免疫组织化学
免疫组织化学染色 知识点
免疫组织化学染色知识点摘要：一、免疫组织化学染色的概念二、免疫组织化学染色的原理三、免疫组织化学染色的方法四、免疫组织化学染色的应用五、免疫组织化学染色的优缺点正文：免疫组织化学染色是一种将免疫学原理应用于组织学的方法，通过化学反应使组织中的抗原与抗体结合，从而检测特定抗原在组织中的分布和表达情况。
该技术广泛应用于生物学、医学等领域，对疾病诊断、研究及治疗具有重要意义。
免疫组织化学染色的原理是利用抗原与抗体之间的特异性结合反应。
首先，通过化学或物理方法暴露组织中的抗原，然后用特异性抗体与抗原结合，最后通过显色反应检测结合情况。
常用的显色方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光染色法等。
免疫组织化学染色方法包括以下几个步骤：1.组织处理：固定、脱水、透明、浸蜡等；2.抗原修复：去除组织中的封闭抗原，暴露目标抗原；3.免疫染色：用特异性抗体与抗原结合；4.显色：检测抗体与抗原结合后的显色反应；5.观察和分析：通过显微镜观察染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况。
免疫组织化学染色技术在生物学和医学领域具有广泛应用：1.疾病诊断：通过检测特定抗原的表达，辅助诊断疾病，如肿瘤、炎症等；2.疾病研究：研究抗原在疾病发生和发展过程中的作用机制；3.药物研发：检测药物对特定抗原的影响，评估药物疗效；4.肿瘤分期和预后评估：通过检测肿瘤组织中抗原的表达情况，评估肿瘤分期和预后。
免疫组织化学染色技术具有以下优缺点：优点：1.高敏感性：能够检测微量抗原；2.高特异性：特异性抗体与抗原结合，减少交叉反应；3.定位准确：显示抗原在组织中的分布和表达情况；4.易于操作：方法简单，仪器设备要求较低。
免疫组织化学实验流程
免疫组织化学实验流程免疫组织化学实验是一种利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过标记的抗体来定位抗原的生物学技术。
以下是免疫组织化学实验的基本流程：一、实验准备组织样本处理：获取的组织样本需要经过固定、脱水、透明和浸蜡等处理步骤，以便于切片和后续的免疫组织化学实验。
抗体选择：根据实验目的选择相应的抗体，确保抗体的特异性高、亲和力强，并且与抗原的结合效果好。
实验试剂准备：准备好免疫组织化学实验所需的抗体、二抗、底物、DAB染色剂等试剂，确保试剂的质量和有效性。
二、切片制作将经过处理的组织样本切成薄片，厚度一般为3-5微米。
将切片放置在载玻片上，用滤纸吸去多余的蜡滴。
在切片上滴加适量的抗体，使其与抗原充分结合。
三、免疫组织化学染色在切片上加入适量的二抗，与一抗结合，形成抗原-抗体复合物。
加入底物溶液，使其与抗原-抗体复合物反应，生成有色产物。
用DAB染色剂对有色产物进行染色，使其呈现明显的颜色。
四、观察与记录在显微镜下观察染色结果，根据抗原的分布和染色强度进行记录。
可以使用图像分析系统对染色结果进行定量分析，进一步了解抗原的表达情况。
五、结果分析根据染色结果，分析抗原在组织中的分布和表达情况，与正常组织进行比较，判断其与疾病的关系。
将结果与其他实验室指标相结合，进行综合分析，为临床诊断和治疗提供依据。
需要注意的是，免疫组织化学实验的结果受到多种因素的影响，如抗体的质量、抗原的特异性、组织处理的方法等。
因此，在进行实验时需要严格控制实验条件，确保实验结果的准确性和可靠性。
同时，对于结果的解读需要结合临床背景和实验室其他指标进行综合分析，避免出现误判或漏诊的情况。
免疫组织化学
免疫荧光组织化学染色方法 1.直接法：简便、快速，用特异性标记荧光 的一抗与组织细胞内抗原结合。 操作流程：(1)冰冻切片经固定，凉干PBS洗； 石蜡切片脱蜡至水，消化30min，PBS洗。
(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上， 湿盒内37℃温育1h，PBS洗3×3min。 (3)0.01%伊文氏蓝衬染1～3min，PBS洗 3×3min，蒸馏水洗2次，除去NaCl结晶。 (4)pH9.0甘油缓冲液〔磷酸盐〕封片。 〔必需无自发荧光，无色透亮 〕
▪ 2、扛酶抗体：抗体与酶的结合为抗原抗体 反响，避开了共价结合，爱护了酶和抗体 的活性。
标记酶选择标准：
★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被 光镜或电镜观看。
★ 酶反响产物须稳定，不集中，具有 良好定位。
★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。
标本的固定与保存
好的固定剂除能满足一般组织学固定目 的外，还需要： 〔1〕能快速固定抗原 〔2〕防止抗原物质集中 〔3〕固定后的抗原能被抗体识别，不影响 抗原抗体反响
▪ 常用：10%福尔马林〔酸性〕、乙醇、丙酮、 甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛
