用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别
巢式PCR扩增SRY基因序列鉴定牛胚胎性别的研究
ＢＡＩ ｅ ｑｎｅ ｌ （ ｏｌｇ ｆ ｉ ｌ ｃｅｃ ｎ ｔｒｎｒ ， ｈ ｎ ａ ｇ ｃ ｌ ｒｌ ｎｖｒｉ ， ｈ ｎ ａ ｇ Ｌａｎｎ １ １ １ ｎ ｌ ｔ Ｗ ａ Ｃ ｌ ｅｏ Ａｎｍａ ｉｎ ｅａ ｄＶｅｅｉａｙ Ｓ ｅ ｙ ｎ ｅ Ｓ Ａ ｕｔ ａ ｉｅｓ ｙ Ｓ ｅ ｙｎ ， ｉｏ ｉｇＩ０ ６ ） ｕ Ｕ ｔ
ｎ ｓｅ ＣＲ ｍｅｈ ｄｆ ｍ ｈ ｎ ｌｔｉｓｓ ｏ ｄｔａ ｉ ｍ ｔ ｏ ｓ ｆ ｃｉｅ ｎ ｎ ｉ ｖ ｅｔ ｄＰ ｔｏ ｏ Ｃ ｉ ａＨｏｓ ｎ ｈ ｗｅ ｔ ｈｓ ｅｈ ｄｗａ ｆ ｔ ｄ ｓ ｓ ｉ ｒ ｅ ｈ ｔ ｅｅ ｖａ ｅ ｔｅ
扩 增 Ｓ Ｙ基 因特 异序 列法 就 是 在 此 理 论 基 础上 发 展 起 来 Ｒ
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安徽农业科学 ， ｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｒ Ｓｉ２０ ， ４ ８ ：５９ １９ Ｊ ｒ ｈｉ ｇｉ ｅ．０ ６ ３ （ ）１８ —５ ０ ｏ ａｏＡ ．
责任编辑 朱永和 责任校对 朱永和
巢式 Ｐ Ｒ扩增 Ｓ Ｙ基 因序列鉴定牛胚胎性别的研 究 Ｃ Ｒ
关键 词 牛 胚胎 ； 式 Ｐ Ｒ 性 别鉴 定 巢 Ｃ；
中图分类号 ￥２ ． ８３ Fra bibliotek３文献标识码
Ａ 文章编号 ０ １—６ １２０ ）８ １８— ２ ５７ ６ １（０ ６０— ５９０
Ｓ ｕ ｙｏ ｅ ｔ ｒ ｎ ｔ ｎ ｏ ｏ ｉ ｅＰ ｅ ｉ ｌｎ ａ ｉ ｎＥｍｂ ｙ ｓｂ ｓｅ ＣＲ ｔ ｄ ｎＳ ｘ Ｄｅｅ ｍｉａ ｉ ｆ ｖｎ ｒ － ｏ Ｂ ｍｐ ａ ｔ ｔ ｏ ｒ ｏ ｙＮｅ ｔ ｄ Ｐ Ａｍｐｌｙ ｎ ｌ ｅ ｕ ｎ ｅ ｆＳ ｌ ｉ ｇｔ ｅＳ ｑ ｅ ｃ ＲＹ ｎ ｌ ｉ ｏ Ｇｅ ｅ
用巢式PCR对孕妇外周血中的单个有核红细胞进行胎儿性别诊断
中 华 医学 遗 传学 杂 志 ２ ０ 年 ２月 弟 １ ０２ ９誊 第 １期
Ｃ ｉ ＪＭ Ｇｅ ｅｔＦ ｂｕ ｒ ０ ２ ｏ．１ ｔ ． １ ｈｎ ａｔ ｅ ｒａｙ２ ０ ，Ｖ １ ９ Ｎｏ
８ ・ ５
・
临床遗 传学研 究 ・
１２ 方 法 ．
（ 上海 Ｐ ｏ ｇ 司）及扩增产物各 １ 加上样缓 冲液 １ ， ｒｍｅａ公 ０ ｌ
混 匀后点样 于 ２ 琼 脂糖凝胶 （ ０ ５￣ ／ 演化 乙啶 ） 电 含 ． ｇ ｍｌ 中 泳， 检测是 否存 在 Ｓ ＲＹ基 因。 ２ 结果
１２ １ 有核 红细 胞形 态 的观察及 计数 ．．
ｍｌ ｎ以提取 Ｄ ＮＡ 并使蛋 白质降解 。第 １孜扩增反应 每管反应
体积为 ５ ， 中古有 １对外 引物 （ １Ｐ ） ０ ６￣ ｏ／ ４ ０ 其 Ｐ ， ２ 各 ． ｍ ｌＬ， 种 ｄ Ｐ（ 海 Ｐｏ ｇ ＮＴ 上 ｒｍｅａ公 司） ０３ｍｍｏ／ １ 各 ． ｌＬ， ×缓 冲液 ，． １５ ｍｍｏ ／ Ｍｇ Ｉ ， ｑ （ 国 Ｐｏ ｇ 公 司 ） Ｕ， Ａ摸 板 Ｉ ］ Ｌ Ｃ ２ Ｔａ 酶 美 ｒｍｅａ ２ ＤＮ
１ １ 对象 ．
‘ ６名 ２ ～３ 、４ ６孕周的单胎 妊娠妇女 ， ｌ ５岁 １ ￣２ 均
无严重贫血 （ ＞９ ／ 及 心 、 肝等 系统的妊娠合并症。 Ｈｂ ０ Ｌ） ｇ 肾、 取 肘 前静脉血 ２ｍｌ 另取健康男性与健康未孕且 无既往妊娠史的 。 女 性静脉血分别 作为阳性及 阴性对照 。所有血样粒细胞及单核细胞。在 ４ ６名孕 妇样 本 中， 共发现 １ ９ ６ 个有核红细胞。每例样 本中为 ｌ 个有核红 细 ～８ 胞， 与母血 有棱细胞数之 比为 Ｏ ０ ３ ～Ｏ０ １ 。１ ．０ ８ ．５１ ０名未孕 妇女 血样中均未发现有核红细胞． ２ ２ 巢式 Ｐ Ｒ 诊断胎儿性 别的结果 ． Ｃ ４ ６名孕 妇中经 实际 出 生性别证实怀男胎 ３ 名 ， ０ 其中巢式 Ｐ ＣＲ扩增出 Ｓ ＲＹ基因即 Ｙ
利用巢式PCR 进行牛早期胚胎性别鉴定的研究
利用巢式PCR进行牛早期胚胎性别鉴定的研究 张伟1，王世银2，蒋晓新1，张兆旺3，赵兴绪4，郑新宝5，陈静波5（1. 新疆农业职业技术学院动物科技学院新疆昌吉 831100；2. 新疆农业职业技术学院继续教育学院，新疆昌吉 831100；3. 甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃兰州 730070；4. 甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州 730070；5.新疆畜牧科学院畜牧科学研究所，新疆乌鲁木齐 830000；）摘要：本实验利用牛性别决定基因（SRY）和酪蛋白αs1基因（CSN1S1）分别设计雄性特异性引物和内标引物，两对引物均各设计一对嵌套式引物建立多重巢式PCR体系，SRY基因和CSN1S1基因外、内引物扩增片断长度分别为357bp、232bp、528bp和367bp。
实验结果表明，该巢式PCR体系灵敏度可达到5pg，约相当于1个细胞，准确率可达到100%，故可以很好的满足胚胎性别鉴定的需要。
关键词：牛；性别决定基因；酪蛋白基因；胚胎；性别鉴定根据生产的需要，人为控制家畜出生后代的性别比例，以达到快速繁殖优良品种、扩大优良母畜利用率的经济目的，已成为畜牧业重要生物技术研究课题之一，因此家畜胚胎性别鉴定技术将对畜牧业的发展和遗传育种工作具有重要的经济意义和理论意义。
家畜的性别为XY性决定，即是否含有Y染色体是个体发育为雄性或雌性的关键。
以往的胚胎性别鉴定方法大多以此为基础，如采用H-Y抗血清的免疫学方法[1]，进行染色体核型分析的细胞遗传学方法[2]，乃至利用Y染色体片段制作核酸探针的杂交法[3]，这些方法都有准确率不高、费时或不适于应用到实际生产中等的缺点而难以推广。
利用PCR技术扩增牛的性别决定基因（SRY）进行胚胎的性别鉴定，能够用较少的时间取得较高的可靠性，具有较好的生产利用前景。
本实验采用牛的性别决定基因（SRY）作为雄性特异性引物，以酪蛋白αs1基因（CSN1S1）为内标引物多重巢式PCR体系，进行牛早期胚胎性别鉴定。
用PCR扩增法检测性别.
