细胞集落形成实验
细胞集落形成实验 参考文献
细胞集落形成实验参考文献## English Answer:Cell Colony Formation Assay References.1. Freshney, R. I. (2010). Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications. John Wiley & Sons.2. Stacey, G. N., & Hayflick, L. (1970). Growth and viability of human embryonic fibroblasts during serial propagation in vitro. Experimental Cell Research, 63(2), 465-476.3. Hamburger, V. (1960). A quantitative analysis of colony formation in vitro by single cells dissociated from mouse embryo. Journal of Experimental Zoology, 146(3), 201-234.4. Brindley, D. C., & Lewis, J. H. (1969). An automatedcolony counter for the evaluation of suspension cultures. Experimental Cell Research, 58(2-3), 409-414.5. Hamburger, V., & Salmon, S. E. (1967). Primary bioassay of human myeloma stem cells. Journal of the National Cancer Institute, 39(2), 1027-1036.6. Bradley, T. R., & Metcalf, D. (1966). The growth of mouse bone marrow cells in vitro. Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science, 44(3), 287-300.7. Pluznik, D. H., & Sachs, L. (1965). The cloning of normal "mast" cells in tissue culture. Journal of Cell Physiology, 66(3), 319-324.8. Sachs, L., & Heller, E. (1972). Quantitative studies of cell selection and differentiation. IV. Colony formation in agar by human bone marrow cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 69(12), 3604-3607.9. McLimans, W. F., et al. (1990). Colony-forming units in circulating blood of patients with breast cancer.Journal of the National Cancer Institute, 82(2), 114-118.10. Bourinbaiar, A. S., et al. (1992). Hematopoietic colony-forming cells in the blood of patients at risk for hematologic malignancy. Blood, 79(9), 2358-2365.## 中文回答：细胞集落形成实验参考文献。
检测造血干细胞的功能方法
检测造血干细胞的功能方法
检测造血干细胞功能的方法通常包括以下几个方面的考察：
1.造血干细胞数量检测：通过血液、骨髓或者外周血中的造血干细胞数量来评估造血功能。
这可以通过流式细胞术等技术进行。
2.骨髓活检：通过从骨髓中获取样本进行检查，可以更详细地了解骨髓内的造血情况。
这样的活检通常通过穿刺抽取骨髓样本，然后在实验室中进行分析。
3.造血功能评估：
集落形成单元（CFU）分析：通过培养分离的骨髓或外周血细胞，观察和计数形成的集落单位，评估造血干细胞的增殖和分化能力。
长期培养：将骨髓细胞或外周血细胞进行长期培养，观察干细胞的增殖、分化和自我更新能力。
4.造血功能相关标志物检测：通过检测与造血过程相关的标志物，如造血生长因子、细胞因子等，来评估造血功能状态。
5.基因和染色体分析：检测造血干细胞的基因组和染色体结构，排除或发现可能影响造血功能的遗传因素。
6.移植后追踪：对于进行造血干细胞移植的个体，通过追踪移植后的细胞、观察血细胞再生情况，来评估造血功能的恢复。
这些方法可以单独或者组合使用，根据具体的研究或诊断目的选择相应的检测方法。