▪ 混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘 酸-赖氨酸-多聚甲醛〔PLP〕固定液
免疫组织化学
把握内容
▪ 免疫组化的根本原理 ▪ 免疫组化的根本过程 ▪ 免疫组化的染色技术分类 ▪ 常用的免疫组化的染色原理和方法 ▪ 留意事项
免疫组织化学的根本概念 Immunohistochemistry 又称免疫细胞化学。它是组织化 学的分支，它是用免疫学原理〔特 异的抗原抗体反响〕来对组织内抗 原〔或抗体〕的分布进展原位检测
第13章 免疫组织化学技术(共42张PPT)
免疫胶体铁细胞化学染色 法
胶体铁是一种阳离子胶体，将抗体分子标记上胶体铁，通 过普鲁蓝反应呈色，胶体铁颗粒有一定大小，还具有一 定电子密度，可用在电镜和光镜水平的抗原定位研究。
酶免疫电镜技术
酶免疫电镜技术是利用酶的高效率的催化作用对其底物 的反应形成不同的电子密度，借助于电子显微镜观察 ，证明酶的存在，从而对抗原进行定位。
LSCM 应用广泛
细胞器研究-籍特异性荧光探 针。图像清晰，可动态观察 活细胞
罗丹明123染细胞线粒体
鬼笔环肽染涡虫纲扁虫肌动蛋白丝
肿瘤细胞间通讯研究
检测人类癌细胞表皮生长因子
Y
Y
Z
Z
X
X
焦平面（水平面或xy切面）及沿光轴（垂直平面或xz切面）光学切面模式图
分层扫描、光学切片
细胞测量
细胞“CT”片
四、链霉亲合素-生物素法 (LSAB）
链霉亲合素(Streptavidin SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯 蛋白，不含糖基，有4个生 物素结合位点，并且具有高度的亲 和力，其功能类似亲合素。
利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲合素蛋白就组合成酶标链霉亲合 素-生物素方法
第五节 免疫电镜技术
一、免疫标记电镜技术的原理
原理：是以游离的亲合素作为桥联剂，利用亲合素的多价性，将检
测反应体系中抗原、生物素化抗体复合物与标记生物素联结起来 ，达到检测反应分子的目的。 由于生物素化抗体分子上连有多个 生物素，因此，最终形成的抗原-生物素化抗体-亲合素-酶标生物 素复合物可积聚大量的酶分子；加入相应酶作用底物后，即会产 生强烈的酶促反应，从而提高检测的灵敏度。
藤黄微球菌 绿色-活菌 红色-死菌 酶免疫组织化学技术的应用
免疫组化ICH
② 免疫动物或细胞融合（单克隆抗体）
③ 抗体效价检测和抗体纯化
④ 标记抗体
⑤ 细胞和组织切片标本的制备 ⑥ 免疫组织/细胞化学反应和显色 ⑦ 观察和记录结果
抗体(antibody)
多克隆抗体(polyclonal antibody)
纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔） 多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。 特异性不如单克隆抗体好，有时会造成一定的交叉反应，但灵敏度高于后 者。 能广泛用于石蜡包埋组织切片。
2．免疫组织化学的相关理论和技术
2.1
免疫组织化学的工作原理
抗体与其抗原特异性结合
通过化学反应使特异性抗体标记上显示剂，如酶，金属 离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色） 借助光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色 或电子密度等变化，从而确定抗原在组织、细胞内的定 位和含量。
2.2 免疫组织化学的全过程包括：
亲和免疫组化
葡萄球菌蛋白A（SPA法）：用SPA代替桥抗体 卵白素－生物素过氧化物酶复合物法 (Avidin
ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一
Biotin-peroxidase Complex, ABC) 生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合， 形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成
常用的免疫酶（染色）方法
免疫酶标法
非酶标法：PAP法
PAP法主要染色原理 ： 用第二抗体作“桥梁”， 既与第一抗体结合，再与PAP 复合物联接，最后用底物显色 剂显色。
抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制， 但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持 一定比例。 在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因 此不能出现肉眼可见的反应。 （BIG BEE现象）
第12章免疫组织化学技术
抗原的保存与修复
酶消化法
盐酸水解法 高压锅法
常用的抗原 暴露、修复
方法
