(完整版)FISH检测标本要求
病鱼样品送检的注意事项
病鱼样品送检的注意事项病鱼样品采集是鱼病诊断工作中的重要环节，采样时间、样品有无代表性，样品的处理、保存、运送是否合适与及时，都与检验结果的准确性、可靠性有很大关系。
要做到正确采集病鱼样品，须做到以下几点。
1.要挑选活鱼或将要死的鱼由于鱼的死亡，寄生虫也很快随着死去，寄生虫死后往往改变形状或崩解腐烂。
活的或刚死的鱼，症状明显，但死亡过久的鱼，由于腐败分解，病灶部位也会模糊不清，原来所表现的症状已无法分辨。
路途较近，可用湿布或塑料布将鱼包着，保持鱼体表的湿润。
路途远的，送检时应该把病鱼放在装有水的容器(如塑料袋)里，最好用原池水。
但是，患病的鱼往往体质较弱，在较远的送检途中很容易死亡，可在有水的容器中(如氧气袋)倒入少量增氧剂，如充纯氧或双氧水，可延长病鱼的存活时间，但这种方法不适合由于水质原因引起的鱼病。
2.送检的病鱼样品必须具有代表性在发病的鱼塘中，单一的鱼病较为少见，往往是两种或几种鱼病并发，如在患赤皮病的鱼塘中往往伴生水霉病，指环虫病往往伴生细菌性烂鳃病。
但是，几种病伴生的情况往往只有一种病对鱼的危害最大，诊断过程中只有抓住了主要的病因，才能收到最佳的疗效，所以挑选能代表所患病症的典型病鱼对于正确诊治鱼病至关重要。
3.送检的病鱼要有一定的数量一般日死亡量小的鱼塘（如每天10尾以下），送检的病鱼可以5尾左右，日死亡量大的（如每天20尾以上），送检的病鱼最仇10尾左右，防止出现以偏概全的情况，影响对疾病的正确诊断。
4.水样很多鱼病的发生和水质的好坏有很大的关系，比如出血病、车轮虫病等，并且很多鱼病本身就是由水质因素直接引起的。
所以，送检时除了病鱼样品外，最好用原池水洗净的矿泉水瓶，装上一些池水，以便渔医人员对水质状况进行参考。
重庆永川：近期大量供应水花(鱼苗)鱼种。
FISH检测标本要求
FISH检测标本要求FISH（荧光原位杂交）是一种基因诊断技术，可用于检测染色体异常或一些基因的扩增、缺失或重排等变异。
在进行FISH检测时，标本的质量和处理方法对检测结果至关重要。
下面是FISH检测标本所需的一些要求：1.标本类型：FISH检测可以使用不同类型的标本，包括固定组织切片、细胞悬液或细胞块等。
标本的选择取决于要检测的疾病类型和目标基因。
2.标本采集：标本采集必须严格按照操作规范进行，以确保标本的完整性和准确性。
对于组织切片标本，应按照标准的组织取样技术采集。
对于细胞悬液或细胞块标本，应使用无菌工具采集，并避免污染或损伤细胞。
3.标本固定：标本固定是指使用合适的固定剂将标本中的细胞或组织固定在载玻片上，以便进行后续处理。
常用的固定剂包括4%的甲醛和乙酸乙酯等。
固定必须足够强度以保持细胞形态和染色质结构的完整性。
4.标本处理：标本处理是指对固定的标本进行前处理步骤，以去除固定剂、蛋白质等，以提高FISH信号的强度和清晰度。
标本处理涉及细胞膜的渗透性改变、DNA的变性和解聚，以及FISH探针结合的条件等。
标本处理通常包括脱水、去脂、裂解和蛋白酶消化等步骤。
5.FISH探针：FISH探针是用于与目标DNA序列特异性结合的荧光标记探针。
对于不同的FISH应用，需要选择不同的探针，如诊断性FISH探针、定量FISH探针和断裂FISH探针等。
探针的选择应根据需要检测的基因、染色体和疾病类型进行。
6.标本稳定性：标本的稳定性是指在采集和处理过程中，标本中的核酸和蛋白质的完整性是否保持良好，以确保准确的FISH结果。
标本应在适当的温度下存储，并且在处理之前应避免冻结和解冻的过程。
7.检测结果的解读：FISH检测结果的解读应由经验丰富的专业人员进行，因为FISH结果的解读涉及对不同信号模式、缺失或重排等变异类型的鉴别。
除了以上的要求，FISH检测标本还应根据具体的疾病类型和检测需求，进行其他特定的处理步骤和质量控制。
FISH检测标本要求
×100
评价17号染色体的意义
17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少 于2个；
乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良；
17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的 主要原因；
我实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为
33.3%。
评价Her-2基因状态的同时应考虑
乳腺癌 Her-2基因
致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同 源）； 25-30%乳腺癌病人都有 HER-2的扩增； HER-2基因扩增是决定 Herceptin治疗是否有效的关键 性指标。
Her-2基因的检测方法
检测方法 检测指标
优点
缺点
IHC CISH FISH
Her-2蛋白 Her-2 DNA Her-2 DNA
费用低 光镜即可观察结果
光镜即可观察结果
对于低倍、高倍染色 体非整倍性扩增检测 准确性高，灵敏度特 异性好，结果判断客 观
准确性差，主 观性强，假阳 性率高
对低度扩增及 染色体非整倍 扩增检测灵敏 度下降
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免疫组化（2+）与FISH对比图 1.
