抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究

第４３卷　第３期陕西师范大学学报（自然科学版）Ｖｏｌ．４３　Ｎｏ．３　２０１５年５月Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｈａａｎｘｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｍａｙ，２０１５　文章编号：１６７２－４２９１（２０１５）０３－００６４－０４　ｄｏｉ：１０．１５９８３／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｓｎｕ．２０１５．０３．３３５收稿日期：２０１４－１０－２３基金项目：福建省自然科学基金资助项目（２０１２Ｊ０１４１１）；福建省教育厅科技项目（ＪＢ１１１７１）；莆田学院基金项目（２０１３００１）；莆田学院教改项目（ＪＧ２０１４２６）第一作者：张趁华，女，讲师，博士研究生，主要研究方向为细胞生物学。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｃｈｃｘｊ＠１２６．ｃｏｍ抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究张趁华１，蔡家利２（１莆田学院基础医学部，福建莆田３５１１００；２重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆４０００５４）摘　要：为探讨抗人大细胞肺癌单克隆抗体在临床免疫组化检测中的应用，制备了抗人大细胞肺癌单克隆抗体，纯化后鉴定其纯度，并应用于临床免疫组化检测大细胞肺癌。

结果显示，采用辛酸－硫酸铵法纯化小鼠腹水中的单抗效果较好。

免疫组化结果表明，制备的抗人大细胞肺癌单抗可特异性地鉴别人大细胞肺癌。

其可广泛应用于临床免疫组化检测中，为肺癌的早期诊断提供较可靠的辅助指标。

关键词：肺癌；单克隆抗体；免疫组化；诊断中图分类号：Ｒ７３４．２０２　文献标志码：ＡＴｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎＺＨＡＮＧ　Ｃｈｅｎｈｕａ１，ＣＡＩ　Ｊｉａｌｉ　２（１Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐｕｔｉａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｕｔｉａｎ　３５１１００，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ；２Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００５４，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃ，ｔｈｅ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ　ｗａｓ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ，ａｎｄ　ｉｔｓ　ｐｕｒｉｔｙ　ｗａｓ　ｍｅａｓｕｒｅｄ．Ｔｈｅｎ　ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　ｐａｒａｆｆｉｎ　ｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃａｐｒｙｌｉｃ　ａｃｉｄ－ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｓｕｌｐｈａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅｔｏ　ｐｕｒｉｆｙ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｉｎ　ａｓｃｉｔｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｏｕｌｄ　ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｌａｒｇｅｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｏｆ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ｌａｒｇｅ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｍａｙ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ｉｎｃｌｉｎｉｃａｌ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈ　ｃａｎ　ｐｒｏｖｉｄｅｓ　ａ　ｒｅｌｉａｂｌｅ　ａｕｘｉｌｉａｒｙ　ｉｎｄｅｘ　ｆｏｒ　ｄｉａｇｏｎｉｓｉｓｏｆ　ｅａｒｌｙ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｙ；ｄｉａｇｎｏｓｉｓ 单克隆抗体在生物学和医学研究领域具有很大的应用价值，可直接用于人类疾病的诊断、机体免疫机制的研究以及实验室科学研究等，尤其可为人类恶性肿瘤的免疫诊断提供较为可靠的辅助指标［１－２］。

在世界范围内肺癌的发病率和死亡率逐年上升，但肺癌的诊断技术并未十分完善，临床上常用的Ｘ线检查、支气管镜检查、ＥＣＴ检查等不仅耗时耗力，而且确诊率不高。

近些年免疫检测成为癌症 第３期张趁华等：抗人大细胞肺癌单抗用于肺癌检测的价值研究６５诊断的研究热点。

免疫组化检测以简易、快捷、通用、灵敏、重现性好、经济的特点在疾病免疫检测方法中占有重要的地位。

将肺癌单克隆抗体用于肺癌免疫组化检测中，将为肺癌的诊断提供较为可靠的辅助指标［３－４］。

目前，国内外临床诊断中还没有一种针对大细胞肺癌的有效诊断试剂，常用的血清ｐ５３抗体检测、癌胚抗原（ＣＥＡ）检测、神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）检测、细胞角蛋白片段（ＣＹＦＲＡ２１－１）检测等，特异性均不理想，本文所制备的抗大细胞肺癌单克隆抗体正好能解决这一问题。

其可广泛用于临床大细胞肺癌的检测诊断中。

１　材料和方法１．１　材料弗氏不完全佐剂（Ｆｒｅｕｎｄ′ｓ　Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅｄ　Ａｄｊｕ－ｖａｎｔ，ＦＩＡ，北京鼎国生物技术有限公司），６～８周龄Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠（重庆医科大学实验动物中心），羊抗鼠ＩｇＧ－ＨＲＰ（北京鼎国生物技术有限公司），其他试剂为国产分析纯，大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗人大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株（重庆理工大学生物制药实验室保存），ＤＭＥＭ培养基（ＧｉＢＣＯ公司）。

１．２　方法１．２．１　大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株的培养　用含１０％小牛血清的ＤＭＥＭ培养基对大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞株、小细胞肺癌Ａ５４９细胞株和抗大细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养，并在液氮中冻存数支［５－６］。

