大肠杆菌感受态细胞制备

大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天：
1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用
第二天：
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)
7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。

先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。

10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心，弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中
4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法
大肠杆菌电转化感受态细胞制备
第一天：
1. 将适合菌株(如XL1-Blue, DH5α)置于LB或其他营养丰富的培养基上，在37°C下过夜培养
2. 高温灭菌大的离心瓶(250-500ml)以备第二天摇瓶用
3. 准备几瓶灭菌水(总量约1.5升)，保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细胞用
第二天：
4. 转移0.2-1ml过夜培养物至装有500ml LB(或其他营养丰富的培养基)的1-2升挡板∑恐?
5. 37°C下剧烈振荡培养2-6小时
6. 定时监控O.D.600值(培养1小时后每半小时测定一次)
7. 当O.D.600值达到0.5-1.0时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却至少15分钟(需要的话这种方式可以存放培养液数小时)
8. 细胞在4°C 5000g下离心15分钟，弃上清液(如需要，沉淀可在4°C的10%甘油中保存一两天)
9. 用灭菌的冰水重悬浮细胞。

先用涡旋仪或吸液管重悬浮细胞于少量体积中(几毫升)，然后加水稀释至离心管的2/3体积。

10. 照上面步骤重复离心，小心弃去上清液
11. 照上面步骤用灭菌的冰水重悬浮细胞
12. 离心，弃上清液
13. 用20ml灭菌的、冰冷后的10%甘油重悬浮细胞 14. 照上面步骤离心，小心弃去上清液(沉淀可能会很松散)
15. 用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2-3ml
16. 将细胞按150μl等份装入微量离心管，于-80°C保存
转化方法:
1. 在冰上解冻电感受态细胞添加1-10μl DNA ，冰上培育约5分钟
2. 添加1-3μl DNA ，冰上培育约5分钟
3. 转移DNA/细胞混合物至冷却后的2mm电穿孔容器(无泡)中
4. 加载P1000，准备好300μl LB 或 2xYT
5. 对电穿孔容器进行脉冲(200 欧姆, 25μFd, 2.5 千伏)(检查时间常数，应该在3以上)
6. 立即添加300μl 的LB或2xYT至电穿孔容器中
7. 37°C下培养细胞40分钟至1小时以复原
8. 转移细胞至适当的选择培养基上培养
大肠杆菌感受态细胞的五种制备方法
方法一：
细菌转化的方法多以Mendel和Higa（1970）的发现为基础，其基本方法是用冰预冷的CaCl2或多种2价阳离子等处理细菌，使之进入感受态得以转化。

用CaCl2制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞，常用于成批制备感受态细菌。

本法适用于大多数大肠杆菌菌株，且迅速、重复性好。

操作过程简述如下。

1．从37℃培养16～20h的新鲜平板中挑取一个单菌落（如大肠杆菌DH52），或1ml新鲜的16～20h过夜培养物，转到一个含有100mlLB培养基的1L或500ml烧瓶中。

于37℃剧烈振摇培养约2～3h（旋转摇床200～300r/min），每隔20～30min测量OD600值≈0.4。

2．在无菌条件下将细菌转移到一个，用冰预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置10～20min。

3．于4℃用SorvallGS2转头（或与其离心管相配的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

4．倒数培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

5．以10ml用冰预冷的0.1mMCaCl2重悬每份沉淀，放于冰上。

6．于4℃用SorvallGS3转头（或与其相应的转头）以4000r/min离心10min，以回收细胞。

7．倒出培养液，将管倒置1min以使最后残留的痕量培养液流尽。

8．每50ml初始培养物用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉定，此时，可以迅速将细胞分装成小份，液氮中冰冻，-70℃贮存备用。

9．用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μl转移到无菌的微量离心管中，每管加DNA或连接反应混合物（体积≤10μl，DNA≤50ng），轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

10．将离心管放到预加温到40℃的循环水浴中的试管架上，放置90s～2min，不要摇动试管。

11．快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。

12．每离心管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温到37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

13．将适当体积（每个90mm平板可达200μl）已转化的感受态细胞转移到含200mmol/l MgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。

14．将平板置于室温至液体被吸收。

15．倒置平皿，于37℃培养，12～16h后可出现菌落。

方法二：
CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一种简单便捷的方法处理大肠杆菌，使其成为感受态细胞，便于质粒DNA的转化，可满足一般实验的要求。

与CaCl2法相比具有多种优点：使用方便，只需一步即可完成感受态细胞的制备；转化效率略高于CaCl2法，一般可达106-108cfu/μg，满足一般实验需要；感受态细胞制成后即可保存于-70℃,无须加入甘油，并且经长期保存活力无明显下降。