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色
×40
住院号：175465 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：++ FISH：Ratio>5，中度扩增
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免疫组化（2+）与FISH对比图 2.
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色
×40
×100
住院号：176921 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：++ FISH：Ratio＝1.45，无扩增
FISH以及免疫荧光的实验步骤
FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（荧光原位杂交）是一种用于检测DNA或RNA序列的实验技术。
该技术结合了传统原位杂交和荧光显微镜技术，可以在细胞或组织样本中定位、标记和可视化特定的DNA或RNA分子。
下面是一个典型的FISH实验的步骤：1.准备标记探针：选择适当的探针来标记目标DNA或RNA序列。
探针通常是短的DNA或RNA片段，与目标序列互补，可以与其发生特异性杂交。
这些探针可以使用不同的标记物进行标记，如荧光染料或辐射性同位素。
2.样品制备：根据需要，制备细胞悬液或组织切片样品。
细胞悬液可以通过离心细胞，将细胞固定在载玻片上。
组织切片可以使用刮片或切片机获得，然后固定在载玻片上。
3.固定样品：将细胞悬液或组织切片固定在载玻片上，以保持细胞或组织的形态结构。
常用的固定剂包括乙醇、甲醛等。
4. 渗透化处理：使用渗透化剂渗透细胞或组织样品，以增加探针和标记物的进入性能。
常用的渗透化剂包括蛋白酶K和Triton X-100。
5.探针杂交：将标记的探针与样品中的DNA或RNA序列结合。
首先在浓度适宜的探针液中孵育样品，使探针与目标序列发生杂交。
温度和时间取决于探针和目标序列的碱基组成和长度，通常需要在高温下进行，以增加探针与目标序列的特异性。
6.杂交后的冲洗：使用适当的缓冲液冲洗样品，以去除未结合的探针和杂交条件中的非特异性结合。
冲洗通常需要进行多次，以确保特异性结合。
7.荧光染色：如果探针是荧光标记的，在杂交后可以直接进行荧光染色。
将样品浸泡在适当浓度的荧光染料中，以标记目标序列。
染色时间通常较短，一般在15-30分钟左右。
8.荧光显微镜观察：在荧光显微镜下观察和记录标记的目标序列的位置和数量。
使用适当的滤光片来选择和分离目标染色的荧光波长。
利用计算机软件，可以对显微镜下的图像进行分析和处理，以获得更多的信息。
在进行FISH实验时，需要注意一些技术细节和注意事项：1.适当的正向和阴性对照是必要的，以确保实验的准确性和可靠性。
完整版Fish实验
FISH-荧光原位杂交实验（原位杂交）实验目的通过实验了解荧光原位杂交技术的基本原理和在生物学、医学领域的应用。
掌握原位杂交技术的操作方法，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。
2. 实验原理荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。
目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。
由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。
与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
杂交所用的探针大致可以分为三类：1）染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测；2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得；3）特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。
间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。
而直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸蔌磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。
FISH检测标本要求