检测造血干细胞功能对于了解造血系统的健康状况、诊断相关疾病以及制定治疗方案都具有重要的意义。
软琼脂集落形成实验
1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
细胞工程学名词解释总结
细胞工程学名词解释总结高技术：指那些能带来高经济效益、具有高增值作用，并能向经济和社会各领域广泛渗透的新技术。
生物技术：指通过技术手段，利用生物体或生物过程来生产有经济价值产品或创造新物种的综合技术。
狭义指基因重组、细胞融合、固定化酶与细胞、生物反应器等技术领域。
广义包括资源、能量、粮食、饲料生产以及为净化环境所进行的物质分解及发酵技术等。
生化工程：是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，研究生物技术的实验室成果转化为生产力过程的工程技术问题。
细胞工程：是指以细胞为研究对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的地利用或改造生物遗传性状，以获得特定细胞、组织产品或新型物种的综合技术。
干热灭菌：指在干燥环境（如火焰或干热空气）进行灭菌的技术。
主要适用于玻璃器皿的消毒灭菌。
湿热灭菌：湿热灭菌即高压蒸气灭菌，指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法。
（是最常用和最有效的一种方法。
布类、胶塞、金属器械、玻璃器皿及某些培养用液都可用此法消毒灭菌）。
细胞计数:用血球计数板计数细胞悬液中的细胞数目，然后根据需要进行必要的调整。
mtt法：又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。
活细胞表现出线粒体脱氢酶活性，可将染料mtt还原为难溶的紫色结晶物沉积在细胞内，经酸性异丙醇溶解后呈现的色度可反映出生活细胞的代谢水平，而死细胞则无此酶活性。
活体染色：在体外条件下用某种染色剂对活的组织或细胞进行染色,而对活细胞的生理活动不产生任何明显的影响。
成集落试验：在集落刺激因子存在下培养细胞，可刺激培养细胞分化产生大小不同的细胞集落，这样的集落形成细胞称体外培养集落形成细胞，它是检验培养细胞能否增殖的过硬指标之一。
污染：一切与培养无关的杂质（微生物、化学物、细胞等）进入培养系统，影响培养物的正常生理机能。
动物细胞工程：以动物细胞为基本单位在体外条件下进行培养、繁殖和人为操作，使细胞产生某些人们所需要的生物学特性，从而改良品质，加速繁殖动物个体或获得有用品系的技术。
细胞克隆形成实验
精心整理细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力正常?(a)??(b)?1、10%210mL373、2次。
加4%10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：?(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
?(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
?(3)按3mL温箱中备用。
?(4)按0.2mL 置入37(5)不超过将1.21.4ml10000个/ml加1ml CO2的1.接种时细胞密度适度，不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
肺转移实验报告
一、实验背景肺转移是恶性肿瘤常见的并发症，也是导致患者死亡的主要原因之一。
目前，针对肺转移的治疗方法有限，因此，研究肺转移的发生机制、寻找有效的治疗方法具有重要的临床意义。
本实验旨在通过体外实验模拟肺转移过程，探讨肺转移的发生机制，为寻找新的治疗策略提供理论依据。
二、实验材料与方法1. 实验材料（1）细胞株：人肺腺癌细胞株A549、人肝细胞癌细胞株HepG2、人骨肉瘤细胞株MG-63、人乳腺癌细胞株MCF-7、人结直肠癌细胞株HCT-116、人黑色素瘤细胞株A375。
（2）实验试剂：胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、细胞培养箱、二氧化碳培养箱、显微镜、流式细胞仪、细胞培养皿、实验试剂等。
2. 实验方法（1）细胞培养：将上述细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。
（2）细胞侵袭实验：将A549细胞接种于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养24小时。
通过显微镜观察细胞侵袭情况。
（3）细胞迁移实验：将A549细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，培养24小时。
通过显微镜观察细胞迁移情况。
（4）细胞集落形成实验：将A549细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，培养14天。
通过显微镜观察细胞集落形成情况。
