黄酮类(flavonoids)制剂的分析
黄酮类化合物的提取工艺与分析方法(郭彭靖)
黄酮类化合物的提取工艺与分析方法作者，单位中英文摘要，关键词黄酮类化合物（flavonoids），又称生物类黄酮（bioflavonoids），是指具有色酮环与苯环为基本结构的一类化合物的总称，是多酚类化合物中最大的一个亚类。
其基本骨架具有C6-C3-C6的特点，即由2个芳香环A和B，通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。
根据间三碳链的氧化程度、B环（苯基）连接位置（2-或3-位）以及三碳链是否呈环状等特点，黄酮类化合物分为许多不同类型，如黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮、二氢异黄酮、查尔酮等（叶文峰，2000）。
自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，在银杏叶、山楂、杜仲、山香圆叶、水芹、竹叶、黄芪、丹参等植物中均有检出。
到目前为止，已经发现有5000多种植物中含有黄酮类和异黄酮类化合物（蔡健等，2003）。
天然来源的生物黄酮分子量小，能被人体迅速吸收，通过血脑屏障，进入脂肪组织，具有调节血脂、消除氧自由基、抗氧化、抗肿瘤、抗辐射、抗衰老、抗过敏、抗菌、抗病毒等生理功能（李楠等，2005）。
许多应用研究表明，黄酮类化合物具有预防心血管疾病、防癌抗癌、防止骨质疏松和改善动物生长及降血脂、止血、抑制血小板聚集等多种药理作用。
例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎、抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等（肖常厚，1997）。
此外，黄酮类化合物也是重要的功能食品添加剂、天然抗氧化剂、天然色素、天然甜味剂（王晶等，2006）。
黄酮类化合物在人体不能直接合成，只能从食品中获得。
主要是作为食品添加剂或直接应用于食品中增加其保健作用。
例如茶多酚在功能食品中的应用主要是以茶叶及其提取物的形式添加到食品中。
茶多酚具有抗疲劳、抗辐射、抗衰老等功能特性，茶叶具有独特的色、香、味、形，能使食品增香、调味、着色，因此茶多酚以茶叶的形式在食品中的应用十分广泛。
近年来科学家都积极关注从植物体中提取纯度高、活性强的天然黄酮成分，并进一步将其加工成有特异功能的保健食品和药品等产品。
典型药物分析实例 黄体酮及其制剂分析 (药物分析课件)
H3C
H
H
H
保留时间一致。
O
三、检查
黄体酮除检查“干燥失重”外， 还需检查“有关物质”。注射液需检 醇溶解并稀释制成每1ml中约含 1mg的溶液，作为供试品溶液；
精密量取1ml，置100ml量瓶中，用甲醇稀释 至刻度，摇匀，作为对照溶液。
三、检查
有关物质
二、鉴别
3. 红外分光光度法
本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光谱 集434图）一致。
黄体酮结构中含有甲酮基、双键共轭、羰基， 它们在红外光吸收图谱中均有特征吸收峰，可用 于鉴别。
二、鉴别
4. 高效液相色谱法
在含量测定项下记录的色 谱图中，供试品溶液主峰的保
O H3C
CH3 H
留时间应与对照品溶液主峰的
四、含量测定
含量计算公式
标示量%
CR
AX AR
DV
100%
m
有关物质
三、检查
黄体酮及其注射液中的有关物质主要是合成的中间 体和副产物等。
现行版《中国药典》采用高效液相色谱法检查 有关物质，色谱条件与含量测定项下的条件相同， 检查方法为不加校正因子的主成分自身对照法。
四、含量测定
现行版《中国药典》采用高效液 相色谱法对黄体酮及其注射液进行含 量测定。
四、含量测定
色谱条件与系统适用性试验 填充剂：辛烷基硅烷键合硅胶 流动相：甲醇-乙腈-水（25∶35∶40） 检测波长：241nm
四、含量测定
色谱条件与系统适用性试验