FISH检测标本要求FISH（荧光原位杂交）被广泛应用于基因组学和细胞遗传学领域，用于检测染色体异常、基因扩增、基因融合及基因定位等。
对于进行FISH检测的样本，有一些要求需要满足，以确保检测结果的准确性和可靠性。
以下是FISH检测标本的要求：1.标本类型：FISH检测可以应用于多种不同的样本类型，包括固定细胞、血液、组织、骨髓、体液等。
具体选择何种样本类型应根据所需检测的目的来决定。
2.标本采集：标本采集应在临床上病情活体检查或治疗之前，并避免使用抗生素等干扰因素。
采集的样本应尽量新鲜，以避免DNA的降解和破坏。
对于外周血样本，常规采用采血管内导管的方式获得可大量的细胞样本。
3.标本固定：固定样本的目的是阻止细胞的自溶和降解，保持细胞的形态结构。
常用的样本固定剂包括甲醛、氯醋酸、琼脂糖等。
固定时间通常为24至48小时，不同样本类型和实验需求可能会有所不同。
4.样本处理：在进行FISH检测前，需要将样本进行一系列的处理步骤来去除可能存在的蛋白质、核酸或其他干扰物质，以确保FISH信号的清晰度和可见性。
处理步骤包括：蛋白酶消化、DNA解旋、脱色、去噪等。
5.样本制备：样本制备是FISH检测中非常重要的一步。
首先，将固定的细胞或组织样本进行切片或悬液制备。
对于细胞悬液，可以通过离心等方法获得高纯度的细胞。
对于组织，切片需要足够薄，以便光线可以通过并确保信号的清晰度。
6.探针选择：FISH检测使用到荧光标记的探针来定位特定的基因序列或染色体异常。
根据所需检测的目的，选择合适的探针。
对于染色体异常的检测，可以选择染色体特异性或基因特异性探针。
7.检测技术：在进行FISH检测时，需要使用高分辨率荧光显微镜来观察信号。
同时，还需要使用图像分析软件来分析和计算信号的数量和强度，并最终确定特定基因序列或染色体是否存在异常。
总之，从样本采集到最终的FISH检测结果，需要严格遵守一系列的操作步骤和要求，以确保检测结果的准确性和可靠性。
膀胱癌FISH检测尿液样本要求
膀胱癌FISH样本收集要求
（1）初诊病人或复发检测病人留取尿液：
在开单时就要叮嘱患者保持正常饮食。
收集的尿液最好是晨尿，200-500ml，用一次性尿袋或干净矿泉水瓶（刚开封的）收集，越多越好，然后置于冰箱冷藏室（2℃-8℃），于当天早上送检，标本需要较长时间（2小时以上）运输时置于冰袋中（环境温度2℃-8℃）。
有夜尿习惯的患者也可收集夜尿(分开收集)。
对于老年患者，尤其是患有前列腺疾病的，其晨尿往往无法留足200ml以上，这时候建议同时收集夜尿。
部分尿液细胞较少的患者可在留尿前稍做运动（或按摩腹部约半小时）。
细胞量不够是经常遇到的，此时和医生保持联系，确定是否需要重新留尿或退费。
尽量避开临床炎症期（炎症细胞污染、鳞状细胞污染、尿路细菌感染等），因为此类细胞会对目的移行上皮细胞造成覆盖或稀释，在结果判读时会造成干扰，此类病人需用药消炎后再行FISH检测。
有结石史患者需与临床沟通，此类病人可能造成细胞刺激性增生，干扰结果判读。
询问病人是否正在服药，部分患者正在使用药物的话可能对细胞收集造成干扰。
（2）手术中病人留取膀胱冲洗液或输尿管导出液：
约200ml以上，如果怀疑为上尿路尿路上皮癌，最好能收集到该部位的冲洗细胞；如果直接用尿液来检测上尿路是否发生病变，误差会较大。
需要注意留置导管可能造成润滑剂污染。
FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一)
FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。
二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况 三仪器设备及耗材（一） 仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。
可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。
10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。
12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。
（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。
）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。
四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。