微波法 煮沸法
抗体的处理与保存
抗体的选择： 应注意选择具有高度特异和稳定的抗体，根据需要决定采用 单克隆或多克隆抗体。 抗体的稀释： 抗原抗体反应要求有合适的比例，过量或不足均不能达到预 期结果。 抗体的保存 ： 在保存抗体时，要特别注意保持抗体的生物活性，防止抗体 蛋白质变性。
酶标记抗体免疫组织化学染色
直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内 相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最 后用酶底物显色。
间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异 性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再 用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合 ，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色 。
临床免疫学与免疫学检验
第十二章 免疫组织化学技术
免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又 称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞 原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原 进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。
根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为：
第四节 免疫标记电镜技术
原理
利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等 ）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密 度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应 中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的 技术。
相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位 ，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定 位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等 方面有其独特的优点。
免疫组织化学技术
复
染
根据所用的底物溶液而选择复染液
DAB 有色终末产物不溶于酒精和有机溶剂， 可用醇性染料复染、脱水，有机溶剂透明和封 固。复染过程：a、漂洗切片以除去未反应的 底物；b、Harris苏木素复染；c、流水洗涤； d、1%盐酸酒精分化；e、流水冲洗，温水蓝 化；f、梯度酒精脱水；g、二甲苯透明；h、 中性树胶封固。
显色物标记的抗体检测组织或细胞内的抗 原，用于疾病的诊断或研究。
新鲜组织的冻存 新鲜组织离体后应及时冻存，如需送至其他 实验室冻存可先置于4℃生理盐水中，但时 间不宜超2～6过小时。制备冻块的原则是 低温及速冻。速冻的目的是使抗原迅速固定 和防止冰晶形成，冰晶形成将破坏细胞结构。 低温速冻的方法有：丙酮–干冰法、液氮法。
10%中性缓冲福尔马林液
40%甲醛10ml，0.01mol/L pH7.4的 PBS90ml
影响固定的因素
固定时间 固定时间过短将影响抗原的固定 和细胞形态，过长能引起抗原遮盖或抗原 变性，因而要选择一合适的固定时间。
固定温度 一般固定剂的固定作用随温度升 高而加强，固定的温度以室温最为常用。
冰冻切片 石蜡切片
免疫组织化学染色
内源性酶和内源性生物素的阻断 内源性过氧化物酶主要见于红细胞的血红 蛋白，中性粒细胞内的髓过氧化物酶及单 核细胞，嗜酸性细胞和组织内的过氧化物 酶。 阻断剂：3% H2O2–甲醇液，10～15分 钟
内源性碱性磷酸酶
内源性碱性磷酸酶主要见于中性粒细胞和内
热诱导的抗原修复应注意的问题：
热处理后应注意自然冷却。 热处理液不要让其煮干。 不要任何抗原的检测都使用该方法。 一批抗原的检测其温度和时间一定保持一致。 形态学结构的改变：一般经高温修复后胞浆无明显的破 坏，而对细胞核的影响较大，会出现核破裂，苏木素淡 染等现象。而经酶水解的切片，其细胞浆破坏要视消化 时间而异，但核的破坏较轻。
免疫组化的定义
第四篇免疫组织化学一、免疫组织化学的定义：（一）什么叫免疫组织化学？简单地说，用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体，根据其结合后经一系列方法的处理，呈色反应，在光镜下确定组织的来源属性和部位。