8、电泳缓冲液：5×TBE贮存液
9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4℃暗存。
10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%
二甲苯青，30%甘油于水中。4℃贮存。 11 、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制 胶模和加样孔梳齿。 12、透射紫外灯、照相机和胶带纸。
实验步骤： （一）、SRY基因引物设计 Y1.5 5ˊ-CTA GAC CGC AGA GGC GCC AT- 3ˊ Y1.6 5ˊ-TAG TAC CCA CGC CTG CTC CGG- 3ˊ 扩增DNA片段长度239bp
用PCR扩增法检测性别
原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，
PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA （模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性 结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长 引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间 的DNA片段。 。 人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体 地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定 因子(testis determining factor,TDF)基因 所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育， 即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位 于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域， 该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。
3、待胶冷却至50℃左右，加入溴化乙锭（终浓 度为 0.5μg/ml ，每 10ml 加入 1μl 原液），充分 混匀后倒入胶模。注意要避免胶体中产生气泡， 若有气泡可用吸管小心吸去。待胶凝结后，通 常需要在室温中放置 30-45 分钟（也可用保鲜 膜将凝胶包好，置 4℃1-2 小时以增加凝胶强 度），非常小心地移去梳子和胶带纸，将凝胶 放入电泳槽。加入电泳缓冲液，使液面高出凝 胶表面1-2mm。 4 、向 DNA 酶解管中加入 1/10 体积的上样缓冲 液，充分混合。用微量移液器将样品依次加入 加样孔内。注意孔中不得留有气泡，加样时吸 管头也不必插入孔中，可对准孔，在孔的上方 加样，使样品自然沉入孔内，以避免吹出的气 泡将样品冲出孔外。
PCR技术及其在动物胚胎性别鉴定中的应用研究
PCR技术及其在动物胚胎性别鉴定中的应用研究黄国清 潘 珂 陈 颖 (江西农业大学动科院 南昌330045) (江西民星企业集团) PCR(Polymerarse Chain Reaction)为聚合酶链式反应或体外扩增技术,是1985年美国Cetus公司人类遗传部、加利福尼亚大学洛杉矶和Howghes医学院等联合创建的一项体外酶促扩增DNA新技术,具有特异性强、敏感性高、操作简便、快速高效等特点,现已广泛用于生物医学、传染病原、遗传缺陷、畜禽疾病诊断、考古学等许多领域。
最近一些年来,国内外将PCR技术用于鉴别哺乳动物胚胎的性别,并取得了不少成果。
现将PCR技术发展及其在动物胚胎性别鉴定上的应用作一概述。
1 PCR技术的基本原理PCR技术原理类似于天然DNA的复制,主要是利用DNA聚合酶依赖于DNA的特性,模仿体内的复制过程,在附加的一引物之间诱发聚合酶反应。
PCR全过程包括DNA模板变性、退火、延伸3个步骤的若干次循环。
首先是双链态的靶DNA在高温作用下变性解链,产生单链DNA;然后降低温度使人工合成的2个寡核苷酸引物分别与各自的互补DNA杂交(退火)而定靶DNA的特定区域;在Taq DNA聚合酶的作用下,在4种dDNA底物存在时,引物链将沿着5′～3′方向延伸与模板互补形成新链。
新合成的引物延伸链经高温变性后又可作为模板参与下一轮循环,结果使靶DNA分子量呈指数增多。
2 PCR技术的研究进展PCR技术建立后几年里,发展相当快,取得了突破性进展,特别是它的临床诊断研究已遍及全世界,下面将介绍近年来推出的PCR新方法。
2.1 不对称PCR(Asymmetric PCR)在PCR反应系统中加入不同量的两引物,经若干循环后,量少的一种引物消耗完毕,只剩1种引物参与以后的循环反应,结果可获得DNA两条链浓度不等的放大产物。
当两引物的克分子浓度相差很大时,就可获得1条单链的浓度大大高于另一条单链的放大产物。
用PCR扩增法检测性别
2μl（2.5U/100μl）
总量
100μl
2、 混匀，短暂离心。 3、 PCR条件 Y1.5/ Y1.6PCR扩增条件： 变性 95℃5分钟
变性 94℃75秒 Байду номын сангаас性 55℃90秒 延伸 72℃150秒
循环30次。 扩增产物冷却至室温可于4℃保存。
（三）、扩增产物分析（方法参见实验四、琼脂 糖凝胶电泳分离DNA片段）
6、 液体石蜡（高压灭菌）
琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段 7、电泳级琼脂糖 8、电泳缓冲液：5×TBE贮存液 9、5mg/ml的溴化乙锭溶液，4℃暗存。 10、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%
二甲苯青，30%甘油于水中。4℃贮存。 11、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制
胶模和加样孔梳齿。
6、当溴酚蓝泳动到一定位置时，停止 电泳。分离大片段DNA时，溴酚蓝可 能已泳出胶，可根据二甲苯青的位置 判断终止时间。电泳完成后可直接在 透射紫外灯下观察结果。
7、用加红色滤色镜的相机，光圈放到 最大，曝光15-30秒，拍照记录。
用PCR扩增法检测性别
原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR）的基本原理是，通过热变性使目的DNA （模板DNA）双链解开；通过退火将引物复性 结合到它们的互补位置；通过DNA聚合酶延长 引物，反复循环体外扩增出大量一对引物之间 的DNA片段。 。
人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体 地说是由Y染色体上编码睾丸发育的睾丸决定 因子(testis determining factor,TDF)基因 所决定，TDF基因的存在决定着睾丸的发育， 即决定个体发育为男性。研究表明TDF基因位 于Y染色体短臂与拟常染色体相接的35kb区域， 该区域又称为Y染色体性别决定区（sex determining region of the Y，SRY）。 。
PCR血液试验揭示胎儿性别
即提 取的 全 部 血
。 , 。
样 分析
包括插 入 子 宫 内提取 羊水 或绒 毛 ( 围
,
以 避免 意外 污 染 另外
绕着胎 囊 的 毛 发样 附器 ) 采 用 的这 两种 方 法均 有轻 度致 流 产 的危险 性 功
,
在2 0 周 期 以后 总是 产生 假 阳 性结 果 发现
口
,
研 究人 员
如果 研制 获 得完 全 成
周期
、
而 妊娠 晚期可 少 扩 增 几 周 期
e e
衰 波译 自B i o t
h Ne ,
5
1 0 ( 1 ) , 10 J a
,
o
.
1 1 1 9 9 0 谭健校
,
小剂量 阿 司 匹 林 和孪生妊娠
研究 人 员报 告 了 以 下 一 项随 机 对 照 试 验 结 果
. ,
不 全对胎 儿 有益
。
研 究 人员提 示
。 ,
因 为 往后胎 母 亲总数 胎儿 总数 进入研 究计 划时的妊 娠均期 ( 周 ) 分娩时的均期 (周 ) 平均出生体 重 (克 ) ( 标准差 )
安 慰 剂组
12
2 4
他们 还 旨在 确 定胎盘 血
,
管 受 限是否可说 明在 正 常 妊 娠 6 个多 月 中 所 见 到 的胎 儿 生 长 速 度减慢
。
O 一 , 上 八 ó
将无 夹 杂 情况 的孪生
。
3 周 的孕 妇 纳入 研 究 计划 妊娠 2 8 ~ 0
。 .