试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml 胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。
FISH实验室质控标准初稿
FISH实验室质控标准初稿一：温度控制：①：水浴锅的温度每周记录并用温度计测量其温度显示是否正常。
②：考普林瓶使用时加盖，保证瓶内温度均一，稳定。
③：杂交仪工作时保证密封状态。
④：试剂冰箱，标本冰箱的温控。
二：时间控制：①：低渗时间控制，足够的低渗时间才能让细胞核展开，利于杂交。
如遇到羊水标本有少量木血污染，应将低渗时间缩短，让胎儿上皮细胞与母体血细胞容易区分（区分方法：（1）：核形态的区分，上皮细胞细胞核呈不规则的椭圆形，血细胞核呈规则圆形。
二：在低渗20min 的情况下，上皮细胞能观察到带膜，血细胞为裸核状态。
）②：2XSSC浸泡时间控制，时间过长：容易掉片。
时间过短：起不到洗涤，缓冲的作用，不利于信号杂交。
③：烤片的时间控制：时间过长：DNA降解，信号杂交不上（石蜡样本不受影响）。
时间过短：掉片。
④：胃蛋白酶工作液或PK工作液的时间控制：时间过长：消化过度，呈空核。
时间过短：消化不完全，信号不易杂交。
（尤其石蜡组织切片时PK工作液的消化时间控制，因为每次切片的厚度不一样，所以容易消化过度，或者消化时间不足，一般做2-3张片子梯度消化，并最好用胃蛋白酶工作液代替PK工作液，）⑤：NP-40洗涤时间控制。
三：试剂控制：比如新配的20XSSC 0.1%NP-40/2XSSC 2XSSC保存6个月，1M Hcl 保存一个月。
四：暗室控制，实验的大多部分以及阅片均应在暗室下进行，不让会让探针荧光信号猝灭。
五：滴片的控制：滴片浓度不宜过稀（难以找到足够符合计数要求的细胞）。
不宜过密（细胞核重叠，不能计数）。
六：其他质控：如玻片的洁净度（防止背景过强），离心转速（过大的转速能使为固定的细胞形态发生改变，尤其是在低渗后，细胞核膨胀，比较脆弱。
）。
FISH以及免疫荧光的实验步骤
FISH以及免疫荧光的实验步骤FISH（Fluorescence In Situ Hybridization）是一种分子生物学技术，用于在细胞或组织中定位和检测特定的DNA序列。
免疫荧光是一种利用标记有荧光的抗体来检测特定抗原的方法。
以下是FISH和免疫荧光的基本实验步骤。
FISH实验步骤：1.样本准备：首先需要准备要研究的细胞或组织样本。
可以通过细胞培养、组织切片或细胞悬液来准备样本。
2.固定样本：将样本加入含有人工合成的固定剂（如4%的甲醛溶液）中进行固定处理。
固定可以保留细胞和组织的形态结构，并提高探针的渗透性。
3.消解：将样本进行胰蛋白酶等消解处理，以去除细胞或组织内的蛋白质，并增加探针的渗透性。
4.杂交：将探针与样本进行杂交反应。
探针是一段与目标DNA序列互补的DNA分子，通常通过荧光标记或酶标记来进行检测。
样本和探针在适当的温度和缓冲液中进行反应，以使探针与目标DNA序列结合。
5.洗涤：对样本进行一系列的洗涤步骤，以去除未结合的探针和其他非特异性结合物质，提高检测的特异性。
6.反应显色：对样本进行适当的显色反应，使探针的标记物可见。
常用的显色方法包括荧光显微镜、荧光素酶等。
7.观察和分析：用荧光显微镜观察样本，记录和分析目标DNA序列的位置和数量。
可以通过计算光强度或使用图像分析软件进行定量分析。
免疫荧光实验步骤：1.样本准备：准备要研究的细胞或组织样本。
可以通过培养细胞、组织切片或细胞悬液来准备样本。
2.固定样本：将样本加入含有人工合成的固定剂（如4%的甲醛溶液）中进行固定处理，以保留细胞和组织的形态结构。
3. 渗透处理：将样本进行渗透处理，以提高抗体对抗原的反应性。
通常使用非离子性洗涤剂（如Tris-buffered saline-Tween（TBST））或0.1%的Triton X-100等。
4.抗原修复：将样本进行抗原修复处理，以恢复抗原的一般形态，增强抗原的免疫反应。
可以使用高温加热、酶消化或化学处理等方法进行修复。
FISH操作步骤
FISH操作步骤FISH (fluorescence in situ hybridization)是一种分子生物学技术，用于检测和定位细胞中的基因序列，以及染色体的异常。
下面是进行FISH实验的详细步骤：1.制备细胞悬液：从样品中提取细胞，例如组织切片、细胞培养物或血液等。
确保样品新鲜，并尽可能减少细胞的损伤。
2.固定样品：将细胞悬液投放在玻片上，并用适当浓度的溶液固定细胞。
通常使用4%的乙醛或乙醇进行固定，可以尽量保持细胞结构和染色体的完整性。
3.制备FISH探针：FISH探针是用于探测特定DNA序列的标记分子。