目前免疫组织化学作为病理诊断，鉴别特殊病例，是不可缺少的最重要的手段，国内在免疫组织化学的应用方面已经普遍地展开并扩展至基层单位，为病理事业做出应有的贡献。
抗原（抗原，AG）它是一类可以刺激机体的免疫系统并促进其发生免疫应答，与免疫应答产物即抗体和效应细胞，在体内或体外发生特异性结合的物质。
1）抗原的性质①异物性。
它是抗原所具有的特性，机体对进入体内的某些异物，异体大分子物质可产生免疫应答。
目前生物制剂公司利用这一原理生产出许多适合于临床诊断的抗体。
但是，并非所有的异物都是抗原。
例如矽尘等一些生物性高分子聚合物，它们不会刺激机体的免疫系统产生相应的抗体物质，而只是肺对吸入的矿物性和有机粉尘的非肿瘤性反应[1]。
矽肺是肺吸入矽颗粒沉积的结果，也是机体对另一种外来物反应的结果。
②理化性状。
凡具有抗原性的物质，其分子越大，它的免疫原性就越强。
具有抗原性的物质，其分子量都较大，起码在一万以上，抗原分子量越大，其相应的表面积也越大，接触、碰撞免疫细胞的机会就增多，这犹如一颗大树，根深叶茂，占据着大片空间，不易被风刮跑。
抗原性物质由于分子量大，盘踞着较大地方，在体内存留着一定的时间，时间越长，其对机体的刺激作用就越强。
③特异性。
各类抗原物质结构繁琐，组成的化学结构也很复杂，但是能够刺激机体并与抗体发生结合反应的化学组成，仅仅是抗原物质表面的一些具有活性的化学基团，化学结构及空间构型，称为抗原决定簇。
即一种抗体只能与相应的抗原起反应而不能与其它的抗原起反应[2]，这就是抗原的特异性，称之为特异性抗原。
虽然如此，特异性抗原也只是相对的，因为人们希望这种特异性抗原只存在于某种细胞及结构而不存在于其它细胞及结构的特有抗原[3]，但至今为止，仅发现较为狭小范围的特异性抗原，如前列腺特异抗原（Prostatespecific 抗原,PSA）,它是由前列腺上皮细胞合成的一种糖蛋白，目前认为是具有特异性的肿瘤标记物之一，它可以用于前列腺癌和转移性前列腺癌的诊断，但不能用于同源的前列腺肿瘤的良恶性诊断，因为它还不是非常特异性的抗原，前列腺增生的上皮也可以呈阳性反应。
【检验医学】免疫组织化学技术
各种抗原的固定
抗原 蛋白质 微生物 病毒外壳 多糖 黏液物质 类脂质
固定剂或处理方法 乙醇、甲醇 丙酮、三氯化碳 胰蛋白酶 10%甲醛或微火加热 透明质酸酶 乙醚、丙酮
二、抗 原 的 保 存 与 修 复
➢ 抗原修复:使在制片过程中被遮蔽的组织抗原决定簇重新暴露的过程。
四、结 果 判 断
➢ 对照实验： 阳性对照：选择含已有抗原的标本(证明整个显色程序正确，尤其待检标本呈 阴性结果时更为重要） 阴性对照：选择不含已知抗原的标本（排除假阳性）
➢ 确证实验： 空白实验：PBS（排除内源性酶） 替代试验：与待测抗原的同种动物非免疫血清（证明阳性反应不是由异嗜性抗 原引起的非特异性反应） 吸收或阻断试验：用过量已知抗原（可溶性）与特异性抗体反应，已知阳性的 标本应呈阴性或弱阳性（证明免疫组化的阳性结果是与天然抗原相同的抗原 抗体反应。）
第十二章 免疫组织化学技术
概念
免 疫 组 织 化 学 技 术 （ immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特 异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化 学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测 定的一项免疫检测方法。
第一节 免疫组织化学技术概述
根据标记物的不同分类： 荧光免疫组织化学技术 酶免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫电镜组织化学技术
第一节 免疫组织化学技术概述
免疫组织化学的基本过程包括：
1.抗原的提取与纯化； 2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及
抗体的纯化； 3.将标记物与抗体结合形成标记抗体； 4.标本的处理与制备； 5.抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应； 6.观察结果。
免疫组织化学
免疫组织化学简介免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。
主要过程免疫组织化学的全过程包括：1.抗原的提取与纯化；2.免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；3.将显色剂与抗体结合形成标记抗体；4.标本的相关操作免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
免疫组化技术近年来得到迅速发展。
50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为实用的免疫酶技术。
仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。