调节流速实验
取本品25mg，置25ml量瓶中，加0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液10ml使 溶解，置60℃水浴中保温4小时，放冷，用1mol/L盐酸溶液调节至中性， 用甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl注入液相色谱仪，调节流速使黄体酮峰 的保留时间约为12分钟，黄体酮峰与相对保留时间约为1.1的降解产物峰的 分离度应大于4.0。
LC-MS方法鉴定黄酮类化合物
黄酮类化合物 (flavonoids)
一、 概 述
广泛分布于植物中的天然有氧杂环化合物，主要游离态和与糖结合成苷的形式存在。 藻类、细菌等微生物中没有发现黄酮类化合物的存在。
以前，黄酮类化合物主要是指基本母核2-苯基色原酮类化合物，现在则是泛指两个 苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物。
四、黄酮化合物的生物功能 1、使植物免除紫外线对植物的辐射损伤； 2、抵抗昆虫、病原菌； 3、络合有毒金属离子； 4、参与光敏过程与能量转移； 5、调节植物生长等生理活动等。
同种不同属植物的化学何成分有一定相似性，故在植物 化学分类学上作为Chemotaxonomic markers。
五、黄酮的生物活性
对黄酮苷首先对样品进行甲基化、乙基化、三甲基硅烷化等衍生化操作。
化学电离（Chemical ionization，CI）质谱法
对黄酮苷的鉴定效果差。
场解析（Field desorption，FD）质谱法
快原子轰击（Fast atom bombardment，FAB）质谱法
LC-MS法鉴定黄酮
热喷雾（Thermospray ionization，TSP) 质谱
黄酮骨架上结合位点的不同可能与其酶抑制活性、抗氧化活性有关。在Manach 的研 究中，大剂量 Quercetin 给以大鼠后，其甲基化代谢产物 Isorhamnetin 含量很高。而 已知Isorhamnetin对黄嘌呤氧化酶 的抑制能力强于Quercetin 。
黄酮类化合物的MS鉴定
电轰击（Electron impact，EI）质谱法
Stobiecki, M., et al., Profiling of phenolic glycosidic conjugates in leaves of Arabidopsis thaliana using LC/MS. Metabolomics, 2006. 2(4): p. 197-219.
黄酮类成分分析PPT
波谱法主要包括紫外可见光谱法、红外光谱法、核磁共振波谱法等，通过测定黄酮类成分的吸收光谱或发射光谱， 确定其结构和含量。该方法具有高精度和高分辨率的特点，但操作较为复杂，需要专业人员操作。
04 黄酮类成分的生理活性与 功能
抗氧化活性
总结词
黄酮类成分具有显著的抗氧化活性，能够有效清除自由基，保护细胞免受氧化应激损伤。
抗氧化剂
黄酮类成分具有抗氧化作 用，可保护细胞免受自由 基损伤，延缓衰老。
日化产品
护肤品
黄酮类成分具有抗氧化、 抗炎和美白等作用，可用 于护肤品中，改善皮肤质 量。
洗发水、沐浴露
黄酮类成分具有抗菌、抗 炎和滋润等作用，可添加 到洗发水、沐浴露等日化 产品中。
口腔护理产品
黄酮类成分具有抗菌、抗 炎和抗龋齿等作用，可添 加到牙膏、漱口水等口腔 护理产品中。
要点二
详细描述
黄酮类化合物具有广谱的抗菌和抗病毒活性，对多种细菌 、真菌和病毒具有抑制作用。它们可以通过破坏病原体的 细胞膜、抑制酶的活性等机制发挥抗菌和抗病毒作用，为 治疗和预防感染性疾病提供新的药物候选。
05 黄酮类成分的应用
食品添加剂
01
抗氧化剂
黄酮类成分具有较好的抗氧化性 能，可以延缓食品氧化变质，延 长食品保质期。
深入研究黄酮类成分的生物合成途径，了解关键酶和调 控因子，为优化黄酮类成分的产量提供理论基础。
基因工程与代谢工程的应用