探针可以使用基于DNA或RNA的技术进行制备，并标记上荧光分子，如荧光染料。
选择合适的探针，以便与要检测的目标序列互补。
4.水解：在用于FISH的组织样品中，通常需要进行DNA的水解过程，以使DNA链能够更好地与FISH探针结合。
水解可以通过使用裂解剂如盐酸或HCl，以及加热和冷却步骤来实现。
5.探针杂交：将制备好的FISH探针加到制备好的细胞悬液或玻片上，并在恒温条件下进行杂交。
在探针结合过程中，探针的特异性序列与目标DNA序列互补，形成一个稳定的结合复合物。
6. 洗涤：在探针杂交完成后，需要进行反复的洗涤步骤，以去除非特异性结合的探针和杂质。
洗涤可以使用低盐缓冲液来实现，如2× SSC (0.3 mol/L NaCl, 0.03 mol/L sodium citrate) 或PBS（磷酸盐缓冲液）。
7. 核染色：为了观察细胞和染色体的结构，可以进行核染色，以将细胞核染成特定颜色。
常用的核染色剂有DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)、Hoechst、Propidium iodide等。
8.显微镜观察：直接将FISH样品放置在显微镜下，观察探针的荧光标记和核染色的情况。
使用荧光显微镜观察，可以看到探针结合的位置以及染色体上的信号。
9.图像采集和分析：使用数字相机或其他图像采集设备，记录FISH 实验的图像。
fish显微镜下读片原则
fish显微镜下读片原则
使用显微镜观察鱼类样本时，以下是一些通用的读片原则：
1. 准备样本：确保样本制备得当，包括适当的固定、切片和染色等处理。
2. 选择适当的放大倍数：根据需要选择适当的放大倍数，通常从低倍到高倍进行观察。
3. 观察整体结构：先整体观察样本的整体结构和形态，包括组织、器官的形状和布局。
4. 注意细节：逐渐放大倍数，观察样本的细节，如细胞结构、细胞器、细胞间连接等。
5. 比较和对比：比较不同样本或同一样本的不同部位，观察是否存在差异或异常。
6. 记录和注释：及时记录观察到的特征和发现，并可以使用适当的标记或注释来帮助记忆和解释。
7. 结合其他技术：如果需要，可以结合其他技术如免疫组化、荧光染色等来获取更多信息。
fish核型鉴定步骤
fish核型鉴定步骤鱼类核型鉴定步骤1. 样本采集采集待鉴定鱼类的鳍条、鳞片或血液样品。
组织样品应新鲜或保存于冷藏或冷冻条件下。
2. 组织培养将组织样品置于含丝裂素的培养基中。
培养时间取决于物种和组织类型，通常为 24-72 小时。
3. 细胞收获用秋水仙素处理细胞，阻止有丝分裂于中期。
收获中期细胞，通常通过离心。
4. 细胞膨化用低渗缓冲液处理细胞，使染色体膨化。
胰蛋白酶消化细胞，去除细胞质。
5. 染色体固定用冰乙醇或甲醇固定染色体。
固定时间取决于物种和细胞类型。
6. 染色体展片将固定后的染色体悬液滴加到载玻片上，然后用火焰干燥。
染色体应均匀铺展在载玻片上。
7. 染色使用 Giemsa 染色剂或荧光染料染色染色体。
染色时间取决于染色剂和物种。
8. 载玻片装片在染色后的载玻片上滴加装片剂。
盖上盖玻片，密封后观察。
9. 染色体计数和分类使用显微镜观察染色体。
计数染色体数量，并根据大小、着丝粒位置和染色带模式对染色体进行分类。
10. 核型分析将染色体组织成核型图。
核型图应显示染色体数量、大小、形状和条带模式。
核型可以用来识别染色体异常、物种鉴定和遗传研究。
注意事项：组织样品的质量对核型鉴定的成功至关重要。
培养和处理步骤应仔细优化，以最大限度地获得中期染色体。
染色体计数和分类需要经验丰富的细胞遗传学家进行。
核型分析应与其他技术（如分子标记）结合使用，以获得更准确和全面的遗传信息。
FISH实验标准操作程序(FISH实验资料一)
FISH实验标准操作程序（成都新基因格实验室内部完整版）一实验目的通过荧光原位杂交实验，辅助临床医疗诊断：提高优生优育（产前诊断中的应用）、提前预防及治疗病患（产后诊断及膀胱癌诊断等）、对肿瘤确诊病人评估预后及中位生存期、无病痛生存期(Dsease-Free Srvival,DFS)，指导用药及治疗方案（针对乳腺癌、胃癌患者的HER-2基因诊断，针对CML患者的bcr/abl融合基因诊断等）。
二实验原理利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交,通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况 三仪器设备及耗材（一） 仪器设备：①：全自动分子杂交仪②：荧光显微镜及分析软件③：恒温水浴箱3个以上（小型号）④：冰箱2台（提供试剂和标本存放，4摄氏度和-20摄氏度）⑤：离心机（用于羊水标本以及血液标本，绒毛标本处理过程的离心）⑥：通风橱（配固定液，等操作）⑦：迷你离心机（探针，缓冲液的离心。