2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。
b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
免疫组织化学
免疫组织化学
免疫组织化学是利用免疫反应的原理，采用免疫和组织化学定向技术，根据器官组织的生理病理活动和病理特征，运用特异性抗体分析组织病理变化，从而为解决器官疾病提供内在检测与决策，起到诊断、预后、潜在因素及靶点药物研发等的重要作用。
免疫组织化学主要使用免疫细胞荧光原位杂交技术和免疫组织染色技术，以部分特异性抗体来特异性结合细胞内特异性蛋白质，指出组织病理变化。
抗体可以搭配细胞进行切片扫描，通过细胞真实图像，用细胞色素和抗原结合结构，获得细胞内抗原蛋白质定位准确、低剂量精度高的有效数据，并可以在细胞外和细胞内实现抗原表位的检测，病变程度的评估及细胞的密度分布的快速统计，以解决细胞死亡等影响检测精度的因素，实现内在参数分析。
免疫组织化学除了可以有效检测器官疾病，还能够检测微小病变和早期疾病，研究证实，由于免疫细胞荧光原位杂交技术和免疫组织染色技术的增强抑制特性，an疾病变得早期检测率可达90%，而传统检测方法则仅30%，故有免疫组织化学作为临床医学诊断技术应用得到充分肯定。
总之，免疫组织化学为临床提供了一种更精确的和有效的疾病诊断技术，在器官疾病的检测诊断中，可以按现有病理特征快速定位及统计，而其它辅助检测方法也让免疫组织化学术语更加全面，更有利于精确明确病变，准确预测疾病的发展趋势，以更高的准确率进行精准治疗并有效预防疾病的发作。
组织化学技术5-免疫组化
前言
免疫组织化学（Immunohistochemistry） 又称免疫细胞化学。它 是组织化学的分支， 它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织 内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原 位检测技术。
1．发展简史
——1941年 Coons 首先用荧光素标记抗体—检 测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。 —— 60年代 Nakane建立酶标抗体技术——铁
例 阳对 阴对 替对 实组 号 性照 性照 代照 验 1 2 3 4 5 6 7 － + + － + + + － + + － － － － － + － － + － － － + ± + + － －
结 论 操错 作误 非异反 特性应 阴 对 含 位Ag 性照定 阴对不定 性 照 含 位Ag 受组非异染 检织特性色 受组不定 检 织 含 位Ag 受 组 含 位Ag 检织定
一、免疫组织化学技术
（一）染色方法
1．直接法 荧光素直接标记特异性抗体（—抗） 上，标记抗体与抗原结合（在切片上）
荧光显微镜下观察→检测抗原。
△ 酶标抗体要显强。 缺点：灵敏度低，所需抗体量大（不经济）。 应用：基本不用了！！
2．间接法 荧光素标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动 物的 IgG抗体）。※显色后镜检 特点：较直接法灵敏，可标记一种抗体→ 鉴定多种抗原。
※ 该法是ABC法基础上的进一步改良，使卵白
素与链霉（而非生物素）结合，而后再结 合PO 。 它有4个亚基可与生物素结合，灵敏特异， 背景低，成本低。
现在还有plus盒。优点是：更简便，放大 倍数↑，等电点中性更适合组织。分子量小， 穿透力↑，原理保密。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
免疫组织化学的定义
免疫组织化学的定义
免疫组织化学，简称免疫组化，是病理诊断中的一种检测方法。
它应用免疫学的基本原理，即抗原抗体反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来确定组织细胞内的抗原，并对这些抗原进行定位、定性及相对定量的研究。
免疫组织化学技术具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优点，被广泛应用于临床病理诊断、法医学鉴定以及生物学和医学基础研究等领域。
在病理诊断中，免疫组织化学技术主要用于协助疾病的诊断和鉴别诊断。
例如，对于肺癌，通过免疫组化可以检测到癌细胞是否表达某些特定的肿瘤标志物，从而帮助医生判断肺癌的类型和恶性程度。
同时，免疫组化技术还可以用于判断肿瘤的来源，例如通过检测癌细胞表面的某些糖蛋白或糖脂来鉴别肿瘤是来自消化系统还是泌尿系统。
在法医学鉴定中，免疫组织化学技术常用于检测生物样本中的毒品、药物等物质，以协助司法机关进行犯罪调查和审判。
此外，免疫组织化学技术还被广泛应用于生物学和医学基础研究中，例如研究细胞生长、发育、分化等过程中的基因表达和调控机制，以及研究肿瘤发生、发展过程中的基因变异和信号转导机制等。
总之，免疫组织化学技术在医学领域中发挥着重要作用，为疾病诊断和治疗提供了重要的依据和支持。