通过基因编辑、基因敲除或过表达等技术手段，调控黄 酮类成分的生物合成过程，提高其产量和品质。
分析方法的改进与创新
高效分离纯化技术的研发
改进现有的分离纯化方法，提高黄酮类成分的提取纯 度与效率，降低生产成本。
优化提取温度和时间
中药成分分类 萜类 多酚类 黄酮类
中药成分分类萜类多酚类黄酮类《中药成分分类：萜类、多酚类、黄酮类》在中药的世界里，有许多成分被广泛应用于医学和保健领域。
这些成分由各种草药和植物提取而来，其中包括萜类、多酚类和黄酮类。
本文将带您深入了解这些成分的分类、特性以及它们在中药中的应用。
1. 萜类（Terpenes）萜类是中药中常见的一类成分，由多个异构体组成。
这些成分通常具有特殊的气味和生理活性。
萜类可以分为单体萜和多萜两大类。
1.1 单体萜单体萜是由五个碳原子（C5H8）组成的类萜骨架，根据它们的结构和性质可以进一步细分为单萜、双萜和三萜。
1.1.1 单萜单萜在中药中广泛存在，并具有多种药理活性。
薄荷中的薄荷醇具有镇静和抗菌作用，而丁香中的丁香酚则具有止痛和抗炎作用。
1.1.2 双萜双萜是由两个单萜骨架连接而成的化合物。
它们在中药中常被用于强化药效或改善药物的溶解度。
举例来说，柴胡中的黄柏酮和桃仁中的异诺肉桂酮都属于双萜成分。
1.1.3 三萜三萜是由三个单萜骨架连接而成的化合物。
它们在中药中常被用于抗炎、抗肿瘤和免疫调节等方面。
人参中的人参三醇和白术中的白朮内脂就是典型的三萜类成分。
1.2 多萜（Polyprenols）多萜是由至少10个以色列桥连接的单元组成的大分子，其分子量通常超过1000。
它们主要存在于树脂和植物的叶绿体中，具有抗菌、抗炎和抗氧化等多种活性。
松脂中的松油萜就是一种常见的多萜类成分。
2. 多酚类（Polyphenols）多酚类是一类含有多个酚基团的化合物，其特点是能与蛋白质、DNA 和细胞膜等生物分子发生相互作用。
这种作用使得多酚具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗衰老等多种保健功效。
2.1 黄酮类（Flavonoids）黄酮类是多酚类中最为重要的一个亚类，常见于中药和食物中。
黄酮类可以进一步分为黄酮类、异黄酮类和花青素类。
2.1.1 黄酮类黄酮类化合物具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和调节免疫系统等多种作用。
在中药中，黄酮类成分广泛存在。
葡萄酒中主要的黄酮类化合物及其分析方法
葡萄酒中主要的黄酮类化合物及其分析方法
葡萄酒是一种众所周知的美味佳酿，其中含有丰富的黄酮类化合物，且其生理活性强大。
黄酮是一类具有天然亮色和抗氧化特性的有机化合物，也是葡萄酒中最主要的构成成分之一。
有许多种黄酮类化合物含量的大小决定了葡萄酒的物理性和遗传性特征，同时也对消费者对葡萄酒的口感有着至关重要的影响。
在葡萄酒中，出现最丰富的黄酮类次是多酚类，其主要包括有山梨醇均聚物（EDP），查尔酮（Chardonnay），吡咯烷酮（Pyranoid），花苷（Flavonoid）和米宁（Mining）。
其中，花苷的种类往往最多，包括类黄酮、寡类黄酮、多黄素和红黄酮，且花苷黄酮之间具有相互交叉转化的特性。
另外，蚁酮（Anthocyanin）是次要的黄酮类化合物，其含量总是低于花苷，但是对于葡萄酒的颜色和口感有判断性的作用。
相比于葡萄酒香气成分，分子来源的葡萄酒多酚类成分分析更为常见。
此类成分采用改进型的高效液相色谱层析技术（HPLC）常见，可以获得精确，可重复性强和较高精度的分析结果。
此外，在分析葡萄酒含有的痕量黄酮类产物时，还可采用质谱联用技术，通过比较峰式的数据，一定程度上可以定性和定量测定黄酮类化合物的含量，以及了解不同地区葡萄酒的酒精度差异。
综上所述，葡萄酒中的黄酮类化合物多样且丰富，是决定葡萄酒特性和消费者口感的重要因素。
为了分析其含量，可以采用改进型的HPLC技术，也可以结合质谱技术来来测定黄酮类化合物含量以及进一步对葡萄酒质量进行科学研究。