可离1.5ml管、0.2ml管）⑧：考普林瓶15个（FISH实验中盛放各种试剂，溶液）⑨：移液枪（5ml，1000ul，200ul，10ul）放于杂交室和制备室。
10：震荡混匀器11：计时器，温度计，温度湿度显示器。
12：载玻片盒（用于存放已经FISH实验后的FISH片子）13：洗耳球，吸量管（10ml）,烧杯，容量瓶，电子天平，常用天平称。
（二）耗材：载玻片（最好，带磨砂的，写用铅笔患者编号，因为不带磨砂的贴标签会被乙醇洗掉。
）大盖玻片（方形，用于镜检）小盖玻片（方形或圆形，圆形佳，用于分子杂交时候封片）离心管（10ml，1.5ml，200ul）3ml一次性吸管个人防护用品,标签纸等。
四实验样本及试剂样本：外周血，骨髓血，羊水，尿液，病理组织切片等。
试剂：4%NaOH液、0.1%NP-40、20XSSC、2XSSC、0.075M Kcl、1M Hcl、PBS缓冲液、0.08mg/ml 胃蛋白酶工作液、200ug/ml蛋白酶K工作液、检测试剂盒等。
精子fish sop
人精子染色体荧光原位杂交（FISH）标准操作规程一. 目的：建立双三色FISH，研究人精子染色体的非整倍体，以及染色体倒位、易位患者所产生配子的情况。
二. 实验材料：(一).实验具器：有刻度离心管、吸管、载玻片、盖玻片、6个立式染缸、小镊子、胶水、玻璃笔。
(二).仪器设备：恒温箱、水平离心机、斜式离心机、荧光显微镜、相差生物显微镜，恒温水浴箱、变性杂交仪（Vysis公司）。
(三).试剂及配制：1.试剂和药品：美国Vysis公司的染色体计数探针（Chromosomeenumeration probe CEP）、20×SSC(32-804850)500g、NP-40(32-804818)2×1000ul 生理盐水、 6mM EDTA的PBS、DAPIⅡcounterstain(32-804831)2×500ul(125ng/ml)、无水洒精（100% ethanol）、1N NaOH 、纯水（distilled water，HO）。
22.试剂和药品的配制：O）中，混1)20×SSC溶液：132g 20×SSC加入400ml蒸馏水（H2匀，然后加蒸馏水至总量500ml。
调节PH5.3，室温保存。
有效期为6个月。
O中加入100ml 20×SSC，混匀，然后加入2)2×SSC溶液：850mlH2H2O至总量1000ml。
调节PH7.0±0.2，室温保存。
有效期为6个月。
3)2×SSC/0.1%NP-40溶液：850ml HO加入20m l 20×SSC溶液，2混匀，再加入1mlNP-40，然后加HO至总量1000 ml。
调节2PH7.0±0.2，室温保存。
有效期为6个月。
O加入20ml 20×SSC，混4)0.4×SSC/0.3 %NP-40溶液：950ml H2匀，再加入3mlNP-40，然后加入HO至总量1000ml。
流产胎儿组织FISH检测标本要求相关事宜
流产胎儿组织FISH检测标本要求相关事宜
各位医生：
为了方便各医疗保健机构的医生对自然流产的原因检查，四川省产前诊断中心/四川大学华西第二医院遗传实验室开展了对流产胎儿组织的遗传学检查（FISH）。
如各位医生需要进行这项检测，请按照以下要求和方法采取、保存和转送标本。
一、送检标本要求
早期流产（＜12周）：绒毛组织
中晚期流产或引产（≥12周）：以下任何一种标本均可
1、羊水10-20ml
2、胎儿血5-10ml
3、胎儿肌肉1×1×1 cm3
二、标本转送要求
1、采取标本后，装于离心管中以约5ml无菌生理盐水浸泡，放于4℃冰箱。
2、低温保存(4-10℃)运送，尽快送至四川大学华西第二医院产前诊断中心病员
接待处（门诊采血处斜对面）（成都市人民南路三段20号）。
3、请勿以任何固定液固定，尤其不能用福尔马林（甲醛）固定。
三、华西二院流产胎儿组织FISH 检测开单流程。
FISH技术全攻略
FISH技术全攻略FISH技术，即荧光原位杂交技术，是一种常用于细胞和组织中DNA 和RNA分子的定位和检测的方法。
它利用荧光标记的探针与待测物（DNA 或RNA）特异性结合，并通过显微镜观察荧光信号的强弱、位置等特征，从而实现对目标分子的检测和定位。
下面是FISH技术的全攻略。
一、实验准备1.准备标记探针所需的DNA或RNA杂交模板。
2.选择适合的荧光标记物，如荧光素或荧光染料。
根据待测物的特异性，选择合适的探针序列。
3.选择适当的杂交缓冲液和嵌合反应缓冲液。
4.准备样本制备所需的试剂和器材，如细胞培养液、组织切片等。
