磷细菌PB12菌株的选育及培养条件的研究
专业学位硕士研究生课程建设与实践
专业学位硕士研究生课程建设与实践作者：张彩莹柴春月焦朋飞来源：《科技风》2024年第02期摘要：专业学位研究生教育旨在培养具备较强专业能力和职业素养的高层次应用型专门人才，积极探索课程建设是提高人才培养质量的重要途径。
生物工程综合实验是生物与医药专业学位研究生所开设的专业课，在课程建设实践中，通过组建高素质的教学团队，运用OBE教育理念，明确课程建设目标，优化课程教学内容，改革教学方法和课程评价办法，有助于提升专业学位研究生解决实际问题的能力，增强创新实践能力的培养。
关键词：专业学位；硕士研究生；OBE；生物工程综合实验；课程建设我国专业学位研究生教育历经了30多年的飞速发展，能够积极主动地适应国家经济社会发展对高层次应用型专门人才的迫切需要［1］。
国务院学位委员会和教育部于2020年9月出台了《专业学位研究生教育发展方案（2020—2025）》，为专业学位研究生的培养提供了更加明确的方向和目标，发展专业学位研究生教育是经济社会进入高质量发展阶段的必然选择，专业学位研究生教育主要针对社会特定职业领域需要，培养具有较强专业能力和职业素养、能够创造性地从事实际工作的高层次应用型专门人才［2］。
高层次体现的是学术性，即专业学位研究生能够了解学科专业的前沿动态，具备某一专业或职业领域的基础理论和专业知识，在此基础上掌握相应的高级专业知识；应用型则要求专业学位研究生掌握现代实践和实验的方法技能、应用知识、创新技术，解决实际问题［3］。
因此，在专业学位硕士研究生培养阶段，学生不仅要掌握专业理论知识和基本技能，还必须能将其应用于解决实际问题，加强工程实践锻炼，培养研究生的创新能力、团队合作能力、沟通能力等综合素质，同时提升学生的就业竞争力［45］。
课程建设关系到学生培养质量的高低。
依据国家经济社会发展对专业学位研究生的需求，专业学位研究生课程建设不仅要注重理论教学，更要注重实践教学。
在实践教学中，学生通过实验、实习、实训、见习等方式，将所学理论知识和技能应用于解决实际问题，有助于培养学生的实践能力和综合素质。
果蔬中残留有机磷农药降解菌的选育及鉴定
果蔬中的残留有机磷农药具有高效的特点，且杀虫使用范围广泛,能够有效作用于农业生产以及病虫害防治等方面；然而因为其具有较强毒性,随着目前农作物对农药的依赖性日益增强，正在逐年加大农药的使用量,造成果蔬中的农药残留超标问题时常会导致中毒事件的发生，引起了我国对人民安全健康以及农药环境污染问题的高度重视。
如何减少或避免农药残留引起的危害，己成为国内外普遍关注的健康安全问题。
消费者也越来越关注和重视果蔬产品的质量安全状况，并大力追捧无农药残留的果蔬种类。
一、果蔬中残留有机磷农药的降解重要性与主要方法然而在农业生产环节中，有机磷农药的使用依然占据主导位置，并难以在短期之内扭转此趋势。
而仅凭借有机磷农药进行自然降解完全不能满足大众对于蔬果安全的需求。
因而有必要及时提出快捷而准确的分析方式,跟踪监测农药的使用过程,进而最大限度地控制农药对环境的污染程度。
例如采用气相色谱法分析果蔬中乐果与硫磷的残留量，这种方法既简便又迅速,可以使精密度和准确度均达到残留量分析的标准；同时跟踪研究施药的水果蔬菜,确保施药之后会有效降低乐果或硫磷的残留量,符合我国卫生规定的要求。
对残留农药的降解是有效缓解或防止农药毒副作用的关键研究范畴。
有机磷农药的基本降解方法包括物理、化学与生物方式。
物理方法囊括了超声波法、吸附法与洗涤法，化学方法通常有还原法、水解法与氧化法；但是这两种方法极有可能产生新的污染物，成本较高，且处理环节中要求苛刻的反应条件。
微生物降解有机磷农药的过程包含诸多不同的酶促反应，其优点为无毒、不造成二次污染，且反应迅速，条件较为温和，这是近年来使用领域最为普遍的一种成熟方法。
所以十分有必要筛选、选育和鉴定广谱、高效的有机磷农药降解菌株。