（5）细胞凋亡实验：将A549细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，培养48小时。
通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。
（6）细胞周期实验：将A549细胞接种于细胞培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基，培养48小时。
通过流式细胞仪检测细胞周期分布。
（7）基因沉默实验：利用siRNA干扰技术，分别沉默A549细胞中的EGFR、VEGF、MMP-9等基因，观察细胞侵袭、迁移、集落形成等指标的变化。
三、实验结果1. A549细胞具有较高的侵袭和迁移能力。
2. A549细胞在集落形成实验中形成较多的集落。
细胞原代培养细胞生物学实验报告
细胞原代培养细胞生物学实验报告细胞原代培养实验报告一、实验目的本实验的主要目的是进行细胞原代培养，通过对细胞的体外生长和繁殖过程进行观察和研究，以了解细胞的生物学特性，探索细胞生长、分化和凋亡的机制，为细胞生物学、肿瘤学、药理学等领域的研究提供实验基础。
二、实验原理细胞原代培养是指将组织样本通过一定的消化和培养技术，获得并培养单细胞悬液的过程。
这些细胞可以在体外生长和繁殖，并保持一定的生物学特性。
通过细胞原代培养，我们可以对细胞的生长、分化和凋亡过程进行深入研究，了解细胞的生物学特性，探索疾病的发病机制和药物的作用机制。
三、实验步骤1.组织样本准备：选取适当的组织样本，用PBS洗涤并用剃毛刀除去表面脂肪和结缔组织，切成1-2mm3的小块。
2.消化：将组织块加入含有胰蛋白酶和EDTA的消化液中，在37℃下消化10-15分钟。
期间需轻轻摇动几次以促进细胞释放。
3.细胞悬液制备：消化完成后，将消化液过滤至100目筛网，用PBS洗涤并离心（1000rpm，5分钟）去除上清液。
加入适量培养基制成细胞悬液。
4.细胞培养：将细胞悬液接种到培养瓶中，加入适量培养基进行培养。
在培养期间需注意观察细胞的生长情况和更换培养基。
5.细胞传代：当细胞生长到一定密度时，可以进行传代。
用胰蛋白酶消化细胞并离心收集，加入适量培养基制成细胞悬液，按比例接种到新的培养瓶中。
6.实验记录：在整个实验过程中，需要对细胞的生长情况、形态学变化等进行详细记录。
同时，需要定期拍照记录细胞的生长情况。
7.结果分析：通过对细胞的生长情况、形态学变化等进行观察和分析，可以得出有关细胞生物学特性的结论。
四、实验结果及数据分析1.实验结果（请在此插入不同时间点的细胞生长照片）通过观察和记录细胞的生长情况，我们发现原代细胞在接种后的前几天内处于适应期，细胞数量增长较慢。
随后，细胞数量开始加速增长，并逐渐形成集落。
传代后，细胞的生长速度又逐渐减缓，但仍然保持稳定增长。
细胞活性检测方法有哪些？
细胞活性是判断体外培养细胞在某些条件下是否能正常生长的重要指标,如药物处理、放射性或紫外线照射、培养条件变化等。
目前常用的方法有很多,如有台盼蓝染色法、克隆(集落)形成法、H放射性同位素掺入法、MTT法等。
本文总结了一些常用的细胞活性检测方法的原理、特点，并对比了各自的优缺点。
一、染色计数法1. 化学染色法染色计数法是细胞培养中检查细胞死活最常用的方法，直接利用死细胞和活细胞对染料的不同亲和力，检查细胞活性，能在光学显微镜下观察到染色结果。
可分为两类：死细胞着色法和活细胞着色法。
使死细胞着色的常用染料有台盼蓝、苯胺黑、伊红Y。
能使活细胞着色的常用染料有结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝等。
其中最常用的是台盼蓝染色法。
细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能阻止染料进入细胞内，故可以鉴别死细胞与活细胞。
通过细胞计数可得出细胞的存活率。
本染色法方便实用，价格低廉，操作简单。
但是台盼蓝染色时，时间不宜过长，否则部分活细胞也会着色，会干扰计数。
而且，细胞没有经过固定，形态不清晰。
2. 荧光染色法一些荧光染料对死细胞和活细胞也有不同的作用效果，利用荧光显微镜检测细胞活性。
如碘化丙啶（PI），被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡细胞的细胞膜，因此活细胞不被染料上色，只有死细胞或凋亡细胞才能被染上红色。
吖啶橙（AO）能透过质膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA，使之发出明亮的绿色荧光。
溴乙锭（EB）仅能透过胞膜受损的细胞，嵌入核DNA，发橘红色荧光。
也可应用AO-EB双染法鉴定细胞死活。
这种检测方法相比传统的染料，具有灵敏度高，操作简便，结果容易分辨等特点，而且利用双染法还可以分辨活细胞、凋亡早期细胞、凋亡晚期细胞、死亡细胞。
在细胞凋亡的检测上有很广泛的应用。
缺点在于，要求特殊的仪器进行检测，如荧光显微镜、激光扫描共聚焦显微镜或流式细胞仪。
而且通过荧光染料具有毒性，操作时需要带手套。
癌细胞集落实验步骤
癌细胞集落实验步骤
癌细胞集落实验是一种检测癌细胞生长能力和抗性的实验方法，其步骤如下：