二、标记探针1.获得待测物的DNA或RNA序列，并设计与之特异性结合的引物。
2.利用引物将待测物扩增，并进行纯化。
3.利用PCR或反转录-PCR等方法将引物和合适的荧光标记物连接起来，形成标记探针。
4.对标记探针进行纯化和定量，确保其纯度和浓度适当。
三、样本制备1. 细胞样本制备：将待检测的细胞培养在无菌条件下，收集并进行固定处理，如用甲醛溶液固定细胞，并进行膜通透处理，如用0.1% Triton X-100等溶液处理。
2.组织样本制备：将待检测的组织收集起来，并进行固定处理和脱水处理，如用乙醚和乙醇等溶液处理。
四、杂交反应1.准备杂交缓冲液：根据具体要求配制适当的杂交缓冲液，如SSC缓冲液（含盐和柠檬酸），并加入适量含有探针的杂交模板。
2.加热探针和杂交目标：将探针和待测物的杂交模板一起加热处理，使其变性。
3.杂交：将变性后的标记探针与杂交模板进行杂交，使其重新结合。
4.温度控制：根据具体情况选择合适的杂交温度和时间，并进行合适的温度控制。
五、信号检测与图像分析1.温度冲洗：在特定的温度和缓冲液条件下进行冲洗，去除未结合的探针和杂交模板。
2.荧光显微镜观察：将样本放在显微镜下，观察和记录荧光信号的强度和位置。
3.图像分析：利用图像分析软件对荧光显微镜下观察到的图像进行处理和分析，如测量信号的强度和位置。
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A
B
Her-2基因扩增状况
A. 无须计数的大簇团信号 （高度扩增）
B. 颗粒状信号（R>10，高度扩增）
C. 须计数的颗粒状信号 （R=3.5，低度扩增）
C
Her-2基因无扩增情况
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析 方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测 标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或 未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测
FISH探针的种类
CSP探针：染色 体着丝粒探针
GLP探针：位点 特异性探针
FISH技术在乳腺癌检测中的应用
乳腺癌 Her-2基因
致癌基因：Her-2基因； 位点：17q11.2-q12； 编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同 源）； 25-30%乳腺癌病人都有 HER-2的扩增； HER-2基因扩增是决定 Herceptin治疗是否有效的关键 性指标。
×100
免疫组化（－）与FISH对比图1
×40 <30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色
×100
住院号：176846 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：－ FISH： Ratio＝1.02， Her2基因无扩增
免疫组化（－）与FISH对比图2
肿瘤细胞不着色
×40
住院号：175472 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：－ FISH：呈簇状扩增
17号染色体数目的变化
IHC与FISH结果不一致原因分析
➢ IHC判断标准的主观性
➢ 内对照探针——17号染色体着丝粒探针的建立，
红信号数>2，同时绿信号非整倍体 R<1.8，无扩增
红信号与绿信号 均为两点，R=1
荧光原位杂交与免疫组化检 测Her-2结果比较
我实验室已完成病例小结
FISH
IHC
0 1+ 2+
(n=15) (n=5) (n=14)
3+
(n=29)
总数
（n=63）
无扩增 13 3
4
扩增 2 2
10
0
20
29 43
WPP探针：全 染色体或染色体 区域特异性探针
centromere
telomere subtelomere
locus specific
whole chromosome paint
操作流程简图
制片
预处理
• 破坏细胞膜利于探针 杂交。
• 蛋白酶消化、HCl处理
结果分析
FISH
• 变性 • 杂交 • 洗涤 • 复染
相对费用较高
Her-2基因FISH 探针组
疾病 名称
检测探针
标记颜 色
探针定位
探针名称
乳腺 癌
GLP Her2 / CSP17
红/绿
正常: 2红/2绿
Her2： 17q11.2-q12 CSP17: 17p11.1q11. 1
CSP17:17号染 色体着丝粒
