鸡血细胞的体外融合

鸡血细胞的体外融合

[实验目的]

1、了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融合的基本原理。

2、通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合的基本方法。[实验原理]

细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工方法使两个或两个以上的体细胞融合成异核体细胞，随后，异核体同步进入有丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞的基因组合在一起形成只含有一个细胞核的杂种细胞。

依据融合过程采用的助融剂不同，细胞融合可分为：

●病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒（HVJ）；

●化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇（PEG）；

●电场诱导的细胞融合；

●激光诱导的细胞融合

PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞融合。

商品PEG存在一系列不同分子质量的多聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液，能够产生高频率的细胞融合。

[实验材料]

注射器、滴管、烧杯、容量瓶、凹面载玻片、盖玻片、离心机、水浴锅、显微镜、细胞计数板、酒精灯、刻度离心管、

Hanks液：Hanks原液 100mL

重蒸水 896mL

0.5%酚红 4mL

配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签，经过灭菌后，4℃保存。GKN液：50%（m/V）PEG溶液

取50g PEG4000放入100mL瓶中，高压灭菌20min

让PEG冷却到50~60℃，勿让其凝固

加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀，至37 ℃保温备用。

詹纳斯绿染液、0.85% NaCl溶液

[实验步骤]

1、鸡血细胞悬液的制备

在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的GKN溶液，将细胞悬浮。取0.5ml

鸡血细胞悬液，加3.5ml GKN溶液。镜检，在血细胞计数板上计数。稀释至1X107个/ml，于37℃保温。

2、鸡血细胞的收集

吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加入4mlHanks液混匀，1000rpm离心5min。弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使沉淀的血细胞团块松散。

3、PEG诱导细胞融合

吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离心管，使PEG与细胞混匀，然后在37℃水浴中静置2min。

4、终止PEG作用

缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混匀，于37℃水浴中静置5min。

5、制备细胞悬液

用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散，1000rpm离心5min，使细胞完全沉降。弃去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃多数上清，留少许溶液，混匀。

6、染色和镜检

吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴，加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min 后盖上盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。

注意事项：温度、融合时间、PEG的浓度与作用时间、细胞密度、机械力等因素均影响融合率，实验操作时应予以注意，并在需要的时候及时镜检。[实验结果]

1、细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。

融合率 = 视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数×100％

2、测定时要进行多个视野计数，并进行统计分析。