用 阿司 匹
28
。
5
、
2 8
。
9
林 1 0 毫 克 或胎 盘 片 随 机治 疗 结 果 列于 以下 附 表
PCR法鉴定牛早期胚胎性别的研究
PCR法鉴定牛早期胚胎性别的研究概述牛是我国重要的畜牧业品种之一，对于畜牧业的发展起着至关重要的作用。
而对于牛的早期胚胎性别的鉴定在畜牧业中也是非常重要的一环，对于繁殖、选育等方面都有着重要的意义。
传统的方法是通过B-ultrasonic检查来鉴定胚胎性别，但这种方法在早期胚胎中往往难以准确鉴定性别。
因此，近年来，PCR法作为一种新兴的方法被广泛应用于牛早期胚胎性别的鉴定。
本文将主要介绍PCR法在牛早期胚胎性别鉴定中的研究进展。
PCR法原理PCR法（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链反应，是一种能够扩增DNA的技术。
通过PCR法可以在体外迅速而精确地复制一段DNA序列，从而可以研究该DNA序列的结构、功能等。
PCR法的原理是先将DNA 进行变性，使其分离成两条单链，然后通过引物的作用，在酶的催化下将两条单链DNA复制得到两条完整的DNA双链，再重复这个过程，就可以迅速扩增出大量的目标DNA序列。
PCR法在DNA复制过程中引入荧光标记等技术，可以对目标DNA进行检测，从而达到对DNA进行快速、准确的检测的目的。
PCR法在牛早期胚胎性别鉴定中的应用PCR法在牛早期胚胎性别鉴定中的应用主要是通过对性别相关基因的检测来确定胚胎的性别。
在牛的性决定中，XY染色体的母体和父体携带情况决定了胚胎的性别。
因此，通过PCR法检测XY染色体上的性别相关基因，可以准确鉴定牛胚胎的性别。
目前，常用的性别相关基因有SRY基因、AMEL基因等，通过对这些基因的PCR扩增后检测，可以准确鉴定出牛早期胚胎的性别。
研究进展近年来，国内外的许多研究都在探讨利用PCR法来鉴定牛早期胚胎的性别。
研究发现，PCR法在牛早期胚胎性别鉴定中具有准确性高、重复性好、操作简单等优点，有望成为未来在畜牧业中应用的一种主流方法。
同时，还有研究进一步探讨了PCR法在牛胚胎克隆、基因筛选等方面的应用，为未来畜牧业的繁殖、选育等提供了新的方法和手段。
应用PCR技术扩增SRY基因检测性别
应用PCR技术扩增SRY基因检测性别作者：吴晓东张博文王博楠等来源：《赤峰学院学报·自然科学版》 2013年第14期吴晓东，张博文，王博楠，李争芳，史莉莉，史铁伟，白春英（赤峰学院医学院，内蒙古赤峰 024000）摘要：本文介绍了一种从基因水平快速、简捷地鉴定性别的方法及该方法的实际应用价值.PCR（polymerase chain reaction）技术是目前最常用的体外扩增DNA片段的技术，SRY （sex determining region of the Y）基因是男性特有的基因，位于Y染色体上.在SRY基因区域设计特异的引物，利用PCR技术,以管家基因GAPDH为内参照，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.该法可对一滴血、一根毛发、多年的尸块、胎儿、有争议的性别进行性别鉴定.广泛应用于法医鉴定、无创孕期胎儿性别鉴定以预防X连锁隐性遗传病患儿的出生以及对有性别争议的运动员体检等.目前赤峰市的各大医院还未开展此技术，值得推广.关键词：PCR技术；SRY基因；性别鉴定中图分类号：R-33 文献标识码：A 文章编号：1673-260X（2013）07-0138-041 引言性别鉴定一直是医学领域的一个很有意义的话题，随着技术的不断革新，性别鉴定的方法也由过去传统单一的方法，逐渐向分子生物学多手段结合的方法过渡.传统方法，如通过性染色质鉴定性别，存在着准确率低的缺点[1].羊膜腔穿刺结合染色体核型分析方法，虽然准确率高，但检测所需时间较长（约23天左右），且容易损伤胚胎，对于单胞胎来说，胎儿死亡率为0.6%，还有引发孕妇并发症的可能性.B超鉴定性别要求孕妇妊娠5个月以上，虽然安全性较高，但是受操作者的业务熟练程度等因素影响较大.相对传统方法来说，分子生物学方法最具优势[2].我们采用的是分子生物学的PCR扩增法，以男女都有的管家基因GAPDH为内参照，扩增男性特有的SRY基因，若能扩增出SRY基因片段，即可判断为男性，否则为女性.性别决定基因（sex determinationg region of the Y，SRY）指Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段，是启动睾丸形成的主要基因.人的SRY基因位于Y染色体短臂Yp11.3，只含有一个外显子，没有内含子，转录单位长约1.1kb，编码一个204氨基酸的蛋白质.SRY基因在男性的减数分裂过程中，按父系遗传，涉及性别决定至少1亿3千万年了[3,4].聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA的技术[5].本研究中利用PCR技术扩增SRY基因和内参照基因（GAPDH），可以在短时间内（3个小时左右）获得大量的目的基因，然后通过电泳检测结果，根据是否可以扩增出SRY基因来进行性别的鉴定.从采样到出结果只需5到7个小时，该方法的优点是简单、快速、高效、敏感度高，样品可以取自带毛囊的毛发，血液，多年的尸块等.所以，利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要的现实意义.2 材料和方法2.1 材料2.1.1 材料及来源外周血和毛发（含毛囊）均来自发育健康的志愿者，分别包括男性2名，女性2名.2.1.2 试剂和药品引物合成由北京赛百盛基因技术有限公司完成；毛发基因组DNA提取试剂盒和血液提取基因组DNA试剂盒均购自北京百泰克生物技术有限公司；红细胞裂解液购自北京索莱宝科技有限公司；琼脂糖是西班牙原装进口；其它试剂和药品均为国内生产，由赤峰学院分子医学研究中心提供.2.1.3 仪器设备真空浓缩仪（VC-15SP）；PCR仪（ABI2720）；超微量分光光度计（NanoDrop 2000）；全自动凝胶成像仪(Tocan240)，电泳设备(北京六一仪器厂)；低速离心机，高速离心机，涡旋混合仪，高压灭菌锅，eppendorf移液器等设备均由赤峰学院医学院分子医学研究中心提供.2.2 方法2.2.1 引物和样本 SRY基因和GAPDH基因引物的设计见表1，样本选择了外周血和带毛囊的毛发，之前的实验证明利用外周血基因组DNA扩增SRY基因判断性别是完全没有问题的，而用一根带毛囊的毛发是否能够扩增出SRY基因在本实验室还未曾做过，因此，设计实验时以男性的基因组DNA作为阳性对照，以女性的基因组DNA作为阴性对照.2.2.2 样本的采集与处理2.2.2.1 外周血的采集与基因组DNA的提取（1）采血用带有抗凝剂(EDTA)的采血管采志愿者的外周血3mL，上下翻转5~6次，否则血液会出现凝集.（2）收集白细胞血细胞中的红细胞没有细胞核，基因组DNA要从白细胞中提取.具体步骤见参考文献[6]，白细胞于-20度保存或直接提取基因组DNA. （3）从白细胞中提取基因组DNA 具体步骤如下：将上次实验获得的白细胞解冻，加入300μl红细胞裂解液，震荡混匀室温放置10min后12,000rpm离心1min，弃上清.其余步骤按试剂盒的方法进行，最后开盖放入预热的超小型离心浓缩仪，干燥5-10min，加入100μL DNA溶解液，充分混匀，-20℃保存.(4)检测核酸的浓度和纯度取1μL基因组DNA，用超微量核酸检测仪检测核酸的浓度和纯度，结果见图1和表2.2.2.2.2 毛发的采集与处理（1）采样取男性和女性带有毛囊的毛发各一根.（2）样本的处理将采集的毛发用70%乙醇洗涤1次，然后用蒸馏水冲洗毛发2次.在PCR 管中加入1根头发，毛囊置于管底，用洁净的剪刀剪去多余发毛发（高于PCR管的毛发部分）.PCR管中加入15μL裂解液，放入PCR仪中进行如下反应：65℃，30min;95℃,15min;4℃,10min.