１．２．２　抗人大细胞肺癌单克隆抗体的制备和纯化鉴定　用弗氏不完全佐剂免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，３～５ｄ后，腹腔注射抗人大细胞肺癌杂交瘤细胞１～５×１０６个／只，接种细胞１０～１２ｄ后出现腹水，１２号针头插入腹腔引流收集小鼠腹水持续数日。

收集到的腹水采用辛酸－硫酸铵法纯化。

纯化方法如下：２　５００ｒ／ｍｉｎ离心腹水弃杂质，加入等体积的０．０６ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　４．０ＮａＡｃ－ＨＡｃ缓冲液，调ｐＨ至４．８；加入１／３３体积的辛酸，室温搅拌≥３０ｍｉｎ，４℃搅拌≥６０ｍｉｎ，逐滴加完，４℃澄清２ｈ；４℃，１５　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，去除白蛋白和其他非ＩｇＧ蛋白，上清加入１／１０体积的１０×ＰＢＳ（０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．４），调ｐＨ至７．２；上清滴加等量饱和硫酸铵（ｐＨ　７．２～７．４）溶液，使硫酸铵的饱和度为５０％，继续搅拌１０～３０ｍｉｎ，静置３０ｍｉｎ；４℃，１０　０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｎ，弃上清，将沉淀溶于１．２ｍＬ，０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　７．４ＰＢＳ中；４℃，０．０１ｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ　７．４ＰＢＳ透析过夜，其间换液３次，收集透析袋内液体，即为纯化后的腹水单抗，－２０℃冻存备用并取少量用于ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析纯化纯度［７－９］。

１．２．３　抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测（１）细胞爬片的制备：将处于对数生长期的大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞和小细胞肺癌Ａ５４９细胞的浓度分别调至３×１０６个／ｍＬ，将细胞悬液滴至灭菌玻片上，以铺满玻片为准，放置５％ＣＯ２培养箱中培养３６～４８ｈ后，用丙酮固定细胞爬片２０ｍｉｎ后，放置于－２０℃备用。

（２）免疫组化法鉴定细胞爬片：采用间接免疫组化检测法。

在细胞爬片上滴加３％Ｈ２Ｏ２／甲醇溶液，室温，１０ｍｉｎ，用于祛除细胞内源性过氧化物酶；封闭液１％ＢＳＡ封闭细胞爬片，３７℃，２０ｍｉｎ；一抗为稀释度为１∶２００的抗大细胞肺癌单抗，３７℃，１ｈ；二抗为稀释度为１∶４００的ＨＲＰ－羊抗鼠ＩｇＧ，３７℃，３０ｍｉｎ；显色液ＤＡＢ显色１０～３０ｓ后，苏木素复染，显微镜下观察。

阳性对照为大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞爬片，阴性对照为小细胞肺癌Ａ５４９细胞爬片［１０－１１］。

１．２．４　抗大细胞肺癌单抗对临床样品的特异性检测（１）石蜡病理切片的预处理：大细胞肺癌石蜡病理切片和小细胞肺癌石蜡病理切片均购于重庆医科大学附属医院。

大细胞肺癌患者两例，入院时症状均表现为咳嗽，痰中带血，胸痛，呼吸困难，头面部及上臂水肿，颈部淋巴结肿大，病理标本一例为胸腔镜检查所获，一例为纤维支气管镜检查所获；小细胞肺癌患者一例，入院时症状表现为咳嗽，胸闷，气短，头晕，吞咽困难，病理标本为纤维支气管镜检查所获。

将石蜡病理切片放置于６５℃的恒温箱中进行烤片，２ｈ；二甲苯脱蜡，１５ｍｉｎ；无水乙醇、９５％乙醇、８５％乙醇梯度脱水，每次５ｍｉｎ；微波修复抗原后备用［１２－１４］。

（２）免疫组化法鉴定石蜡病理切片：采用间接免疫组化检测法，方法同１．２．４（２）。

阳性对照为大细胞肺癌石蜡病理切片，阴性对照为小细胞肺癌石蜡病理切片。

２　结果２．１　抗大细胞肺癌单克隆抗体纯化结果采用辛酸－硫酸铵法纯化抗大细胞肺癌小鼠单６６　陕西师范大学学报（自然科学版）第４３卷抗腹水，如图１（ａ为中分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒ，ｂ为未纯化的腹水，ｃ为纯化后的腹水）所示，小鼠腹水中的杂蛋白已基本除去，抗大细胞肺癌单克隆抗体其纯度可达到９０％以上。

图１　抗人大细胞肺癌单克隆抗体纯化前后的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｍｏｂｉｌｉｔｙ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　ｂｅｆｏｒ　ａｎｄ　ａｆｔｅｒ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａ．中分子量蛋白Ｍａｒｋｅｒ；ｂ．未纯化的腹水；ｃ．纯化后的腹水。

２．２　抗大细胞肺癌单抗对培养的肺癌细胞的特异性检测结果抗大细胞肺癌单抗应用于间接免疫组化检测法检测大细胞肺癌细胞爬片和小细胞肺癌细胞爬片，检测结果如图２、图３所示，抗大细胞肺癌单抗能特异性地识别出大细胞肺癌细胞，染色液苏木素将细图２　大细胞肺癌ＮＣＩＨ４６０细胞爬片的免疫组化检测结果（×１００）Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｇ　ｃｅｌｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ＮＣＩＨ４６０ｃｅｌｌ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（×１００）大细胞肺癌细胞细胞核染为蓝色，细胞内与单抗特异性结合的抗原蛋白被染为黄色。