天然产物化学全套 - 黄酮类化合物的检识与结构鉴定
B
6' 5'
OR'
~ 7.10, d, J ≈ 8.5 Hz ~ 7.90, d, J ≈ 2.5 Hz ~ 7.90, d, J ≈ 8.5, 2.5 Hz
25
第四节 分析：
检识与结构鉴定
二、紫外光谱
OH HO O OH
黄酮或3-O-苷 I=410-359=51nm，4'-OH
O-Glycosyl OH O
II=271-259=12nm，7-OH
I=387-359=28nm，B环有邻二OH AlCl3/HCl与AlCl3相比， I=402-433= -31nm, B环有邻二OH AlCl3/HCl与MeOH相比，
（但不包括5, 6-位）
O
注：与其在甲醇溶液中的光谱进行比较
19
第四节
检识与结构鉴定
二、紫外光谱
4、三氯化铝及三氯化铝/盐酸（AlCl3及AlCl3/HCl）
AlCl3可与下列结构系统络合，引起相应吸收带红移。
O O
OH
OH OH O O
OH
生成的铝络合物的相对稳定性顺序： 黄酮醇3-OH ＞ 黄酮5-OH ＞ 二氢黄酮5-OH ＞ 邻二酚OH ＞ 二氢黄酮醇3-OH
3
处理、喷2%AlCl3甲醇溶液(UV下检查)等
第四节
检识与结构鉴定
一、色谱法
（一）双向纸色谱法
第一向展开 —— 分配作用
展开剂：醇性溶剂，
如 n-BuOH-HOAc-H2O(BAW, 4:1:5上层)
Rf值：苷元＞单糖苷＞双糖苷， 一般苷元 > 0.7，苷 < 0.7
4
黄酮类成分分析
（2）与金属盐的配位反应
铝盐（Al3+）、锆盐（Zr4+） 铅盐（Pb2+）、锶盐（Sr2+）
芹菜素 木犀草素
有荧光
Al3+、Zr4+能与大 多数黄酮类药物 产生黄绿色荧光
+ 醋酸铅
碱式醋酸铅
硝酸铝
+
三氯化铝 二氯氧化锆
黄色配位物 有荧光
黄色↓ 红色↓
5. 紫外光谱特征 交叉共轭
B
A
C
苯甲酰基 吸收带Ⅱ 240 ~ 285nm
，加5%二氯氧化锆溶液1~2滴，溶液显黄色，再
加盐酸1~2滴，黄色不褪。
锆-枸橼酸反应 （区分C3-OH或C5-OH ）
黄色
鲜黄 褪色
锆-盐酸反应 （区分B环有无邻二-OH）
黄色
黄色 褪色
芹菜素
槲皮素
例 黄芩提取物
Ch.P（2005）
本品为黄芩经提取干燥制得的粉末。
【鉴别】取本品少量，加水2ml，滴加氢氧化 钠试液1滴，溶液显橙黄色，滴加稀醋酸，使溶液 颜色基本褪去，然后再滴加5%二氯化氧锆溶液1 滴，溶液显黄色，加稀盐酸颜色不褪。
桂皮酰基 吸收带Ⅰ 300 ~ 400nm
葛根素（异黄酮类） 甘草苷（二氢黄酮类）
Ⅰ带 304 ~ 350 Ⅱ带 250 ~ 270
芹菜素
Ⅰ带 358 ~ 385 Ⅱ带 250 ~ 270
山萘素
Ⅰ带 低强峰或带Ⅱ的肩峰 Ⅱ带 245 ~ 270
5，7，4′-三羟基异黄酮 5，7，4′-三羟基二氢黄酮 5，7，4′-三羟基黄酮 5，7，4′-三羟基黄酮醇 4，2’，4′-三羟基查尔酮 4，6，4′-三羟基橙酮 5，7，4′-三羟基3-O-鼠李糖花青素苷
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5C 4 CC OH O
A
C 4C3C OH O
B
OH
OH C
铝盐：常用试剂为1%三氯化铝或硝酸铝溶 液，生成的络合物为黄色，并有荧光。
锆盐：多用2%二氯氧化锆甲醇液，生成黄 色的络合物
铅盐：常用1%醋酸铅及碱式醋酸铅水溶液， 生成黄-红色沉淀
镁盐：常用醋酸镁甲醇液，二氢黄酮、二 氢黄酮醇类可显天蓝色荧光。而黄酮、黄 酮醇及异黄酮类等则显黄—橙黄--褐色
（3）四氢硼钠（钾）反应(补充)
NaBH4是对二氢黄酮类化合物专属性较高 的一种还原剂，与二氢黄酮类化合物产 生红色—紫红，其它黄酮类化合物均不 显色，可与之区别。
2、络合反应（与金属离子铝、铅、锆、镁等）
产生络合反应的条件必须具备下述条件 之一：A、5-羟基 B、3-羟基 C、邻二酚 羟基 都是羟基与4位羰基共同与金属离 子形成络合物的。