反应结束后，将PCR管短暂离心，此裂解液作为毛发基因PCR的模板备用.2.2.3 PCR体系和条件2.2.3.1 PCR反应体系（1）毛发样品的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：毛发裂解液4μL，2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，灭菌超纯水17，总体积50μL.（2）基因组DNA的PCR反应体系，PCR管中依次加入下列试剂和样本：2*PCR Mix 25μL，GAPDH和SRY基因的上下游引物（10μM）各加1μL，基因组DNA（150-200ng/μL）1μL，灭菌超纯水20μL，总体积50.2.2.3.2 PCR反应条件首先94℃ 5min，然后94℃70sec，55℃90sec，72℃90sec循环30次，再72℃ 7min，最后4℃保存.反应结束后，取样品5μL进行电泳检测，其余PCR产物于-20℃冰箱保存.2.2.4 电泳检测配制2%琼脂糖凝胶和1xTAE电泳缓冲液，电泳按照5-8V/cm进行，120v恒电压，运行0.5h.点样的顺序从左到右为：Marker I（条带为600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp），男1号的基因组DNA，女1号的基因组DNA，男1号的毛发，女1号的毛发，男2号的基因组DNA，女2号的基因组DNA，男2号的毛发，女2号的毛发.将电泳后的凝胶放入EB浸泡液中浸泡30min，凝胶成像系统Tocan240中观察，结果见图2.3 实验结果3.1 基因组DNA的纯度与浓度的检测结果用NanoDrop2000超微量紫外分光光度计检测基因组DNA的纯度和浓度结果见图1和表2.结果显示所测样品的基因组DNA紫外吸收值OD260/280均在1.80-2.00之间，说明基因组DNA的纯度很高，可以用于试验操作.3.2 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果应用PCR扩增SRY基因电泳检测结果见图2，结果显示：①2、4、6、8泳道扩增出SRY基因，说明样本为男性样本，3、5、7、9泳道扩增出了男女都有的GAPDH内参照基因，但未扩出SRY基因，说明样本为女性样本，该实验结果与实际情况完全相符，证明该方法鉴定性别的准确率极高.②用毛发检测SRY基因的结果与实际情况一致，说明用毛发鉴定性别可行，可以推广到实际应用中.4 讨论人或者哺乳动物的性别决定，首先依赖于生物体内染色体（主要是性染色体）的完整性，一般来说，男性有一条X染色体和一条Y染色体，而女性有两条X染色体.1966年人们发现睾丸决定因子（testis determination factor, TDF)决定了生物是否为雄性，直到1990年人们才在此区克隆得到了SRY基因[7].因此，SRY基因的发现是哺乳动物性别决定领域研究的一项重大突破，性别鉴定对于人类遗传病，法医鉴定，考古以及其它领域具有越来越重要的作用.特别是采用分子生物学手段比其他传统方法有着明显的优势.4.1 该技术在胎儿性别检测中的应用优势.胎儿性别检测的方法有羊膜腔穿刺法、B型超声波诊断法等，这两种方法检测性别各有特点.羊膜穿刺法对孕妇和胎儿都有侵入性伤害，其操作的创伤性，可导致宫内感染流产等多种妊娠不良；B超法要求胎儿发育到5个月以上才可以，而且用超声波仪器分辨胎儿生殖器官要结合胎儿的位置和医师的水平，所以准确率并不高，5个月后检测出性别再做流产时对孕妇的伤害很大.早在60年代末就有报道在孕妇血循环中存在胎儿细胞[8],并提示可以利用孕妇外周血中的胎儿细胞进行胎儿性别及X连锁遗传病、某些常染色体遗传性疾病的产前诊断[9,10].因此，采用PCR技术扩增SRY基因检测性别法，可以用孕妇的外周血中游离的少量胎儿细胞进行性别鉴定，属于无创伤性检测.而且用PCR技术扩增SRY基因检测性别法在怀孕早期（11周以后）即可进行鉴定[10].4.2 法医鉴定的方法目前常用的就是PCR技术扩增SRY基因检测性别法，该方法具有快速、简捷和准确等特点，对样本的要求低，用一根毛发、一滴血均可检测出性别.4.3 对于性分化异常的个体，如有些染色体检查为46,XX的个体却表现出部分男性的性状或46，XY的个体却表现出部分女性特征时用PCR技术扩增SRY基因，原本SRY基因是位于Y染色体上的，但在形成生殖细胞进行减数分裂时X染色体和Y染色体发生易位而导致Y染色体上的SRY基因易位到了X染色体上而出现性分化异常的现象.因此用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可以进行准确鉴定.4.4 多年的尸块因大部分已降解无法判断性别时，用PCR技术扩增SRY基因检测性别法可不受降解的影响，因为该法检测的只是很少的一部分DNA.4.5 对于有争议的运动员，多指表型像女性但怀疑是男性的运动员，可以用PCR技术扩增SRY基因检测性别法进行最终鉴定.5 应用与推广前景用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值.首先，材料来源广泛，只要有一滴血、一根毛发或多年的尸骨均可用来进行性别鉴定.其次，该方法具有简单、快速、高效、敏感度高等优点.利用PCR技术鉴定性别对于遗传性疾病的产前基因诊断，法医学中由于肢解或者肉眼无法辨识的性别鉴定，考古学中性别的鉴定以及对有性别争议的运动员体检等领域具有重要的现实意义.5.1 家族中有血友病或肌营养不良等X连锁隐性遗传病史的人有必要在怀孕后检测胎儿的性别.通过采孕妇的外周血来检测胎儿的性别，可预防甲型血友病、杜氏肌营养不良等X连锁隐性遗传病患儿的出生，随着从孕妇血浆中提取胎儿游离DNA的技术手段不断革新，该方法在遗传病的产前基因诊断中具有广泛而深远的实际应用价值[11-13].5.2 案发现场发现血迹和毛发，需要检测性别时.性别鉴定是法医学个人识别的重要内容之一，用PCR 技术扩增Y染色体上的同源基因大大提高了性别鉴定的灵敏度，且检验程序简便快速，部分降解的检材只要能提取到相应的靶DNA序列即可进行，目前在法医学中已广泛应用[14，15].5.3 由于多种原因无法确定性别时，如性反转综合征，用该法可为其临床诊断提供理论依据[16].5.4 多年的尸块大部分已降解需要鉴定性别时.考古研究中性别信息特别是重大考古和典型墓葬的考古发现对于墓主的性别等信息就显得非常重要以及对人类起源演化和迁移等研究也具有十分重要作用，考古过程中由于挖掘墓葬，婴儿骨骼发育不全等情况无法进行形态学性别鉴定，而通过分子手段就显得尤为重要，多年遗骸比如尸块的DNA常有降解，而PCR只分析DNA的一小部分，不易受降解的影响，以DNA为基础的人骨遗骸性别鉴定最早就是用于扩增Y染色体特异性序列进行的[17].因此，通过骨骼，牙齿，毛发（含毛囊）以及排泄物等提取出古代DNA，进行性别鉴定对于人类起源、演化和迁移等研究具有十分重要的作用.随着科学的进步，利用PCR技术扩增SRY基因对考古进行性别鉴定的手段将会愈发的重要.5.5 本方法还可用于需要快速、准确、同时需检测大量标本的运动员体检.参考文献：〔1〕傅忠扬.性别鉴定的几种方法[J].生物学通报,2010,45(4):18-20.〔2〕石鑫玮,刘海意,乔福元，等.荧光原位杂交技术及染色体核型分析在产前诊断中的应用价值[J].中国实用妇科与产科杂志,2011(2):125-127.〔3〕Ignacio Marin,Bruce S Baker.The Evolutionary Dynamics of Sex Determination [J].Scienc,1998,281(5385):1990-1994.〔4〕Shah V C,Smart V.Human chromosome Y and SRY[J].Cell Biol Int,1996,20(1):3-6.〔5〕J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔,等.分子克隆实验指南(第三版)[M].科学出版社,2012.611-617.〔6〕白春英,周静,瑞云,于晓明,萨初然贵,李秀君.经济、有效提取外周血基因组DNA的方法[J].