1. 收集对数生长期的HL-60细胞，按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300~1000活细胞/ml的细胞悬液。
2. 取两个培养瓶，每个瓶中加9ml调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1ml 3%琼脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速混匀。
3. 用微量加样器吸取140μl二甲基亚砜（DMSO），加入一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。
4. 取一个16mm多孔培养板，每孔加1ml（35mm培养皿需加2ml）细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。
5. 在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。
6. 然后将培养板或平皿移至CO₂培养箱中37℃进行培养。
7. 培养7-10天，肉眼观察并计数细胞集落。
实验结果以肉眼可见的细胞团（含500个以上细胞）作为计数集落的标准。
癌细胞集落实验可以帮助研究人员了解癌细胞的生长和扩散能力，为癌症治疗提供指导。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
细胞活力检测
细胞活力检测在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力（cell viability）。
细胞活力测定方法有MTT法、克隆（集落）形成法、台盼蓝染色法、3H放射性同位素掺入法等。
其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。
但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。
为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如CCK-8（WST-8）、XTT等。
MTTMTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
也可以用DMSO来溶解。
MTT粉末和配置好的溶液都需要用铝箔纸包好避光保存。
实验的时候尽量关闭超净台上的日光灯进行避光操作。
步骤如下：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞的密度接种到96孔板中，每孔体积200ul.2：培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul. 继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。
细胞生物学实验Hela细胞培养
3、酚红：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。酚红在无血清培养基时 可能带来细胞内外钠/钾失衡，影响细胞生长，这种作用在有血清培养时能被血清 中和或减轻。
底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长 基质），这些带正电荷糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细 胞再附着在吸附有促贴壁因子的底物上。 高级培养瓶多涂有生长基质以帮助细胞贴附。
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞贴壁的基本过程
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞的营养需要：特定的培养基和添加剂 细胞的生存环境： 温度: 37 ℃； CO2 、O2 ； pH: 7.2-7.4；渗透压；适宜的湿度 无化学和生物污染、无毒害
CO2: 5% －10％ 缓冲体系： CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3HEPES
细胞生物学实验Hela细胞培养
一般说来，含5％血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死， 但支持细胞生长一般需要10％的血清。对于血清支持细胞生长的生物 学效应已得到证明，但血清中的复杂成分至今尚未完全研究清楚。血 清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长的抑制因子或毒 性因子，因此含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞 和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调 控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。