二、果蔬中残留有机磷农药降解菌的选育及鉴定1.降解有机磷农药菌株的广谱性测定有机磷农药借助破坏其磷脂键而脱毒，因为不同有机磷农药的结构互相类似，仅仅是取代基有所差异，因此一般相同的菌种能够降解多个种类的有机磷农药。
菌种的选育
第一章菌种选育第一节工业常用微生物及要求一、常见微生物（一）细菌（bacteria）发酵工业中常用的细菌主要是杆菌,主要有：醋杆菌属（Acetobacter）乳杆菌属（Lactobacillus）杆菌属（Bacillus）:α-淀粉酶，蛋白酶，肌苷、鸟苷等核苷。
其中最为重要的是枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）短杆菌属（Brevibacterium）：谷氨酸棒杆菌属（Corynebacterium）：谷氨酸（二）放线菌（actinomyces）属原核微生物（有菌丝体，无横隔，不具完整的核。
）最大的经济价值在于产生多种抗生素（antibiotic）。
链霉菌（Streptomyces）：红，金，土，氯，链霉素小单孢菌属（Micromonospora）：庆大霉素（三）霉菌（mould）亦称丝状真菌（不是分类学上的名词，凡在营养基质上形成绒毛状，网状或絮状菌丝的真菌统称霉菌。
）1.曲霉属（Aspergillus）黑曲霉（A. niger）产蛋白酶，淀粉酶，果酸酶，变异菌株产柠檬酸米曲霉（A. oryzae）产淀粉酶，蛋白酶，酿酒的糖化曲和酱油曲黄曲霉（A. flavus）产黄曲霉毒素米曲霉和黄曲霉均为半知菌。
2.青霉属（Penicillum）：例如桔子上的绿色斑点桔青霉（P. citrinum）：产生5’－磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。
3.根霉属（Rhizopus）接合菌米根霉（R. oryzae）华根霉（R. chinensis）酒药和酒曲中含有米根霉或华根霉。
4.红曲霉属（Monascus）淀粉酶，麦芽糖酶，蛋白酶，柠檬酸等。
可生产食用红色素。
（四）酵母（yeast）单细胞真核微生物，低等真菌。
①酵母属（Saccharomyces）啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）②假丝酵母属（Candida）产朊假丝酵母（Candida utilis）生产饲料酵母，其蛋白质和维生素含量都比啤酒酵母高。
挑战杯
5.方茴说："那时候我们不说爱，爱是多么遥远、多么沉重的字眼啊。
我们只说喜欢，就算喜欢也是偷偷摸摸的。
"6.方茴说："我觉得之所以说相见不如怀念，是因为相见只能让人在现实面前无奈地哀悼伤痛，而怀念却可以把已经注定的谎言变成童话。
"7.在村头有一截巨大的雷击木，直径十几米，此时主干上唯一的柳条已经在朝霞中掩去了莹光，变得普普通通了。
“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛简介参加“挑战杯”科技竞赛的作品一般分为三大类：自然科学类学术论文、社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作，凡在举办竞赛终审决赛的当年７月１日起前正式注册的全日制非成人教育的各类高等院校的在校中国籍本专科生和硕士研究生、博士研究生（均不含在职研究生）都可申报参赛。
每个学校选送参加竞赛的作品总数不得超过６件（每人只限报一件作品）、作品中研究生的作品不得超过３件，其中博士研究生作品不得超过１件。
各类作品先经过省级选拔或发起院校直接报送至组委会，再由全国评审委员会对其进行预审，并最终评选出８０％左右的参赛作品进入终审，终审的结果是，参赛的三类作品各有特等奖、一等奖、二等奖、三等奖、且分别约占该类作品总数的３％、８％、２４％和６５％。
竞赛的宗旨：崇尚科学、追求真知、勤奋学习、锐意创新、迎接挑战。
竞赛的目的：引导和激励高校学生实事求是、刻苦钻研、勇于创新、多出成果、提高素质，并在此基础上促进高校学生课外学术科技活动的蓬勃开展，发现和培养一批在学术科技上有作为、有潜力的优秀人才。
