新一代的流行性乙型脑炎疫苗

新一代的流行性乙型脑炎疫苗

新一代流行性乙型脑炎疫苗

张卓光

（成都生物制品研究所成都610023）

摘要流行性乙型脑炎是疫苗可预防疾病，近年开发新的Vero细胞乙型脑炎疫苗是一个热点。本文介绍了五种以Vero细胞为基质的乙脑疫苗，它们的研制情况及特点。

关键词流行性乙型脑炎Vero细胞疫苗

流行性乙型脑炎病毒，简称乙脑病毒。属于黄病毒科，黄病毒属，1935年在日本分离。乙脑病毒颗粒为球形、有包膜，直径45nm左右，其中核心30nm[1]。含有一条正链RNA编码一个多聚蛋白，它们分别裂解加工成结构蛋白C、PrM、M、E和非结构蛋白NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b、NS5。E蛋白是乙脑病毒的重要抗原，含有与病毒毒力密切相关的决定性氨基酸，能诱导产生中和抗体[2]。

它侵犯人中枢神经系统，所致流行性乙型脑炎(简称乙脑)是一种急性传染病，以蚊为传播媒介,主要在夏秋季流行。全球每年有约50，000例报告，主要分布于亚洲。20世纪90年代以来，乙脑流行区域有所扩大，一些原来为非乙脑流行的国家或地区也发生乙脑流行。如1990年美属塞班岛（位于西太平洋马里亚纳群岛）[3]，同年7～11月在印度的西北部[4]，澳大利亚最北部的托雷斯海峡（Torres Strait）的巴度（Badu）岛都首次报告发生乙脑[5]。乙脑不仅病死率高（30%），而且后遗症严重，约50%的幸存者有神经系统的后遗症。近年国内的广东、广西等地都有局部的暴发流行，现在对乙脑的防治措施主要是防蚊和接种疫苗。

1954年，日本学者开发出乙脑Nakayama株鼠脑灭活纯化疫苗，86年改为北京-1株[6]；70年代，中国学者开发出乙脑P3株地鼠肾细胞灭活疫苗；89年又研制出乙脑SA14-14-2株地鼠肾细胞减毒活疫苗。由于发现乙脑病毒适应于Vero细胞，而Vero细胞无外源因子和易于培养被WHO推荐做为生产疫苗的细胞基质，而以Vero细胞为基质已成功开发了狂犬和脊灰疫苗,并已广泛使用。因此，近年中、美、日三国学者都在以Vero细胞基质研制新一代的乙脑疫苗，虽然有乙脑的DNA疫苗（带有Pre-M+E基因）等新技术疫苗的报道[7]，但它们的应用还需要一定的时间。目前进展最快的，还是以Vero细胞为基质的新一代乙脑疫苗，而且它们有希望大规模应用，现在对它们做一个介绍。

1、乙脑P3株Vero细胞纯化灭活疫苗

北京生物制品研究所的丁志芬等，采用乙脑病毒P3株，在Vero细胞上传代适应，发现P3株在Vero细胞上传10代以后，免疫原性下降。故把P3株在Vero 细胞10代以内制备毒种和疫苗[8]。转瓶技术培养Vero细胞和乙脑P3株，滴度一般在7.0LgPFU/ml以上，病毒悬液经灭活、澄清、浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、蔗糖密度梯度离心纯化，制备成冻干疫苗。

其CF抗原在1∶16～32，相当于中国乙脑疫苗标准品（1∶4）和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品（1∶4）的4～8倍，其蛋白含量在25～29ug/ml，低于日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准（80ug/ml）；疫苗效力高于中国乙脑疫苗和日本鼠脑提纯乙脑疫苗标准品[9]。

用此疫苗除初免第1针有一过性发热外（体温中强反应率为12.4%），无其他不良反应。免疫2针后1个月中和抗体阳转率和几何平均滴度（GMT）分别为100.0%和1∶27.7[10]。