免 疫 组 织 化 学
发色团：Fast Blue
Fast Red BCIP/NBT
血细胞、淋巴细胞 内源性过氧化酶含量较高 可选用ALP/AP
二、染色步骤及原理
间接法：
1. 石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水;
2. 未固定的冰冻切片，丙酮固定 20～30 min， 风干15～30min;
3. 用0.03%H2O2处理切片15～30 min(室温)，
细胞数量少：离心沉淀涂片
● 培养细胞 直接收集
培养液离心涂片
（二）组织标本的取材 ◆ 活检钳的刀口必须锋利，以免组织受 挤压 ◆ 取材部位必须是主要病变区 ◆ 必须取病灶与正常组织交界处 ◆ 必要时取远离病灶区的正常组织作对 照
新鲜组织 ♥ 冰冻切片 ♥ 液氮保存
♥ -70℃冰箱
二、固定 固定剂：常用醛类固定剂
多抗？单抗？ 抗原表位的丰富程度 也可应用多个单抗 （a cocktail of monoclonal antibodies）
解决抗原表位少的问题
二、免疫染色 一般程序： ● 标记抗体与标本中的抗原反应结合 ● 用PBS洗去未结合的部分
● 直接观察结果（免疫荧光）或显色
后再用显微镜观察（免疫酶）
免疫组织化学技术的突出优点： ● 高度的特异性 ● 敏感性高
● 方法步骤统一
● 机能和代谢密切结合， 定性、定位、定量的统一
免疫组织化学技术在细胞、染色 体或亚细胞水平原位检测抗原分子， 是其它任何生物技术难以达到和代替 的。它能在细胞、基因和分子水平同 时原位显示基因及其表达产物，形成 了新的检测系统，为生物学、医学和 各个领域分子水平的研究与诊断，开 拓了广阔的前景。
protein, SPA）是一种从金黄色葡萄球
菌细胞壁分离的蛋白质。
免疫组织化学技术的特点
免疫组织化学技术的特点免疫组织化学技术是一种在生物学和医学领域中广泛应用的重要方法，它能够在细胞和组织水平上对特定蛋白质、抗原等生物分子进行定位、定性和定量分析。
这项技术具有许多独特的特点，为疾病的诊断、治疗和科学研究提供了有力的支持。
一、高特异性免疫组织化学技术的核心在于抗体与抗原的特异性结合。
所使用的抗体是针对特定抗原表位设计和制备的，因此能够高度特异性地识别和结合目标抗原。
这意味着在复杂的细胞和组织环境中，该技术可以准确地检测到我们感兴趣的特定分子，而不会与其他相似或无关的分子发生交叉反应。
这种特异性使得免疫组织化学能够在细胞和组织中精准地定位特定的蛋白质、激素、受体等生物标志物，为疾病的诊断和研究提供准确的信息。
例如，在肿瘤诊断中，通过使用针对肿瘤特异性抗原的抗体，可以明确肿瘤细胞的来源和类型，区分良性和恶性肿瘤，以及确定肿瘤的分化程度和侵袭性。
对于神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特定的抗体可以检测到大脑组织中异常积累的蛋白质，如β淀粉样蛋白和tau 蛋白，为疾病的诊断和研究提供重要依据。
二、高灵敏度免疫组织化学技术具有很高的检测灵敏度。
即使目标抗原在样本中的含量很低，通过适当的抗体标记和检测方法，也能够被检测到。
这对于检测微量的生物分子，尤其是在疾病早期或病理变化轻微的情况下，具有重要意义。
现代免疫组织化学技术不断发展和改进，采用了更加灵敏的检测系统，如增强化学发光法、荧光染料标记等，能够进一步提高检测的灵敏度。
同时，优化的样本处理和抗原修复方法也有助于充分暴露抗原，提高检测的准确性和灵敏度。
在临床实践中，高灵敏度的免疫组织化学技术可以帮助早期发现肿瘤的微小转移灶，监测疾病的进展和治疗效果。
在科研领域，它能够检测到细胞内低丰度的蛋白质表达变化，揭示生命活动中的细微调节机制。
三、定位准确免疫组织化学技术能够在细胞和组织的微观结构中准确地定位目标抗原。
通过将抗体与显色剂或荧光标记物结合，可以直观地观察到抗原在细胞内的分布位置，如细胞核、细胞质、细胞膜等。
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免疫组织化学(傅琦博)-免疫组织化学引言酶工程是生物工程的重要组成部分，近几十年来，随着研究手段的更新和技术水平的提高，产生了一门以研究酶在细胞内的存在及其动态，以阐明组织细胞的结构和功能为主要内容的科学——酶组织化学。
酶组织化学是利用酶化学反应的产物可在光学显微镜或电子显微镜下被识别的特性，借以从形态学角度判定酶在组织细胞内的存在的部位的一门技术，其基础是组织化学。
它具有将形态学、生物化学和生理学联系起来的特点，在生物学、生物化学、医学生物领域内日益发挥着重要的作用。
研究组织细胞内特定酶分布的酶组织化学方法大致分为：（1）利用酶的活性反映的方法；（2）利用抗原抗体反应（免疫应答）证实酶的存在部位的方法。
后者也被称之为免疫组织化学。
免疫组织化学概述免疫组织化学简称免疫组化，是应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分，进行原位的定性、定位或定量的研究。
这种技术称为免疫组织化学技术。