细胞生物学实验Hela细胞培养
细胞培养所需要的溶液
添加剂：
实习二电离辐射细胞存活克隆实验结果分析-北京大学医学部课程中心
放射生物学实习二细胞克隆（集落）形成法评估电离辐射细胞增殖性死亡一、目的要求目的：了解细胞克隆（集落）形成法检测细胞存活能力的方法，熟悉细胞存活分数（SF, survival fraction, in unit of %）与受照剂量（D, dose, in unit of Gy）之间剂量－效应的关系，熟悉与细胞存活剂量效应模型曲线结果处理有关的软件及使用方法，掌握细胞存活模型曲线的绘制及重要参数的计算。
要求：1，计算细胞接种效率(PE, planting efficiency)；2，应用SPSS 软件测算单击多靶模型下细胞存活曲线的n、k估计值，评价模型曲线的拟合优度；3，根据n、k估计值进一步计算D0、Dq和D37等参数，以及某一化学增敏剂或处理因素的增敏比(SER, sensitive enhancing ratio)；4，利用EXCEL软件绘制细胞存活剂量效应的模型曲线。
二、实验原理放射生物学中细胞受电离辐射照射后，受照细胞既可以呈现即刻死亡，也可能延迟一段时间后才表现出死亡，即增殖环节出现的细胞死亡。
这是因为有些受照细胞形态上仍然保持细胞结构的完整，同时细胞还具有制造蛋白质、合成DNA，甚至再经历一次或数次细胞的有丝分裂，但最终还是发生了细胞的变性死亡,这种并不立即表现出死亡的部分就称为细胞增殖性死亡。
细胞增殖性死亡是放射生物学研究中最具特色的一类细胞死亡。
细胞增殖性死亡与细胞凋亡是两个不同的概念，有关细胞增殖性死亡的分子生物学机制目前尚未完全清楚。
一般而言, 细胞增殖性死亡是不能经MTT实验、LDH漏出实验、或台盼蓝拒染法等加以检测。
放射生物学上，人们通常采用细胞克隆（集落）形成试验来检测经电离辐射照射后，细胞在克隆性细胞增殖能力上的变化。
一个存活的细胞克隆（集落）代表的是电离辐射细胞经一段时间（大约10天）培养后，由独立分散的单个健在细胞直接分裂、增殖，尔后形成具一定细胞数量的群体（通常含50个以上细胞）。
细胞集落形成及其调控机制研究
细胞集落形成及其调控机制研究细胞集落在生命科学领域中，是一个令人着迷的研究课题。
一个简单的细胞集落，就是由若干个细胞聚集在一起组成的微小物体。
这种结构可以是动物的组织，也可以是细菌的生长群体。
近年来越来越多的研究表明，细胞集落对生命的许多方面都具有非同寻常的影响，这些方面包括细胞进化、疾病诊断和药物研发等等。
细胞集落的形成通常取决于化学信号分子的活化作用，这些分子可以吸引或排斥细胞，从而引导细胞聚集在一起。
更为重要的是，这些信号分子的分子浓度、分布模式以及信号作用时间等调控因素也会对细胞集落的形成和演化产生重要的影响。
近年来，生命科学领域的研究者在探索细胞集落形成及其调控机制方面取得了突破性的进展。
以下将从从单细胞悬浮状态到细胞集落形成的不同阶段进行介绍。
1. 细胞悬浮状态当细胞处于单独的悬浮状态时，它们通常会沿着随机路径移动，并且方向和速度都随机变化。
在此状态下，细胞有时会成团聚集在一起，但这些团簇通常不稳定，很快就分散开来。
因此，在这种状态下，细胞集落的形成几乎是不可能的。
2. 细胞聚集状态当细胞之间存在适当的吸引力时，它们会开始聚集在一起，形成一个名为细胞聚集体的结构。
细胞聚集体是一种稳定的、非规则形状的物体，在这个物体中，细胞之间的力学作用开始影响结构。
随着细胞密度的增大，细胞聚集体就会逐渐变得更加紧密。
这个过程是非常重要的，因为在这个阶段细胞聚集体内的信号分子可以开始在细胞之间传递，从而进一步改变聚集体的特性。
3. 细胞集落状态如果信号分子的浓度足够高，聚集体就能够进一步向增大、形成完整的细胞集落。
在这个状态下，信号分子的扩散呈现出斑块状，从而在空间上演化成为非均相的分布。
这意味着细胞之间的相互作用发生了根本性的变化，从而进一步改变了细胞聚集体和细胞集落的结构。
在以上三个阶段中，信号分子在细胞集落的形成和演化中起着关键作用。
因此，如何准确地控制信号分子在细胞聚集体和细胞集落内的传递，是一个非常重要的问题。
克隆形成实验
克隆形成实验
克隆形成实验（Clone Formation Assay）是一种常用的体外细胞生物学实验方法，主要用于评估单个细胞的增殖能力和独立生存能力。
在这个实验中，通常将单个细胞或极低密度的细胞接种到培养皿中，并在适宜的条件下培养一段时间（例如几周）。
在此期间，能够生长和分裂的细胞会逐渐形成一个由大量同源细胞组成的集落，这个集落就被称为“克隆”。
实验步骤主要包括：
1. 细胞准备：选择待测细胞并进行适当的处理，如标记、药物处理等。
2. 稀释与接种：将细胞以极低浓度（通常是单细胞/孔）接种到平板上，确保每个孔内只有一个细胞或者极少数几个细胞。
3. 培养：在恒温、恒湿及无菌条件下培养细胞一段时间，让它们贴壁并开始增殖。
4. 观察与计数：经过足够长时间后（一般认为当克隆包含50个以上细胞时可视作有效克隆），使用显微镜观察并记录形成克隆的细胞数量。
5. 计算克隆形成率：根据形成克隆的孔数除以总的接种孔数，再乘以100%，得到的就是克隆形成率（Clone Formation Efficiency, CFE），它反映了细胞群体中具有独立生存与增殖能力的细胞比例。