检验医学与临床,2012(17):1795-1798.〔7〕Gubby J, Collignon J, Koopman P, et al. A gene mapping to the sex determining region of the mouse Y chromosome is a member of the novel famlily embryonically expressed genes[J].Nature, 1990, 346: 245-250.〔8〕Erenberg A,Lemons J,Sia C,et al.Newborn and infant hearing loss:Detection and intervention[J].Pediat rics,1999,103(2):527-530.〔9〕Rossiter J P,Balkemore K J,Kickler T S,et al.The use of polymerase chain reaction to determine fetal RhD status[J].Am J Obste Gynecol,1994,171(4):1047-1051.〔10〕马旭,张思仲.孕妇外周血中胎儿细胞的分离纯化及在产前基因诊断中的应用[J].中华医学遗传学杂志,1992,9(4):212-214.〔11〕Harper T C,Finning K M,Martin P,et e of maternal plasma for noninvasive determination of feal RhD status[J].Am J ObsteGynecol,2004,191(5):1730-1732.〔12〕Li Y, Holzgreve W, Page-Christiaens GC,et al.Improved prenatal detection of a fetal point mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternal plasma-case report[J].Prenat Diagn,2004,24(11):896-898.〔13〕Aviles RJ,Askari AT,Lindahl B,et al.Troponin T levels in patients with acute coronary syndrome,with or without renal dysfunction[J].N Engl J Med,2002,346 (26):2047-2052.〔14〕Witt M,Erickson R P.A rapid Method for detection of y-chromosomal DNA from dried blood specimens by the polymerase chain reaction [J].HumGenet,1989,82:271-274.〔15〕吴梅筠,孙光云.体外DNA扩增技术鉴定血痕性别三例报告[J].中国法医学杂志,1991,6(2):68-69.〔16〕蒙县宗,梁季鸿,鲁国玉,李广裕.SRY基因阴性男性性反转综合征1例[J].中国现代医生，2010，48(16):106-107.〔17〕Chen E, Yuan Z A,Collier P M,et parison of upstream regions of X-and Y-chromosomal amelogenin genes[J].Gene,1998,17(216):131-137.。
PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术的研究
PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术的研究PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术的研究引言：随着人类对生命科学的深入研究，胚胎性别的鉴别日益得到关注。
早期的胚胎性别鉴别对于家庭规划、遗传疾病筛查以及相关科学研究等方面具有重要意义。
近年来，PCR方法在胚胎性别鉴别方面的应用得到广泛关注和研究。
本文将对PCR方法鉴别早期胚胎性别及相关技术进行综述。
一、PCR方法原理及步骤PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于生物学中的技术，用于扩增DNA片段。
它通过模拟体内DNA复制过程，在体外制造出大量的DNA复制产物。
PCR方法鉴别早期胚胎性别主要包括以下步骤：1. DNA提取：从早期胚胎中提取DNA，通常采用酚-氯仿提取法或商业DNA提取试剂盒。
2. DNA扩增：使用特定的引物和酶，将目标基因的DNA序列扩增至可检测程度。
对于早期胚胎性别鉴别，一般选择包含性别决定基因的特定区域进行扩增。
3. 凝胶电泳：将扩增产物进行凝胶电泳，根据分子量大小将DNA进行分离和定量。
二、PCR方法在早期胚胎性别鉴别中的应用1. 鉴别性别决定基因：PCR方法可以针对性别决定基因进行鉴别，包括Y染色体上的SRY基因和X染色体上的AMXY基因等。
早期胚胎的性别决定基因通常在胚胎第5-7周发育阶段表达，因此PCR方法能够及早确定胚胎性别。
2. 基于单细胞PCR的早期胚胎性别鉴定：在体外受精过程中，经常会产生多个早期胚胎。
通过单细胞PCR技术，可以对每个早期胚胎的DNA进行分析，选择性别合适的胚胎移植，以增加成功率和减少遗传疾病风险。
3. 基于NIPT技术的胚胎性别鉴定：非侵入性产前检测（NIPT）技术是一种新兴的胎儿遗传学检测方法。
通过采集母亲血液中的胎儿自由DNA，结合PCR方法，可以准确鉴定胎儿的性别。
4. 进一步发展：PCR方法在早期胚胎性别鉴定领域的应用仍在不断发展。
一些新兴技术如多重荧光PCR和数字PCR等，也正在逐步应用于该领域，以进一步提高准确性和灵敏度。
DNA性别测定的应用原理
DNA性别测定的应用原理概述DNA性别测定是一种通过检测个体的DNA分子来确定其性别的方法。
在生物学和法医学领域，DNA性别测定被广泛应用于性别鉴定和疾病遗传研究等方面。
本文将介绍DNA性别测定的原理和常见的试剂盒。
DNA性别测定原理DNA性别测定的原理基于人类染色体的特点，人类的性别由两个性染色体决定，男性有一个X和一个Y染色体，女性有两个X染色体。
基于性染色体上的特定基因和序列，可以通过PCR扩增和检测来确定个体的性别。
以下是常见的DNA性别测定方法的原理：1.PCR（聚合酶链反应）法PCR法是一种经典的DNA扩增方法，通过PCR扩增性染色体上的特定基因序列来确定个体的性别。
该方法需要使用特定的性别标记基因引物，男性和女性引物能够扩增不同长度的DNA片段，从而实现性别鉴定。
2.SRY基因检测法在Y染色体上，存在一个名为SRY（性决定区Y）的基因，它在性别决定中起着重要作用。
通过PCR扩增和检测SRY基因的存在与否，可以确定个体的性别。
如果SRY基因被扩增出来，代表个体为男性，否则代表个体为女性。
3.Amelogenin基因检测法Amelogenin基因位于X和Y染色体上，但在两者之间存在一个长度差异。
通过PCR扩增Amelogenin基因并检测扩增产物的长度，可以确定个体的性别。
男性会同时扩增出X和Y染色体上的Amelogenin基因，而女性只会扩增出X染色体上的基因。
常见的DNA性别测定试剂盒在市场上，可以购买到许多用于DNA性别测定的试剂盒。
这些试剂盒通常包含了必要的引物、缓冲液和其他试剂，方便用户进行性别鉴定实验。
以下是几种常见的DNA性别测定试剂盒：1.Sry-Red DNA性别鉴定试剂盒该试剂盒基于PCR法，适用于提取和扩增人类DNA样本，通过检测SRY基因的存在与否确定个体性别。
试剂盒提供了特定引物和缓冲液，操作简便，鉴定结果准确可靠。
2.AmpliSex DNA性别测定试剂盒该试剂盒利用PCR扩增和浓缩技术，可以在一个反应体系中同时扩增X和Y染色体上的Amelogenin基因。