竞赛的方式：高等学校在校学生申报自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作三类作品参赛；聘请专家评定出具有较高学术理论水平、实际应用价值和创新意义的优秀作品，给予奖励；组织学术交流和科技成果的展览、转让活动。
第五届“挑战杯”一等奖获奖名单清华大学浦志勇《十字路口看乡企》--中国农村乡镇企业转制问题调查报告清华大学白继红蛋白质去折叠与折叠机制的研究清华大学陈益钢基于界面设计的多层膜技术获得新型合金1."噢，居然有土龙肉，给我一块！"2.老人们都笑了，自巨石上起身。
2022年新高考生物山东卷试题真题及答案详解(精校版)
生物注意事项：1．答卷前，考生务必将自己的姓名、考生号等填写在答题卡和试卷指定位置。
2．回答选择题时，选出每小题答案后，用铅笔把答题卡上对应题目的答案标号涂黑。
如需改动，用橡皮擦干净后，再选涂其他答案标号。
回答非选择题时，将答案写在答题卡上。
写在本试卷上无效。
3．考试结束后，将本试卷和答题卡一并交回。
一、选择题：本题共15小题，每小题只有一个选项符合题目要求。
1．某种干细胞中，进入细胞核的蛋白APOE可作用于细胞核骨架和异染色质蛋白，诱导这些蛋白发生自噬性降解，影响异染色质上的基因的表达，促进该种干细胞的衰老。
下列说法错误的是（）A．细胞核中的APOE可改变细胞核的形态B．敲除APOE基因可延缓该种干细胞的衰老C．异染色质蛋白在细胞核内发生自噬性降解D．异染色质蛋白的自噬性降解产物可被再利用2．液泡膜蛋白TOM2A的合成过程与分泌蛋白相同，该蛋白影响烟草花叶病毒（TMV）核酸复制酶的活性。
与易感病烟草品种相比，烟草品种TI203中TOM2A的编码序列缺失2个碱基对，被TMV侵染后，易感病烟草品种有感病症状，TI203无感病症状。
下列说法错误的是（）A．TOM2A的合成需要游离核糖体B．TI203中TOM2A基因表达的蛋白与易感病烟草品种中的不同C．TMV核酸复制酶可催化TMV核糖核酸的合成D．TMV侵染后，TI203中的TMV数量比易感病烟草品种中的多3．NO3-和NH4+是植物利用的主要无机氮源，NH4+的吸收由根细胞膜两侧的电位差驱动，NO3-的吸收由H+浓度梯度驱动，相关转运机制如图。
铵肥施用过多时，细胞内NH4+的浓度增加和细胞外酸化等因素引起植物生长受到严重抑制的现象称为铵毒。
下列说法正确的是（）A．NH4+通过AMTs进入细胞消耗的能量直接来自ATPB．NO3-通过SLAH3转运到细胞外的方式属于被动运输C．铵毒发生后，增加细胞外的NO3-会加重铵毒D．载体蛋白NRT1.1转运NO3-和H+的速度与二者在膜外的浓度呈正相关4．植物细胞内10%~25%的葡萄糖经过一系列反应，产生NADPH、CO2和多种中间产物，该过程称为磷酸戊糖途径。
菌种选育方法
组 织 或 细 胞 染 色 体 D N A
限 制 性 内 切 酶
基因片段
克隆载体
重 组 DNA分 子
受体菌
精选完含 整pp重 t课件组 分 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因。简称 c－。cDNA
复制
双链cDNA 载体
精选完整ppt课件
39
工程菌不稳定性的表现(倾向)
工程菌的不稳定包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个 方面。
质粒的丢失；
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的 混合物。在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的 比生长速率往往小于不含重组质粒的比生长速率，即宿 主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