（4）分子中芳香核、共轭双键多则吸附力强，反 之吸附力弱
（5）分子中若没有游离酚羟基，其Rf值的大小主 要由所连糖的性质而定，糖数目越多Rf值越大。
3、纤维素薄层色谱 分离黄酮苷类较好
四、定量分析
（一）总黄酮的含量测定 比色法（可见分光光度法）
紫外分光光度法
由于黄酮类化合物均具有α-苯基色原酮 的基本结构，羰基与二个芳香环形成两 个较强的共轭体系，对紫外光区相应有 两个特征吸收。
（二）薄层色谱法
一般采用吸附薄层。
硅胶色谱分离弱极性化合物较好，聚 酰胺色谱分离含游离酚羟基的黄酮及 其苷类较为理想，而纤维素薄层适用 于分离多糖苷混合物。
1、 硅胶色谱
其Rf顺序如下： RCH3 > RH > ROCH3 > R-O-糖 > ROH
常用的溶剂系统(TLC)
1）甲苯：甲酸乙酯：甲酸（5：4：1） 分离刺槐 乙素、双氢槲皮素、槲皮素、山柰素等黄酮甙元 2）乙酸乙酯：丁酮：甲酸：水（5：3：1：1） 适于分离芦丁、金丝桃甙、槲皮甙 3） 苯：吡啶：甲酸（36：9：5）适用于结构相 近的黄酮、黄酮醇及二氢黄酮 4） 苯：甲醇（95：5）分离黄酮甙元
（2）、反相色谱 常用的流动相有甲醇-水-乙酸（或磷酸缓 冲液）及乙腈-水
（3）、计算分光光度法
（4）、极谱法
酸碱性：黄酮类大多含有酚羟基，因此 具有弱酸性，可与强碱成水溶性的盐， 这一性质常用于黄酮类化合物的分离。
显色反应 1、还原反应 2、与金属盐络反应紫外光谱特征三、定性鉴别
（一）化学显色法 1、还原反应 （1） 盐酸-镁粉反应
（2）盐酸-锌粉反应(补充)
用以区别二氢黄酮醇、黄酮以及黄酮醇
通常仅二氢黄酮醇显红色，黄酮、黄酮 醇不显色。
黄酮类(flavonoids)制剂的分析
分布
黄酮在藻类、菌类中少见，苔藓植 物大多含有，裸子植物中类型较少， 主要集中在被子植物：如豆科、伞 形科、唇形科、菊科、鸢尾科。常 用中药有槐米、黄芩、葛根、陈皮、 银杏叶等。
二、理化性质
物理性质：黄酮类成分大多具有完好的晶形
溶解性：一般游离黄酮难溶于水，而易 溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等有 机溶剂。如引入羟基越多，其水溶性越 强。黄酮甙类由于含亲水性强的糖基， 可溶于强极性和中等极性的溶剂中，如 热水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯。难溶或 不溶于弱极性有机溶剂中，如乙醚、氯 仿、苯等。
吸收带Ⅰ是由B环的桂皮酰基所引起，在 300-400nm Ⅱ带是由A环的苯甲酰基引起，在较短波 长240-285nm
（二）单体黄酮成分的含量测定
1、薄层色谱法 薄层刮板法 薄层扫描法
2、高效液相色谱法
（1）、正相色谱 硅胶柱适用于不含羟基或乙酰化的黄酮类化合 物
流动相：正庚烷-乙醇（异丙醇） 乙酰化常用吡啶乙酸酐乙酰化 -CN柱适用于乙酰化黄酮类成分和带一个-OH的 黄酮类成分 流动相用已烷-氯仿 -NH2柱适用于2个以上-OH的黄酮类成分 流动相用二氧六环-二氯甲烷（1：9）
苯：丁酮：甲醇（60：20：20）黄酮甙元 水：乙醇：丁酮：乙酰丙酮（65：15：15：15）
黄酮类化合物在聚酰胺薄层色谱行为中 的一些规律：
（1）黄酮类甙元用亲脂性溶剂分离效果较好，在使 用亲脂性溶剂时，分子中游离酚羟基越多，吸附越 强
（2）黄酮类甙与相应的甙元相比较，因甙比相应 甙元的酚羟基少，聚酰胺对它的吸附性小于甙元， 所以一般甙较相应甙元的Rf值大。 （3）分子中酚羟基位置对吸附也有影响，聚酰胺 对间位或对位羟基的吸附较邻位羟基强。
2、聚酰胺薄层
聚酰胺薄层用于分离含游离酚羟基的黄酮 甙与甙元较好，因易于与聚酰胺中的酰胺 基形成氢键，再据其形成氢键能力的差异 而得到分离。
溶剂系统。
甲醇：水（8：2）——芦丁、槲皮素
乙醇：水（3：2）； 水：乙醇：乙酰丙酮（4： 2：1）；水：乙醇：丁酮：乙酰丙酮（13：3： 3：1）——槲皮素、山柰酚