基于牙釉质基因巢式PCR性别鉴定 超微量DNA检测方法的建立
基于牙釉质基因巢式PCR性别鉴定超微量DNA检测方法的建立唐纪伟;高庆华【摘要】实验根据山羊牙釉质(AMEL)基因序列设计巢式引物,用紫外分光仪检测基因组DNA的浓度,梯度稀释(10 -2μg/μL、10-3 μg/μL,10-4μg/μL,10-5μg/μL),巢式PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳检测.结果表明,利用巢式PCR方法对10 pg量基因组DNA(约3个细胞)进行扩增,得到明显目的条带.巢式PCR扩增AMEL基因鉴定性别的方法具有较高的准确性和敏感性,超微量DNA检测方法对胚胎移植前性别鉴定及提高切割胚胎移植的成活率方面具有重要的意义.【期刊名称】《塔里木大学学报》【年(卷),期】2011(023)002【总页数】4页(P24-27)【关键词】巢式PCR;超微量DNA;牙釉质基因1【作者】唐纪伟;高庆华【作者单位】塔里木大学畜牧科技兵团重点实验室,新疆阿拉尔843300;塔里木大学畜牧科技兵团重点实验室,新疆阿拉尔843300【正文语种】中文【中图分类】S852.65聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是一种体外扩增DNA片段的技术。
自PCR技术问世以来，以其快速、准确、敏感和简便等优点在医学、微生物学和胚胎移植前遗传学诊断(PGD)等领域得到了广泛的应用［1－3］。
现在，PCR技术已被广泛应用于牛、羊等动物的胚胎性别鉴定，还建立了许多基于PCR技术的家畜胚胎性别鉴定方法。
随着研究的进一步深入，要求PCR性别鉴别技术在原有基础上更加快速、敏感和简捷。
巢式PCR法是在PCR技术的基础上发展起来的，它是根据一个性别特异基因设计一对外引物以得到被测基因较长的扩增产物，再根据扩增产物序列设计第二对引物(内引物)对产物进行第二次扩增。
巢式PCR经过两次扩增，使扩增产物的量增加，结果更容易判断，同时巢式引物的使用增加了扩增产物的特异性，提高了准确度［4］。
本实验采用巢式PCR扩增超微量山羊血液基因组DNA进行性别鉴定，旨在建立超微量DNA检测方法，在对家畜早期胚胎进行鉴定时，尽可能少的切取胚胎，以减少对胚胎的伤害，提高胚胎移植的成功率。
聚合酶链反应扩增ZFY基因诊断胎儿性别
聚合酶链反应扩增ZFY基因诊断胎儿性别
林祥华;张其;毛裕民;杨树青
【期刊名称】《第二军医大学学报》
【年(卷),期】1993(14)3
【摘要】应用睾丸决定因子(TDF)的基因序列中一对引物F3.2和F4.2,特异地扩增ZFY基因中650bp的DNA片段。
其扩增产物在琼脂糖凝胶电泳后,以EB染色直接在紫外透射反射分析仪下观察。
本实验能稳定地扩增出500pg男性DNA的特异性电泳带,在混有1:10~2女性DNA的条件下,也能获得预期结果。
用此法检测绒毛和羊水各20例,诊断胎儿性别的符合率为100％。
【总页数】4页(P252-255)
【关键词】聚合酶链反应;睾丸决定因子;性别
【作者】林祥华;张其;毛裕民;杨树青
【作者单位】长海医院妇产科实验室;复旦大学遗传研究所
【正文语种】中文
【中图分类】R714.52
【相关文献】
1.PCR扩增ZFY／ZFX基因鉴定人类干血痕性别 [J], 姜先华
2.用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别 [J], 周宁;于萍;陈君;黄海士;江森;克丙申
3.扩增ZFX／ZFY基因—一个可靠的性别鉴定系统 [J], 张学;孙开来
4.PCR扩增ZFY及ZFX基因对奶牛的性别鉴定 [J], 徐亚欧;唐榕
5.PCR扩增ZFY、ZFX序列鉴定奶牛性别的灵敏度研究 [J], 龚荣慈;徐亚欧;唐榕;毛裕民
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单细胞PCR对种植前胚胎的性别鉴定
单细胞PCR对种植前胚胎的性别鉴定
李晓红;庄广伦
【期刊名称】《中山医科大学学报》
【年(卷),期】1998(019)001
【摘要】目的：用单一胚细胞进行人类种植前胚性别鉴定。
方法：巢式ＰＣＲ技术同时扩增单个活细胞Ｙ染色体上的ＳＲＹ序列及位于７号染色体上的ＺＰ３基因阳性，８个显示ＺＰ３基因阳性而ＳＲＹ阴性。
结论选择ＳＲＹ和ＺＰ３基因引物对单个细胞进行巢式ＰＣＲ扩增是种植前胚胎性别鉴定的一种可靠的方法。
【总页数】3页(P11-13)
【作者】李晓红;庄广伦
【作者单位】中山医科大学附属第一医院生殖医学中心;中山医科大学附属第一医院生殖医学中心
【正文语种】中文
【中图分类】R714.52
【相关文献】
1.关于胚胎分割前性别鉴定的探讨--对人教版高中生物选修3“胚胎工程”专题插图的解读 [J], 王慧琼
2.单细胞多重巢式PCR在多囊肾病中胚胎植入前诊断的实验研究 [J], 朱琴;徐炳森;黄学锋;周颖
3.常规PCR和巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别体系的建立和优化 [J], 王世银;张兆旺;赵兴绪;张伟;赵建军
4.应用PCR扩增Y染色体性别决定区序列鉴定山羊胚胎性别 [J], 陈美珏;叶进培
5.应用单细胞多重PCR进行性别鉴定 [J], 易萍;李力;姚宏;俞丽丽
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兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立
兔早期胚胎PCR性别鉴定体系的建立赵建军;赵兴绪;张伟;周佰成;张兆旺【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2008(000)012【摘要】根据兔SRY基因序列设计两对引物作为兔雄性特异性引物,根据兔APP 基因序列设计1对引物作为内标引物,分别建立了兔早期胚胎性别鉴定的双重PCR 和巢式PCR反应体系,在不同浓度的基因组DNA和兔早期胚胎上进行性别鉴定应用,同时,对兔SRY巢式PCR引物特异性进行了分析.结果表明,多重PCR扩增兔基因组DNA可以准确判定其性别,扩增灵敏度为100 pg基因组DNA;多重PCR鉴定24枚兔32细胞桑椹胚性别,只能对整胚成功鉴定.巢式PCR,公兔基因组DNA 扩增出282 bp的SRY基因片段,母兔没有扩增产物,扩增灵敏度为10 pg;对24枚兔32细胞桑椹胚性别鉴定结果表明,巢式PCR可以对少至4个胚胎细胞进行准确鉴定,同一胚胎结果符合率为100%(24/24).SRY引物只对兔雄性基因组DNA特异,而其他动物(人、牛、绵羊、小鼠)雄性DNA及兔的冲卵液,均无PCR产物.【总页数】5页(P42-46)【作者】赵建军;赵兴绪;张伟;周佰成;张兆旺【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;西南大学荣昌校区,重庆,402460;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;新疆农业职业技术学院,新疆,昌吉,831100;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070;青海省畜牧总站,青海,西宁,810001;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃,兰州,730070【正文语种】中文【中图分类】S813.3【相关文献】1.绵羊早期胚胎性别鉴定巢式PCR体系的建立及其灵敏度研究 [J], 宋淑珍;赵兴绪;张兆旺;黄素红;张海容2.牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系优化的研究 [J], 孙明亮;白文林;罗光彬;纪英卓3.常规PCR和巢式PCR法鉴定牛早期胚胎性别体系的建立和优化 [J], 王世银;张兆旺;赵兴绪;张伟;赵建军4.牛早期胚胎性别鉴定PCR反应体系的优化研究 [J], 陈从英;黄路生;陈静波;任军;肖海霞5.鉴定牛早期胚胎性别PCR反应体系的建立及优化研究 [J], 杨波;朱化彬;程金华;仲跻峰;王栋;郝海生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