精选完整ppt课件
17
（二）克隆载体的选择
精选完整ppt课件
18
（三）外源基因与载体的连接
粘性末端连接
GGATCC GGATCC CCTAGG CCTAGG
G GATC GCGAT CCTG AGCCTG AG
DNA连接酶
GGATCC
CCTG AG
精选完整ppt课件
19
（四）重组DNA导入受体菌
精选完整ppt课件
22
抗药性标记选择（插入失活法）：
将目的基因插入带ampr和tetr基因的载 体中，则tetr基因失活。在分别 含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中 培养，进行筛选。
精选完整ppt课件
23
精选完整ppt课件
24
标志补救（marker rescue）
若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。
精选完整ppt课件
国家级大学生创新创业训练计划
刘汉兰
20000
项目编号
项目名称
项目类型
项目负责
人姓名
指导教
师姓名
项目经费
（元）
201610504079
Bi/rGO/Bi2WO6三元复合材料的合成及光催化
性能研究
创新训练项目
刘文成
瞿阳
20000
201610504080
多孔金棒的生物模板合成方法研究
创新训练项目
梁晨楠
鲁哲学
20000
201610504081
20000
201610504050
白斑病毒分子蛋白A的分子研究
创新训练项目
李卓聪
兰江风
20000
201610504051
团头鲂颗粒溶素NK-lysin的生物学活性研究
创新训练项目
黄浩
袁改玲
20000
201610504052
光照和温度对蚤状溞生殖转化的诱导作用研究
创新训练项目
刘思甜
刘香江
20000
201610504053
创新训练项目
耿佩赟
பைடு நூலகம்刘睿
15000
201610504076
基于矩阵理论的亏损系统灵敏度模型
创新训练项目
黄文琳
沈婧芳
15000
201610504077
后基因组时代农药一基因相互作用数据库构建
创新训练项目
徐芳婷
位灯国，
郑芳
20000
201610504078
醚基离子液体的制备及其对纤维素溶解性能的
研究
创新训练项目
刘灵芝
20000
201610504090
大学生参与和使用众筹创业意愿及其影响因素 研究
《发酵工程原理与技术》习题集
《发酵工程原理与技术》习题集问答题1、发酵工业有何特点？简述发酵生产过程的主要环节。
2、工业用微生物的要求在哪些？试举例说明微生物要工业中的应用。
3、工业生产中使用的微生物为什么会发生衰退？菌种衰退表现在哪些方面？防止菌种衰退的措施有哪些？4、在菌种扩大培养中，就注意哪些事项？5、影响种子质量的因素有哪些？如何控制种子的质量？6、配制发酵培养基时应注意哪些问题？本着什么原则进行配制？7、发酵培养基的碳氮比对菌体的生长和产物的生成有何影响？8、请列出适用于发酵培养基灭菌的方法，并比较其各自的优缺点。
9、某制药厂现有一发酵罐，内装80t发酵培养基，在121℃温度下进行实罐灭菌。
如果每毫升培养基中含有耐热的芽孢数为2*107个，121℃时灭菌速度常数为0.0287S-1.请部灭菌失败概率为0.001时所需的灭菌时间是多少？10、请列出空气除菌的方法，并比较各种方法的优缺点。
11、影响空气过滤除菌效率的因素有哪些？12、比较两级冷却除菌流程、冷热空气直接混合除菌流程、高效前置过滤除菌流程的优缺点和适用场合，并分析原因。
13、解释氧在发酵液中的传质阻力和气体溶解过程的双膜理论。
14、说明影响氧传递速率的主要因素和效果。
15、比较酵母菌的酒精发酵和细菌的酒精发酵之异同。
16、说明初级代谢和次级代谢的关系及次级代谢产物的特征。
17、抗生素产生菌的主要代谢调节有哪几种方式？说明各种抗生素的生物合成机制。
18、阐述菌体生长速率、基质消耗速率、产物生成速率及意义。
19、发酵动力学如何分类？20、试比较不同发酵方法的优缺点。
