第四章 灭菌

实消 将配制好的培养基输入发酵罐（种子罐）内， 通入蒸汽直接加热，再冷却至发酵所要求的温度的灭 菌过程。 空消 将饱和蒸汽通入未加培养基的发酵罐（种子罐） 内，进行罐体的湿热灭菌过程。 连消 连续灭菌，将培养基在发酵罐外，通过专用消 毒装置，连续不断的加热，维持保温和冷却，然后进 入发酵罐（或种子罐）的灭菌过程。 美拉德（ Maillardom）反应 氨基酸的氨基与糖类的 羰基易发生反应，生成羰氨化合物，缩合成更复杂的 棕色到黑色化合物“类黑色素”的反应。



空气突然中断 要尽快关闭各设备空气进气阀，防止发酵液等 倒流入空气过滤器内。处理顺序为：发酵罐→种子罐→补料 罐→消沫剂罐→计量罐。同时关闭罐排气阀。 蒸汽压力变化 为确保灭菌彻底，如遇蒸汽压力突然下跌， 一时上不来，温度下降到规定范围以下，可适当延长灭菌时 间；如遇蒸汽压力突然升高，温度超过到规定值时，可适当 缩短灭菌时间。 灭菌时空气过滤器压差过大 若空气过滤器前后两个压力表的 压力差大于0.03MPa，说明滤芯以被浸湿或已损坏，这时应 立即停止灭菌，拆开过滤器检查，将滤芯吹干或更换滤芯后， 重新开始灭菌。
第四节 问题分析及处理手段

影响培养基灭菌的因素
影响培养基灭菌的因素除了培养基中所含杂菌 的种类、数量以及灭菌温度和时间外，还有培养基 成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等因素。

常见问题及其处理手段
灭菌后培养基质量差 主要是由于较高温度下 长时间灭菌，发生了化学反应，破坏了营养成分， 甚至产生沉淀或有毒物质。因此，为保证灭菌后培 养基质量不下降，要控制好灭菌温度与时间、调整 好原料的灭菌顺序等。
放罐或移种后，关闭种子罐或发酵罐的空气进气阀，开 排气阀，待罐压放尽后，打开人孔盖，用压力在3.0×105Pa 以上水仔细冲洗罐内壁、内件及搅拌。待水排尽后，关闭罐 底阀，微开空气进气阀通入少量空气。在搅拌磁力开关处挂 安全警示牌，在有人监护的情况下下罐检查。检查罐内各焊 缝、空气环形分布管、出料管、接种管、温度计套管、视镜 等是否有杂物堆积，是否被腐蚀或穿孔、搅拌叶及轴底瓦的 紧固情况。消除罐内死角，擦净视镜。

1．对数残留定律
在一定温度下，微生物受热后，其死活细胞个数的 变化如同化学反应的浓度变化一样，遵循分子反应 速率理论。微生物热死速率可以用分子反应速率表 示。研究证明，培养基中微生物受热死亡的速率与 残存的微生物数量成正比，这就是对数残留定律。 即：t = lLg 其中N为经过时间t灭菌后活微生物的残留数。 N0 为 灭菌前的菌体数。即灭菌的程度在计算中要选定一 个合适度，常采用N=0.001计算，也就是说1000次 灭菌过程有1次失败的可能。

2．培养基灭菌温度的选择
温度必须选择既能达到灭菌目的，又能使 培养基的破坏降至最低的灭菌温度。 工业生产上为了实现彻底灭菌和减少营养 物质的破坏，选择较高的灭菌温度，并采用较 短的灭菌时间，这就是通常所说的“高温快速 灭菌法”。
第三节 灭菌过程


湿热灭菌的方式主有实罐灭菌、空罐灭菌和连续灭 菌。 发酵罐或种子罐灭菌前的准备工作
第二节 灭菌原理
一、 灭菌的方法——物理法、化学法
物理法 （1）加热灭菌 ：干热灭菌和湿热灭菌 ①干热灭菌 灼烧灭菌法：利用火焰直接将微生物灼烧致死 干热空气灭菌：用干热空气使微生物细胞发生氧化、体 内蛋白质变性达到杀灭杂菌的目的。 ②湿热灭菌 利用饱和蒸汽灭菌的方法。湿法灭菌常用 于大量培养基、设备、管路及阀门的灭菌。 （2）过滤除菌：用过滤的方法阻留微生物达到除菌。 （3）电磁波、射线灭菌：产生的高能粒子进行灭菌，紫 外线最常用，穿透能力低，只能用于表面灭菌。