巢式多聚酶链反应快速检测胎儿性别
巢式多聚酶链反应快速检测胎儿性别
柳青;陈宏础
【期刊名称】《重庆医科大学学报》
【年(卷),期】1999(24)1
【摘要】为建立一种非侵入性的对Ｘ性连锁遗传性疾病胎儿的早期产前性别鉴定方法，我们采用了巢式ＰＣＲ方法来扩增孕妇外周血中男性胎儿的Ｙ染色体特异序列，并与新生儿出生性别相对照。
４４例孕妇中２２例分娩男性婴儿．其中１９例扩增出Ｙ特异片段，阳性检出率为８６．４％（１９／２２）．其余２２例分娩女性婴儿，其中无一例出现Ｙ特异扩增带，结果提示用巢式ＰＣＲ方法可快速判断胎儿性别，使临床上无伤性产前检查Ｘ性连锁遗传性疾病的胎儿性别成为可能。
【总页数】2页(P41-42)
【关键词】巢式;胎儿;性别鉴定;聚合酶链反应
【作者】柳青;陈宏础
【作者单位】临床学院中心实验室;检验系
【正文语种】中文
【中图分类】R714.52
【相关文献】
1.巢式逆转录多聚酶链反应检测周围静脉血中肝癌细胞的敏感性 [J], 刘扬;张柏和
2.巢式逆转录多聚酶链反应检测荷人肝癌裸鼠周围静脉血液中肝癌细胞的实验研究[J], 刘扬;张柏和;钱光相
3.巢式逆转录多聚酶链反应检测循环性肝癌细胞及其临床意义 [J], 刘扬;张柏和;钱光相
4.巢式逆转录多聚酶链反应检测大肠癌外周血中CK20 mRNA [J], 陈瑞新;王志伟;邵苏吉;徐青;沈洪薰;陈玉泉
5.多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因 [J], 周
琳;Harder;TC;等
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应用PCR技术检测SRY序列进行性别的快速鉴定及产前诊断
应用PCR技术检测SRY序列进行性别的快速鉴定及产前诊断文晓军;李琪
【期刊名称】《广西医学院学报》
【年(卷),期】1992(009)001
【摘要】性别诊断在性连锁遗传病的预防、法医物证及公平体育竞技的维护方面均有较大价值.作者通过Y染色体性别决定区特异性序列的体外扩增技术,进行性别的快速诊断.结果表明,来自于微量血、唾液及羊水的微量细胞,经碱煮沸法处理后,可进行性别鉴定及产前诊断,4～5h即可得结果.本文一共进行18例正常成人,4例绒毛,3例羊水细胞的性别鉴定.
【总页数】3页(P21-23)
【作者】文晓军;李琪
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R714.52
【相关文献】
1.改良PCR技术检测孕妇血浆中胎儿性别相关基因SRY的研究 [J], 陈熙;任景慧;郭辉;林琳华;姚秋璇;赵跃宏;黄小林;苏放明
2.PCR技术检测性别发育异常患者的SRY基因 [J], 张立;谢向农;余元勋;李建平;徐彬
3.应用PCR技术扩增SRY基因检测性别 [J], 吴晓东;张博文;王博楠;李争芳;史莉莉;史铁伟;白春英
4.应用PCR技术检测SRY基因进行性别鉴定 [J], 陈虹;杜晓娟;黄秉仁;孙国贤
5.应用PCR扩增牛SRY序列进行奶牛胚胎性别的鉴定及移植 [J], 曾溢滔;张美兰;陈美珏;周霞娣;黄英;任兆瑞;黄淑帧;胡明信;吴学清;高建明;张斌;徐慧如
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PCR技术对牛早期胚胎性别鉴定的研究
PCR技术对牛早期胚胎性别鉴定的研究09动物科学XXX YYYYYY【摘要】PCR技术是20 世纪80 年代中期发展起来的一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA 或DNA 片段的方法，具有高效、灵敏，特异性强等特点，在生物科学各个领域中均发挥了巨大的作用。
PC R 技术能十分有效地鉴定出移植前牛胚胎的性别, 而且能适用于生产实践。
可以帮助养殖者充分有效的利用资源, 获得更高的经济效益。
本文对PCR( 聚合酶链式反应) 的基本原理、优点、方法及其在牛胚胎性别鉴定中的应用情况进行了扼要综述。
【关键词】胚胎,性别鉴定,PC R ,牛自从19 世纪70 年代中期胚胎移植( ET) 技术在商业领域中得到广泛应用以来, 提前判别胚胎的性别一直是研究人员及养殖者热望的问题。
PCR (Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应技术, 因其具有快速、敏感、简便及特异性强等特点, 很快被用于传染病诊断、法医鉴定、基因工程等领域。
自从Herr 等( 1990) 报道了用PCR 进行奶牛胚胎性别鉴定之后, 利用PCR 技术鉴别家畜胚胎性别更是引人注目。
现将PCR 的发展及其在牛胚胎性别鉴定上的应用作一综述。
1.PCR技术PCR是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)的缩写，是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法，又称多聚酶链反应、无细胞克隆技术等。
PCR技术主要由高温变性、低温退火和适温延伸3个步骤反复的循环构成，是在一种特异耐热酶－Taq DNA聚合酶的催化下完成的由DNA聚合酶催化反应。
其基本原理是用寡聚核苷酸引物结合在模板DNA (或靶DNA)分子上进行特异核苷酸序列扩增。
按理论计算，一般DNA短链经过20次PCR循环将产生约100万倍的扩增产物，被广泛应用农业、食品工业、医学及分子生物学等各个领域。
2. PCR法鉴别动物早期胚胎性别的机理2.1. 性别决定的发育学机制动物胚胎发育的早期阶段为性别未分化期，仅有位于中肾内缘的性腺原基，这种未分化的性腺中胚层处于中性。
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用巢式PCR扩增ZFY基因产前诊断胎儿性别近年来的研究表明，Y染色体上锌指结构基因(zinc-finger-Y gene，ZFY)是继SRY之后又一与性分化有关的单拷贝基因，并与精子的发生有关［1，2］。
为此，我们利用巢式PCR 技术，以ZFY作为检测指标，参考有关文献自行设计内外两侧两对巢式PCR引物［3］，对绒毛、羊水和孕妇外周血标本进行ZFY基因的特异扩增，初步建立了一种用PCR技术产前检测胎儿性别的方法。
1材料与方法1.1标本取正常男、女外周血各20份，每份0.5ml。
孕10～32周妇女外周血31份，每份6ml，流产胎儿绒毛45份，羊水40份，均为本科收治患者。
分别采用绒毛染色体核型、羊水染色体核型、引产和出生胎儿生殖器检查确定胎儿实际性别。
1.2模板DNA的提取1.2.1外周血细胞DNA的提取(1)将6ml EDTA抗凝血离心5000r/min×3分钟后弃血清；(2)加入等体积破红细，1%trito 胞液〔0.32mol/L蔗糖，10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，5mmol/L CaCl2nX-100〕充分裂解红细胞，离心5000r/min×3分钟，重复2次；(3)沉淀物加1 00μl白细胞裂解液〔50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)，1.5mmol/L M ,0.1%明胶，0.5% NP40〕混匀后加入蛋白酶K5μl(30mg/ml)，置50℃消化2gCl2小时，95℃加热10分钟，置-20℃保存备检。
1.2.2 绒毛及羊水DNA提取参考文献［4］的方法，所有标本均进行巢式PCR扩增，随机取20例绒毛标本进行斑点杂交。