2、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化减毒活疫苗

武汉生物制品研究所吕文利等，用乙脑SA14-14-2株，接种于Vero细胞，3、6天收液，超滤浓缩、硫酸鱼精蛋白处理、Sepharose4FF凝胶过滤介质纯化疫苗，制成纯化Vero细胞乙型脑炎减毒活疫苗。滴度达7.2LgPFU/ml，免疫原性小鼠ED50为10-5PFU，蛋白含量20ug/ml,纯毒试验、外源因子、脑内致病力、乳鼠传代返祖试验全部合格[11]。

3、乙脑SA14-14-2株Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)

美国Walter Reed军事研究所Ashok k.Srivastava等，采用乙脑SA14-14-2株在原代狗肾细胞（PDK）传8代后的病毒，JESA14-14-2 PDK-8,在Vero细胞上，经传两代后，病毒滴度就增加了1000倍，从4.0LgPFU/ml 到大于7.0LgPFU/ml,更多代次未见病毒滴度增加。以Vero细胞4代建立主种子批，5代为工作种子批，6代为疫苗。

Vero细胞种毒后，3、5、7、9天收毒，滴度在7.0～8.0LgPFU/ml,第7天的滴度最高。病毒原液离心过滤去除细胞碎片，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白处理，蔗糖密度梯度离心，福尔马林灭活，Al(OH)3吸附，加硫柳汞，配制成Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)。

把Vero细胞纯化灭活疫苗(JE-PIV)与现在国际通用的日本鼠脑纯化乙脑灭活疫苗（JE-VaX），在小鼠模型做免疫原性和保护力对比，半数有效免疫剂量（ID50）JE-PIV是4ng，JE-VaX是15ng。JE-PIV引起100%中和抗体阳性的最低剂量是32ng。免疫小鼠后，用乙脑SA14株≤1000LD50的病毒量攻毒，需要保护50%的免疫小鼠的半数有效剂量（ED50）JE-PIV是2.6ng, JE-VaX 是1.5ng。保护100%免疫小鼠的JE-PIV的最低剂量是150ng。

疫苗的纯毒试验，用RT-PCR，分析核苷酸序列与公布的SA14-14-2株比较，只有5311核苷酸不同。疫苗是胸腺嘧啶（T），而公布的SA14-14-2株是胞嘧啶（C）。

此疫苗的优点是：（1）Vero细胞培养乙脑病毒，可用无血清培养基并达到较高的滴度（7.0～8.0LgPFU/ml）；(2)可反复收毒，易于大规模生产；（3）无血清培养基培养乙脑病毒，增加了疫苗的安全性，并可用简易、经济的纯化方法。在小鼠模型中，JE-PIV较JE-VaX在相同剂量下，都能保护小鼠，JE-PIV有更强的免疫原性。JE-PIV安全、有效、经济，将在志愿者中进行I期临床观察[12]。

4、乙脑北京-1株Vero细胞灭活纯化疫苗

日本Chemo-sero Therapeutic Research研究所的Keishin Sugawara 等，以乙脑北京-1株，Vero细胞为基质开发出灭活纯化疫苗。细胞库：Vero 细胞122代购自ATCC，126代建立主细胞库，129代建立工作细胞库。然后对细胞库进行生物安全检查合格。病毒库：使用无血清培养基培养北京-1株，种毒5天后收毒。在第2代建立主种子批（MVB），第4代建立工作种子批（WVB），第9代建立扩大种子批（EVB）。无菌试验，外源因子检测合格，核苷酸序列分析各种子批都一致。

为了便于大规模的工业生产该疫苗，开发了一条易于放大的工艺流程。采用培养罐、微载体技术培养Vero细胞，5L、50L、500L培养罐逐级放大，种毒后用无血清培养基培养病毒，第3天病毒滴度达高峰（9.0LgPFU/ml左右），第4天E蛋白酶标抗体（E-ELISA）检测达高峰，第4天收毒。去除细胞及碎片，超滤浓缩，福尔马林灭活，蔗糖密度梯度离心，柱层析，再加附加剂制成Vero 细胞灭活纯化疫苗。Vero细胞DNA含量223.0±41.39（pg/mg）,ELISA检