通过克隆形成实验，可以研究细胞增殖特性、检测细胞毒性、评价细胞转化状态（正常细胞与肿瘤细胞的差异）、鉴定干细胞活性等多种生物学问题。
此外，在药物筛选和辐射损伤修复等领域也有广泛应用。
红细胞集落形成单位
红细胞集落形成单位红细胞集落是指一群红细胞紧密地聚集在一起形成的单位。
红细胞集落的形成是由于红细胞在血液中的特殊性质和相互作用所导致的。
红细胞集落的形成单位可以是单个红细胞或者多个红细胞的聚集体。
红细胞集落的形成单位可以是单个红细胞。
在血液中，红细胞通过细胞膜上的黏附分子相互作用而聚集在一起。
当红细胞表面的黏附分子与其他红细胞表面的黏附分子结合时，红细胞之间会产生相互吸引的力，使它们紧密地聚集在一起形成红细胞集落。
这种形成单位的红细胞集落通常称为单一红细胞集落。
红细胞集落的形成单位也可以是多个红细胞的聚集体。
在某些情况下，多个红细胞会聚集在一起形成一个更大的集落。
这种形成单位的红细胞集落通常称为多红细胞集落。
多红细胞集落的形成可以是由于红细胞表面的黏附分子与其他红细胞表面的黏附分子结合，也可以是由于其他因素的作用，例如血液流动的力学效应或细胞间的相互作用力。
红细胞集落的形成单位不仅受到红细胞本身的特性影响，还受到环境因素的影响。
例如，血液中的温度、pH值、离子浓度和蛋白质浓度等都可以影响红细胞集落的形成。
此外，某些疾病和疾病状态也可以影响红细胞集落的形成，例如血液循环障碍、红细胞异常等。
红细胞集落的形成单位对于维持正常的血液功能非常重要。
红细胞集落的形成可以增加红细胞在血液中的表面积，提高氧气和二氧化碳的交换效率。
此外，红细胞集落的形成还可以增加红细胞之间的相互作用力，从而增强红细胞在血液中的流动性和稳定性。
红细胞集落是由红细胞在血液中的特殊性质和相互作用所导致的。
红细胞集落的形成单位可以是单个红细胞或者多个红细胞的聚集体。
红细胞集落的形成受到红细胞本身特性和环境因素的影响。
红细胞集落的形成单位对于维持正常的血液功能非常重要，可以提高氧气和二氧化碳的交换效率，增强红细胞在血液中的流动性和稳定性。
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非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%
（一）原理
细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品
1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径 60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径 60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置 37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
利用
琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。
肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。
造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。
（1）同上（1）~（3）步骤。
（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和 37℃左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在40℃均匀混合，加入培养皿（直径 60mm ）中，每皿含%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。
（4）制备上层琼脂,取 37℃不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液移入小烧杯中，加入 40℃、5%琼脂等体积混匀，即成%半固体琼脂培养基。
配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。
37℃、5%CO2静置培养2-3周。
（四）实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100
（五）注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。
故琼脂高压灭菌( 10磅 15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过 40℃，以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。
但初代培养细胞和有限细胞系仅为~5%,甚至为零。
为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。