1.3ZFY基因的引物设计及扩增根据ZFY全基因序列，G+C比例和次级结构设计的巢式PCR实验用的外侧特异性引物选在ZFY基因区2125～2145位及2458～2478位，引物序列分别为P1：5′-CCATTTGTTCTAAGTCGCCA-3′，P2：5′-CTTCAAGGCCAACATCAGCTG-3′，扩增产物长354bp。
内侧特异性引物选在ZFY基因区2149～2169位及2435～2455位，引物序列分别为：P3：5′-CTCTCAGT-TCACACAAAGG-3′，P4：5′-GCTTGTA-GACAC ACTGTTAGG-3′，扩增产物长307bp。
上述引物经计算机模拟核酸杂交软件辅助分析与美国Gene Bank基因数据库比较表明，与人体基因组和其它生物基因组无明显同源性，引物碱基与靶基因一致，自身无发卡结构，无互补结构。
PCR条件参数见本实验室已建立的HPV-PCR试验［5］。
1.4斑点杂交样品配制：DNA液20μl，0.4mol/L NaOH, 20μl，20×SCC 40μl，混匀后加样于硝酸纤维素薄膜上，使用PCR扩增片段内一段特异性寡核苷酸作探针，探针序列为：TTCATACAAA-AGACTATCCTCATCGGTG，探针标记采用随机引物法，杂交步骤参见文献［4］的方法。
2结果2.1扩增片段的序列分析用1.5%低溶点琼脂糖凝胶回收354bp和307bp扩增片段，经Sephaglas band p rep kit抽提后，乙醇沉淀干燥，参照Sequi Therm TM循环测序试剂盒说明进行Sanger双脱氧终止法“直接序列测定”［6］，测序引物为PCR引物。
测序反应产物经Sephedex G-75离心层析柱纯化后，在Bio-rad DNA序列仪上，以6%聚丙烯酰胺凝胶，50℃ 50W电泳，-20℃放射自显影24小时。
测序的自显影结果如图1所示。
图1ZFY基因PCR产物纯化后直接核酸序列分析的放射自显影图结果所测得序列与文献报道完全一致。
ZFY基因354bp及307bp扩增片段核酸序列：TCGACTACAACCGGAACTTC(虚线为巢式PCR外侧1对引物，实线为巢式PCR内侧1对引物)2.2PCR特异性及敏感性实验20例正常男性用内外侧引物均有扩增带，而女性均无扩增条带；45例绒毛标本中，21例有特异性扩增带，有无扩增带的标本之比为1∶1.143，接近实际出生胎儿的性别之比；40例羊水标本中，18例判定为男性，随后与临床实际出生的胎儿性别对照均符合。
以男、女混合DNA为模板，加入的模板量依次为：男性D NA/女性DNA：0.5μg/0.5μg、0.25μg/0.5μg、0.025μg/0.5μg、0.01μg/0. 5μg、0.005μg/0.5μg，巢式PCR扩增均显示了特异性307bp扩增带。
2.3孕妇外周血胎儿细胞的检测31例孕10～32周妇女外周血及羊水PCR检测，其中男性胎儿19例，女性胎儿1 2例。
12例女性胎儿经外周血直接巢式PCR分析均未检出ZFY基因。
对19例怀男性胎儿妇女同一个体不同孕周连续采血发现，随着孕龄的增加，胎儿ZFY基因的检出率逐渐升高，且当在某一孕周检出胎儿ZFY基因后，以后各孕周均可检出ZFY基因。
31例用孕母外周血胎儿细胞检出ZFY基因的孕周及例数分别为，孕1 0周6例，孕11周11例，孕12周15例，孕13周15例，孕14周16例，孕1 5周17例，孕16周18例，孕17周18例，有1例直至孕32周仍未检出。
因此，31例男女胎儿性别鉴定的总准确率为96.8%(30/31)2.4斑点杂交结果与PCR结果相比较，二者完全一致。
3讨论SRY是位于Y染色体短臂1A1A区的睾丸决定子，已有文献报道用Y染色体特异性DNA片段作为引物进行胎儿性别的鉴定，以及用相应引物进行X连锁遗传病的检出［2］。
但这种直接扩增母血中胎儿细胞DNA进行产前诊断常出现一些假阳性和假阴性结果。
究其原因，除各种情况导致的污染、方法条件不当外，母血中胎儿细胞DNA的含量达不到一般扩增条件所要求的最低模板量也是重要原因。
为了在母血中富集到足够数量的胎儿细胞以提高检出率，马旭等［7，8］利用密度梯度离心结合CD71单抗流式细胞术对多核细胞及富集后低密度细胞中的胎儿细胞SRY 基因的诊断率可达93.2%，但步骤繁杂费时，常需特殊仪器，且因人类Y染色体上一些重复顺序与常染色体存在一定程度上的同源性［7］，易出现假阳性干扰。
Z FY基因是Ao等［1］首次报道的性别决定基因，位于Y染色体短臂的Ucdo43区，目前越来越多的证据表明ZFY是继SRY之后又一睾丸决定子(TDF)候选基因之一。
我们使用计算机模拟核酸杂交软件程序，明显提高了ZFY基因引物设计的特异性和实验的成功率，节省了人工选择引物的时间，并避免了假阳性结果的出现。
进一步采用巢式PCR以提高检测的特异性和灵敏度，这种ZFY检测系统可检出1×105女性细胞中的1个男性细胞，6ml孕母外周血大约有1～6个胎儿细胞存在，足以满足PCR模板量的要求。
对扩增片段的序列分析及40例正常男、女外周血DNA标本扩增，结果表明了其特异性很强。
在45例绒毛DNA扩增阳性与阴性之比为1∶1.143，此比例也接近实际自然出生胎儿性别之比。
敏感性实验也表明，当将男、女性DNA混合时，当模板中只含有1%男性DNA时(此时相当于男性细胞数500余个)，仍可得到理想的扩增带。
19例怀男性胎儿的妇女外周血中有18例检出了ZFY基因，在对12例怀女性胎儿的妇女外周血进行ZFY基因检测时，未见假阳性结果出现，提示该法对孕母外周血胎儿性别鉴定是可行的。
对于本研究出现的1例假阴性结果，推测可能与孕母外周血中尚未出现胎儿细胞或其含量未达到检测水平有关，尚需连续动态观察以明确胎儿细胞最晚进入母血循环的时间并注意个体差异，从而使阴性结果的判断更为可靠。
本课题由山东省自然科学基金(9648)资助作者单位：250031济南，济南军区总医院妇产科(周宁、陈君、黄海士、克丙申)；山东医科大学基础医学院生理教研室(于萍)，附属医院妇产科(江森)参考文献［1］Ao A, Erickson RP, Winston RM, et al.Transcription of paternal Y linked genes in the human zygote as early as the prenudeate stage. Zygote, 1994,2 (4)∶281-287.［2］Reynolds R, Varlaro J. Gender determination of forensic samples using P CR amplification of ZFY/ZFX gene sequence. J Forensci Sci, 1996,41(2)∶279-286.［3］Kao SM, Tang GC, Hsieh TT,et al.Analysis of peripheral blood of pregna ncy women for the presence of fetal Y chromosome-specific ZFY gene deoxyribonucleic acid sequence. Am J Obstet Gynecol, 1992,166(2)∶1013-1019.［4］Sambrook J, Frotsch EF, Maniatis T. Molecular cloning:A laboratory man ual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989,463-472.［5］周宁，于萍，徐增祥.宫颈癌组织中乳头瘤病毒感染及抑癌基因p53突变的检测.第二军医大学学报，1997，18(5)∶443-445.［6］兰风华，梅田真郎，井上圭三.单克隆抗体可变区基因PCR产物的直接测序.上海免疫学杂志，1996，16(1)∶10-12.［7］马旭，张思仲，罗安雪，等.孕妇血中胎儿细胞在产前诊断中的初步应用：胎儿SRY基因的鉴定.中华医学遗传学杂志，1995，12(5)∶265-268.［8］马旭，张思仲，赵丽.孕妇血中胎儿细胞性质和来源的研究.中华医学杂志，1995，75(10)∶631-632.。