免疫组化是利用抗体与抗原的结合具有高度特异性的特点，采用一直的抗体检测组织或细胞的抗原物质，以期确定组织或细胞是否存在未知抗原，并进行定性、定位或定量的研究。
抗原与抗体结合形成的免疫复合物是无色的，故必须借助组织化学方法，将抗体抗原反应部位显示出来。
它的主要研究方法是免疫组织染色法（简称免疫染色法），食用该方法检测细胞内物质，必须具备两个条件：①作为检测对象的物质须具有抗原性，能制作出与之相应的特异、高效价的抗体；②在免疫反应发生之前，目标物质要保持抗原性，同时还要保持在组织细胞内的稳定状态。
要检测抗原，就要用与之相应的抗体进行免疫反应，同时要用可视的标记标出抗原或抗体，采用这种方法的免疫染色法称为标识抗体法或标识抗原法，常用的表示抗体法有直接法、间接法、补体结合法以及多重染色法等。
直接法是标识要检出的抗原的抗体，然后进行反应的方法，其特异性高，但检出的敏感度不如间接法，标识抗体的食用范围手局限。
间接法是以未标识的第一抗体进行反应，接着标识以第一抗体为抗原所制作的抗体（即第二抗体）进行重叠反应，间接的证明抗原，这种方法的缺点是容易出现非特异性反应，但敏感度较高，标识抗体的用途也广；补体结合法是将间接法中的第二抗体作为标识抗补体抗体食用；多重染色法则是在同一标本上检出多种抗原物质的方法，可以用反复进行的重复标记的直接法，也可以用酶标记的重复进行的间接法。
此外，还有后标识抗体的免疫染色法，此法先采用未标识的抗体进行反应，反应结束后，通过免疫化学反应或其他化学反应，用适当的标记物质来识别已与组织细胞内抗原发生结合的抗体。
免疫组织化学技术的发展免疫组织化学技术是形态学研究领域一门新兴方法学。
自它问世以来发展迅猛,用“日新月异”一词形容它毫不过分。
酶标免疫组织化学技术是由Nakane 等人于60 年代末期创立的最早的免疫酶组织化学技术,之后S ternberger 等人于70 年代初期便在此基础上建立了非标记抗体酶法(又称间接法) 和PAP 法(过氧化酶抗过氧化酶法) 。
80 年代初期美籍华人H su 又建立了卵白素生物素复合物法(ABC法) ,自此之后,免疫金银染色法、免疫电镜等技术相继问世。
80 年代末期人们又发现链霉菌抗生物素蛋白(或译成链霉菌亲合素,St reptavidin) 与生物素结合力极强,遂用它标记过氧化酶建立起了SP 法,或称LSAB 法(链霉菌亲合素生物素过氧化酶法) 。
由于链霉菌亲合素不与人组织中的内源性生物素起非特异性结合反应,故背景染色更加清晰,且敏感性比ABC 法高4～8 倍,比PAP 法高8～16 倍。
进入90 年代,免疫组织化学又向基因水平深入发展,与分子生物学技术的结合日益紧密。
如原位杂交后信号的放大与显示便是采用了免疫组织化学显色技术,因而又可称之为原位杂交免疫组织化学技术。
而图象分析、流式细胞仪的运用，是免疫细胞化学定量分析技术提高到更精确的水平。
现就该技术的发展及其应用作一概述。
1 利用免疫荧光标记技术可以分辨出标记抗原抗体所在的位置及其性质, 并可利用荧光定量技术计算抗原(或抗体) 的含量, 以达到对定性、定位、定量测定的目的[2 ]。
如黄祥瑞等人(1999) 利用免疫荧光细胞化学技术研究西藏环状病毒细胞生物学特性和敏感细胞范围(CPE) , 成功地观察到该病毒的细胞病变效应特异荧光发生的部位、细胞数量和病毒的形态发生。
辛德毕斯热是由辛德毕斯病毒Sindbis V irus (SiN ) 引起的人兽共患虫媒病毒病, 1974 年南非发生辛德毕斯热大流行。
1991年梁国栋等通过免疫荧光技术首次从新疆分离到SiN 病毒。
1999 年陈振光等利用间接免疫荧光试验检测到福建宁化林区人群、野兔、狐狸、狗存在SiN 感染,抗体阳性率分别为12. 86%、5. 88%、14. 29%、6. 45%。
因而判定福建宁化林区可能存在辛德毕斯热自然疫源地。
2 抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术(A vidin B io t in 2P eroxidase Comp lex technique, 简称ABC 技术) 是H su 等于1981年创立, 其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
该方法简便、节约时间, 敏感性、特异性高, 背景染色淡。
由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力, 可用于双重或多重免疫染色。
如李月白等采用ABC 法研究发现绒毛层滋养细胞、绒毛中轴的基质细胞、毛细血管的内皮细胞、毛细血管腔内的淋巴细胞以及血岛细胞均表现为P 物质(SP) 受体免疫反应阳性, 阳性物质分布于胞质和胞膜上, 胞核呈阴性反应。
该研究为其对胎盘及胚胎发育的作用提供形态学依据。
张雅萍在ABC 法基础之上改进, 建立了生物素- 抗生物素- 过氧化物酶复合物( sABC) 法, 探讨了IL 28 在甲状腺肿瘤组织中的表达及意义。
3 葡萄球菌蛋白A (Staphylococal P ro tein A , SPA 或SP) 具有免疫特性, 发展成为免疫学上一种极为有用的工具。