准备工作：
1．从液氮或低温冰箱中取出的大肠杆菌冻存菌，在LB平板上划线，37度过夜至长
出单菌落。

挑形态饱满的单菌落2个，分别接种5ml LB培养基中，37℃，250rpm，
过夜培养。

2．次日从5ml LB培养物吸取200μl转入50ml LB培养基中（250ml 锥形瓶），37
℃，250rpm培养2小时，此时OD600约0.4—0.5。

感受态细胞的制备：
3．吸取1ml菌液到1.5ml离心管里，5000rpm离心5分钟，弃去上清。

4．加入100μl预冷的Solution A，悬浮菌体，冰浴30分钟。

5．此时感受态细胞已经制成可立即使用或-70℃保存。

细胞转化：
6．在感受态细胞中加入100pg-10ngDNA，混匀，冰浴30分钟，然后42℃1分钟热
击，再次冰浴2 分钟。

加入0.9ml LB 培养基，20μl Solution B，37℃，振荡
培养1小时。

7．取适当菌液（100-200μl）涂布相应抗性的平板。

8．过夜培养约16个小时，数菌落数，计算转化率。

补充说明：
1．所用器具一定要清洁；
2．操作步骤2 中培养基的装量也是很重要的，建议装量不要高于此值：500ml 锥形
瓶装100ml培养基，250ml锥形瓶装50ml培养基；
3．在收获菌体前半小时还可以在培养基中加入20mM的MgCl2 ，效果会更好一些；4．为保证细胞处于对数生长期，培养后的菌体的OD值不要高于0.6；
5．制备感受态细胞时所有操作尽量保证在冰上操作；
6．细胞转化操作步骤6中也可以不必进行热击，冰浴后直接加入新鲜LB，简化操作
步骤，但转化效率低于热击方法，适用于对转化率要求不高的实验。

方法三：
1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜
2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0.3
3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴10min。

4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液
5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min
6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去上清液
7、将菌体悬浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr备用。

方法四：
（1）将1ml过夜培养的细菌（如DH52、TG1、TM101）接种于100ml2×YT培养于500ml烧瓶。

于37℃刷烈振荡，通常≥200rpm培养的细菌密度约OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h。

（2）将培养物放于冰上致冷10min，于4℃离心细菌培养物，10000rpm离心10min。

（3）弃除上清，将细菌悬浮于原始培养体积的一半（约50ml）的50mMCaCl2和10mm Tris•HCl （pH8.0）无菌冷冻液体中。

（4）将细菌悬浮放在冰上约5min，然后将悬浮物于4℃10000/rpm离心10min。

（5）弃上清，悬浮细菌于原始培养体积的1/15的50mMCaCl和10mMTris•HCl（pH8.0）无菌冷冻中。

此时的细胞是感受态细胞，即可用于转化。

200μl分装于无菌的1.5ml微量离心管中，贮存于-80℃冰箱中。

方法五：TSB法（也是本人热衷的方法）
1.药品制备
1M Mg2+ (1M MgSO4 和1M MgCl2等体积混合)，用0.22um滤膜超滤除菌。

TSB液（30mL/ 80mL菌液）（现配现用）：
PEG3350 3g
Tryptone 0.3g
Yeast extract 0.15g
NaCl 0.3g
以上1210C, 15min 灭菌后，加入1M Mg2+600uL , 以及DMSO 3mL
2. 步骤：
（1）活化菌株
（2）挑单菌落培养于5mL 的液笨培养基中
（3）取液体培养物50uL于80mL的液体培养基中进行扩大培养
（4）370C培养3－4小时，OD600在0.4－0.6
（5）离心，去上清
（6）加入20mLTSB，重悬
（7）离心，去上清
（8）加入10mLTSB，再加入15－20%的甘油，分装保存
注，整个操作过程均应在冰上进行。

所用药品均需灭菌。

转化程序
（
1）取出200μl感受态细胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上，加入DNA或连接反应混合物，DNA量通常≤50mg。

用手指弹打试管10次，使之混匀，然后放在冰上40～45min。

（2）将管放于42℃水浴中2min。

（3）然后每管直接加入1.0ml2×YT培养基，倒置混匀，并于37℃培养8～12h，干浴或水浴，不需振摇。

此期间使细菌生长并开始表达抗菌素。

（4）每200μl转化混合物分别于6个2×YT琼脂培养板上补充相应抗生素，并含有X-gal （20mg/ml）、IPTG（200mg/ml）。

（5）铺板使细菌混合物干后，倒转平板放于30～37℃培养箱中18～22h。

克隆在此期间应该出现，否则转化不成功。

常用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法除以上几种外，还有很多。

各种方法都各有其优缺点，我们在选择方法的时候应根据自己实验具体情况而定。

以期获得最高的转化效率
大肠杆菌感受态细胞的制备（实验室修改版）
1. 从-70冰箱取出菌种。

按1：1000比例接种复壮。

2. 划线培养到LB平板上，30度，16-20h.
3. 挑单菌落，取5ml摇过夜。

4. 接1ml加入到15ml培养基的比例，用大瓶摇（保证供氧）。

18度，摇6h以上（按实际生长情况延长。

5. 0.05M Cacl2悬浮后冰浴30分钟。

6. 4000rpm，10分钟。

7. 0.05M Cacl2今15%甘油重悬。

8. 200微升每份包装，-70保存.
视情况而定，第一步可省略，这个方法是我们实验室综合几种方法而改进的，用的情况不错，效率也挺高，可以保存至少两个月。