叙述生物反应器（发酵设备）的功能和分类。
21、设计反应器时要本着哪些原则？反应器必须具备什么条件？22、机械搅拌发酵罐有哪些主要组成部分，它们各有怎样的功能或作用？23、发酵过程中温度升高对微生物生长和产物的形成有什么影响？什么原因造成温度升高？24、生产中为什么要控制pH？怎样调节和控制pH？25、发酵过程中哪些因素引起的pH上升和下降？26、泡沫的实质和形成原因是什么？它对发酵生产有什么影响？27、发酵生产中消除泡沫的方法有哪些种？各有什么优缺点？28、基质浓度对发酵有什么影响？说明补料分批发酵的优点和作用。
磷细菌PB12菌株的选育及培养条件的研究
１ 材 料 与 方 法
１１ 材料 ．
作 物体 内有 机化 合 物 的重 要 组 成 成 分 ， 对农 作 物
早熟 、 高产 、 质具有重 要作 用 。我 国农 田土 壤 中 优 ２ ３缺磷 ， ／ 特别是北 方 广 大农 田土壤 严重 缺 磷 ¨ 。
１ １ １ 出发 菌株 ． ． 巨大芽 胞杆 菌 （ ａｉｕ ｅａ Ｂ ｃｌ ｍｇ — ｌｓ
ｃ ｌ ｒｄｉ ｓａ ｉ ａｋ ｃｎａｎ ｇ ｍ ｄ ｍ ｗｔ ａ （ Ｏ ） ａ ｅｏ ｌ ｐ ｏｐ ｏｏ ｓｓｕｃ ， ｖ ａ ｓ ｆ ｒｓａ ｉｇ ｕｔ ｅ ｈ ｋｎ ｆ ｓ ｏ ｔ ｉ ｅ ｉ ｉ Ｃ ３ Ｐ ４ ２ ｓ ｈ ｎｙ ｈ ｓ ｈ ｒｕ ｏ ｒｅ ｆ ｅｄ ｙ ａ ｅ ｈ ｋｎ ｕ ｎ ｇｌ ｉｎ ｕ ｈ ｔ ｉ ｔ
１ ０。ｃｕ ｆ ／ｍＬ Ｋｅ ｗ ｏ ｄ ｓｒｉ ｒ ｅ ｉ ｇ； Ｐ １ ￣ａ ｎ；ｐｈ ｓ ｈａｅ ｄｓ ｏｖ ｎ ｙ ｒｓ ｔａ ｎ ｂ ｅ ｄ ｎ Ｂ ２ ｓ ｉ ｏ ｐ ｔ ｉｓ ｌｉ ｇ；ｃ ｌｕｒ ｏｎ ｉｉｎ ｕ ｔ ｅ ｃ ｄｔｏ
磷是农 作物 营 养 中 的三 大要 素 之 一 ， 又是 农
ｃ ｔ ｅ ｕ ｅ ５ ℃ ．ｐｈ ｓ ｈｏｏ ｏ ｔ ｎ ｎ ｔ ｅ ｓ ｐｅ ｎ ｔ ｎ ｓ６１ ２１ ｕｌ ｎｄ ｒ２ ｕｒ ｏ ｐ ｒｕｓｃ ｎ ｅ ｔｉ ｈ ｕ ｒ ａａ ｔｗｌ ． ｍｇ／ ２． ｉ ｅ ｈ ｔｏ ｈｅ ｏ ｇｎａ ｔａｎ． Ｌ ０３ ｔｍ ｓｔ ａ ｆｔ ｒ ｉ ｌｓｒ ｉ ｉ Ａｔｔ ｅ ｓ ｍｅ ｔｍｅ，ｉｆｕ ｎ ｅ ｏ ｉ ｅｅ ｔｐ ｙ ｉ ａ ｎ ｈ ｍｉ ａ ！ｃｏ ｓｏ ｈ ｒ ｗｔ ｆＰＢ１ ｒ ｌｏ ｓｕｄｅ ｏ ｃ ｎ— ｈ ａ ｉ ｎｌ ｅ ｃ ｆｄｆ ｒ ｎ ｈ ｓｃ ｌａ ｄ ｃ ｅ ｃ ｌ： ｔｒ ｎ ｔ ｅ ｇ ａ ｏ ｈｏ ２ ｗｅ ｅａ ｓ ｔ ｉｄ ｔ ｏ
解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究
解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究作者：上官亦卿常帆吕睿齐凡贾凤安王艳丁浩来源：《湖北农业科学》2019年第01期摘要：为开发高效微生物解磷肥，利用解磷菌选择培养基（蒙吉娜卵磷脂培养基）从陕西省西安市周至县猕猴桃园农田土壤中分离出11株解磷菌，通过纯化培养，筛选出1株高效解磷菌JYP9。
利用16S rDNA基因序列分析方法对该菌株的分类信息进行鉴定，鉴定结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。
并用解磷圈法和液体摇瓶培养法，分别以卵磷脂为惟一磷源，确定了该菌株的最适培养温度为26 ℃、最适转速为200 r/min、最适起始pH为7和最适起始接种量为2%。
