 4 ℃对病毒收获液进行灭活，取灭活后 的病毒液，接种昆明小鼠，验证病毒灭活效果；用截留相对分子质量为 10 万的超滤器对病毒收获液进行超滤浓缩，用 Sepharose 4FF 层析柱对病毒浓缩液进行层析纯化。结果 共培养 3 批 Vero 细胞，平台期密度约为 1. 6 × 107 个 ／ ml。 3 批病毒收获液的滴度分别为 8. 4、8. 1 和 7. 9 lgLD50 ／ ml。以甲醛为灭活剂，作用浓度为 200 ng ／ ml，温度为 4 ℃ 时，作用 7 d 可完全灭活病毒，且免疫原性合格；以 β-丙内酯为灭活剂，作用浓度为 1︰4 000，温度为 4 ℃时，作用 12 h 可完全灭活病毒，且免疫原性合格。3 批病毒浓缩液病毒液经 Sepharose 4FF 层析柱层析纯化后，蛋白去除率达 99% 以上，抗原回收率在 95%以上，Vero 细胞蛋白质残留量和 DNA 残留量均符合《中国药典》三部（2010 版）的相关规 定。结论 成功实现了 JEV 的大规模生物反应器培养，层析纯化后病毒的抗原回收率较高，为乙型脑炎灭活疫苗 （Vero 细胞）的大批量生产提供了参考。 关键词： 乙型脑炎病毒；灭活疫苗；Vero 细胞；生物反应器；柱层析