饱和蒸汽温度与压力不对应种子罐、发酵罐空罐灭菌操作 必须使用饱和蒸汽，如种子罐、发酵罐在进行空罐灭菌和 物料连续灭菌操作前，总蒸汽温度和压力不相互对应，即 空罐灭菌的蒸汽温度高于对应压力下饱和蒸汽温度或物料 连续灭菌的蒸汽温度超过对应压力下饱和蒸汽温度20℃以 上，须启用蒸汽增湿系统，将过热蒸汽增湿制成饱和蒸汽。 消后培养带菌 消后培养基带菌的原因及处理详见微生物发 酵及工艺控制一章的“染菌及其防治处理”。
图4-2 实罐灭菌示意图
图4-4 种子罐空消灭菌示意图
连续灭菌工艺流程
发酵罐附属设备、空气过滤器及管路等的灭菌



发酵附属设备的灭菌 发酵罐附属设备包括补料罐、计量罐和油（消沫剂）罐等。以上设备 灭菌一般可采用实消或空消的方式。 空气过滤器的灭菌 空气过滤器应在发酵罐或培养基灭菌前进行灭菌，灭菌后用无菌空气 将过滤介质吹干备用。 管路的灭菌 补料管路、消沫剂管路与补料罐及油罐同时进行灭菌，灭菌保温1小 时。移种管路的灭菌时间为1小时，蒸汽压力一般为（3~3.5）×105Pa。 移种及补料管路，用后必须用蒸汽冲净，以防杂菌繁殖。管路灭菌后， 管子冷却会造成真空，有遭外界空气入侵的危险。为避免这种危险，宜 于灭菌之后，通入无菌空气或醪液填充真空。
化学工业出版社

第四章 灭菌

第一节 手段
学习目标

了解基本概念及灭菌的基本方法； 掌握湿法灭菌的基本原理； 熟悉灭菌过程及注意事项； 理解各种因素对灭菌质量的影响。
第一节 基本概念



灭菌 利用物理或化学的方法杀灭或除去物料及设备 中一切生命物质的过程。 纯种培养 指仅让一种微生物的菌株在培养基内或培 养基上进行生长。 致死温度与致死时间 是指杀死微生物的极限温度。 在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间称为致死 时间。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。 热阻 微生物对热的抵抗力。是指微生物在某一特定 条件下的致死时间。相对热阻是指某一微生物在某条 件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时 间的比值。

出罐后盖上并上紧人孔盖，若在常压状态下压力 表指针不归零，应立即更换压力表 。开大空气阀， 关排气阀升压。待压力升至 0.1MPa后检查人孔 盖、搅拌机械密封及各法兰的严密度，压力表的 灵敏度和准确度，无误后关空气进气阀，开排气 阀将罐压放尽。检查接种阀、罐底阀胶皮垫，视 情况而定是否更换胶皮垫。关闭冷却水进、回水 阀，打开冷却水管上吹口及放水阀，等待灭菌消 毒。另外，发酵罐或种子罐冷却用的蛇管或夹套 要定期用8.0×105Pa的水试漏。
化学法 化学药剂与微生物发生反应而灭菌。适用于生 产环境及小型器具的灭菌等。方法：浸泡、擦 试、喷洒、气态熏蒸等。常用的化学药剂：高 锰酸钾、漂白粉、75%酒精溶液、新洁尔灭、甲 醛、过氧乙酸、戊二醛和酚类等。
二、湿热灭菌原理

湿热灭菌是借助于蒸汽释放的热能使微生物细胞 中的蛋白质、酶和核酸分子内部的化学键，特别 是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，使微生物 死亡。在对培养基灭菌过程中应该注意湿热灭菌 法对培养基营养成分的破坏也是很强的。因此， 在灭菌过程中应选择合适的工艺条件，既保证杂 菌能够彻底杀灭，又要使营养成分的破坏减少到 最小。 灭菌的彻底与否是以能否杀灭热阻大的芽孢细菌 为标准的。