异常: 红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2个
FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分 子靶点治疗中的应用
王芳 邵建永
中山大学肿瘤防治中心 分子病理诊断实验室
Fluorescence in situ hybridization
（FISH）
➢ 细胞遗传学技术 ➢ 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA
靶序列杂交 ➢ 观察：荧光显微镜
原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 ➢ 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。
Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41% Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%
（文献报道：90-95%）
免疫组化（3+）与FISH对比图
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜高强度着色
×40
住院号：177319 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：+++ FISH：呈簇团状高度扩增
Her-2基因的检测方法
检测方法 检测指标
优点
缺点
IHC CISH FISH
Her-2蛋白 Her-2 DNA Her-2 DNA
费用低 光镜即可观察结果
光镜即可观察结果
对于低倍、高倍染色 体非整倍性扩增检测 准确性高，灵敏度特 异性好，结果判断客 观
准确性差，主 观性强，假阳 性率高
对低度扩增及 染色体非整倍 扩增检测灵敏 度下降
×100
免疫组化（2+）与FISH对比图 1.
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色
×40
住院号：175465 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：++ FISH：Ratio>5，中度扩增
×100
免疫组化（2+）与FISH对比图 2.
>30%的肿瘤细胞全部 的细胞膜弱至中等着色
×40
×100
住院号：176921 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：++ FISH：Ratio＝1.45，无扩增
用已知的标记单链核 酸为探针，按照碱基 互补的原则，与待检 材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形 成可被检测的杂交双 链核酸。由于DNA分 子在染色体上是沿着 染色体纵轴呈线性排 列，因而可以探针直 接与染色体进行杂交 从而将特定的基因在 染色体上定位
原理
荧光标 记探针
探针变性 杂 交
样本DNA变性
免疫组化（1+）与FISH对比图1
×40
×100
>30%的肿瘤细胞弱的着色
住院号：175689 浸润性导管癌Ⅱ级 IHC：+ FISH： Ratio＝1.62，无扩增
免疫组化（1+）与FISH对比图2
×40 >30%的肿瘤细胞弱的着色
住院号：175895 浸润性导管癌Ⅲ级 IHC：+ FISH：簇状扩增
的细胞)
DAPI染色后与HE切片对比图
导管内癌
观察浸润部分
结果判断
统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞）
Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数 Ratio＜1.8 为阴性结果 Ratio＞2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果
比值2～4为低度扩增 4～10为中度扩增 >10为高度扩增
×100
评价17号染色体的意义
➢ 17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少 于2个；
➢ 乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良；
➢ 17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的主 要原因；
➢ 我实验室完成病例中17号染色体非整er-2基因状态的同时应考虑