其优点是不受种属特异性的限制, 染色时间短、灵敏性高和背景染色淡等。
故在目前各种免疫细胞化学技术中得到广泛的应用。
如肖华亮等[9 ]用此法检测、探讨骨肉瘤M DM 2 和p 53 蛋白定位、表达水平及相互关系和其对骨肉瘤转移及预后的影响。
应用SPA 与胶体金或铁蛋白相结合, 可在电镜水平检查抗原抗体反应的定位。
自Pomano 和Romano (1977) 首次报告用蛋白A -胶体金技术(P ro tein A 2Go ld technique, PGA 技术) 标记细胞表面抗原、包括淋巴细胞、血小板、大鼠肾脏细胞及感染的病毒细胞获得成功以来, SP 法已得到愈来愈广泛的应用, 并发展成为一种较为理想的免疫电镜技术。
4 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法(简称A PAA P 法) 克服了辣根过氧化酶(HRP) 的不足。
沈岩等用A PAA P 法结合单克隆抗体(mA b) KL 21 (广谱抗人细胞角蛋白, 德国) 比较分析不同肿瘤细胞间同种细胞凝集力、靶器官定植力、细胞增殖和细胞凋亡现象、癌基因及肿瘤相关抗原表达等生物学特征。
进一步明确肿瘤细胞相关生物学特性与肿瘤细胞转移能力间的关系。
而链霉素亲和素(St rep tavidin, SA ) 具有高度的亲和力, 利用生物素结合的二抗与酶标记的SA 亲和(L SAB 法) 是免疫组化中非常有用的方法。
沈靖南等采用该法, 检测84 例骨肉瘤中p2糖蛋白(p 2g p ) 表达, 半定量化计量p2gp 的着色强度及阳性率, 通过多因素相关分析和生存分析, 探讨骨肉瘤预后的相关因素和高危因素, 研究骨肉瘤多药耐药性的表达与预后, 并证实p2gp 介导骨肉瘤的MDR 现象, 明确p2gp 表达与肺转移的关系。
5 凝集素( (Phytoagglut in, PHA ) 作为一种探针研究细胞膜上特定的糖基, 具有多价结合能力。
直接将标记物标记在凝集素上, 再与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合, 该法简便, 但灵敏性不够高。
经研究发现将凝集素直接与切片中的相应糖基结合, 可提高敏感性高5～10 倍或更多一些, 有人认为若将凝集素与特定的糖基作成三明治样的糖2凝集素2糖的结合物, 特异性、灵敏度将会更高。
而且能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合, 从而在光镜与ö或电镜水平显示其结合部位。
N e wman 等(1979)以荧光素标记凝集素PHA 实验, 发现在大鼠乳腺上皮的不同分化时期显示不同的荧光强度。
Kivela 和Farkkanen (1987)用凝集素作为细胞特殊类型的标记实验发现, 在人视网膜上PHA 标记视锥细胞而不标记视杆细胞。
在乳腺、乳腺上皮细胞呈PHA 阳性反应, 而肌上皮细胞和间质细胞呈PHA 阴性反应。
他以多种凝集素对小鼠、大鼠和兔的肾组织切片进行染色结果表明, 刀豆素A 和蓖麻素存在于肾脏的各部, PHA 和双花扁豆凝集素(DBA ) 主要分布于远曲小管和集合小管上皮细胞, 荆豆凝集素(U EA ) 主要分布在血管内皮细胞, 而麦芽素分布在肾小球。
St reit 和Kreutzberg (1987)发现Griffonia Simp licifo lia 凝集素能特异性标记面神经节内的小胶质细胞, 而其它类型的胶质细胞如星状胶质细胞(A st ro2cyte) 等都显示阴性反应。
如果在切断面神经后, 增殖的小胶质细胞对Griffonia Simp licifo lia 凝集素的反应加强。
大量研究发现, 凝集素可作为肿瘤组织源性的标记、肿瘤特异性诊断的标志、肿瘤恶性的标记和不同肿瘤的分化标记。
如张华忠等(1987)报道115 例胃癌标记PH A 阳性率高达90. 43% , 而正常胃粘膜基本是阴性, 故认为PHA 是胃癌的诊断性标志。
BSA对乳腺恶性肿瘤阳性率达79% , 而对良性病变均呈阴性反应,提示BSA 可能为乳腺恶性肿瘤的相关标志。
HRP 本身虽含有甘露糖, 能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。
但对其它的凝集素, 需要将糖基化(Glyco sylat ion) 过氧化物酶结合到该凝集素上, 且糖基化过氧化物酶品种尚有限, 故目前本法在应用还有一定困难。
免疫细胞化学技术尚在继续改进和完善中, 除目前国内外已广泛应用的免疫金技术和免疫金银技术外, 新的免疫细胞化学技术不断出现。
1984 年国外学者首次将CRNA 探针应用于原位杂交, 核酸探针为单链的RNA分子, 产生自具有质粒逆转录系统的cDNA 克隆。
在1987 年Wo lf 等建议插入确定长度的寡核苷酸至载体内产生cRNA 分子, 这种cRNA 分子称为“寡核苷酸核酸探针”(o ligo ribo－p robes) , 现在已被广泛的用于原位杂交实验。