关键词：解磷菌;筛选;鉴定;最适条件中图分类号：S154.39; ; ; ; ;文献标识码：A文章编号：0439-8114（2019）01-0030-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2019.01.007; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Isolation，Screening，Identification and Phosphate Solubilizing Ability of Phosphate Solubilizing BacteriaSHANGGUAN Yi-qing1，2，CHANG Fan2，LYU Rui2，QI Fan1，JIA Feng-an2，WANG Yan2，DING Hao2（1.Shaanxi Academy of Sciences，Xi’an 710043，China;2.Microbial Metabolism Research Center，Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xi’an 710043，China）Abstract： In order to develop an efficient microbial fertilizer solution， 11 strains from the farm-land soil of actinidia park in Zhouzhi county， Shaanxi prvince， were isolated， using phosphate volubility bacteria selective culture medium （Mongolia lecithin culture medium）. A strain of phosphate volubility bacteria JYP9 was screened through purification cultivar. And classification information of this strain was identified by using 16S rDNA gene sequence analysis，the results showed that the strain was a Pseudomonas extremorientalis. Then the phosphate solubilizing method and the liquid shake flask method were used in the experiment to confirm the optimum cultivation condition of JYP9 with lecithin as the only phosphorus source. The results showed that the optimal temperature was 26 ℃， optimal rotational was 200 r/min， optimal pH was 7， and optimum initial inoculation amount was 2%.Key words： phosphate solubilizing bacteria; screen; identify; optimum condition磷是植物生长所需的一种主要营养元素，但植物对土壤中的磷元素利用率很低，严重影响着植物的生长[1]。
菌种的选育与保藏
菌种的选育与保藏微生物菌种选育与保藏本章知识概要第一节菌种分离与筛选第二节菌种选育第三节菌种保藏第一节菌种分离与筛选1、采样原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。
可寻找已适应各种环境压力的微生物类群。
土壤、水、空气、动植物体都含有微生物。
土壤由于具备了微生物所需要的营养、水分、空气。
是微生物最集中的地方从土壤中几乎可以分离所需要任何菌株。
细菌（108）＞放线菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻类（104）＞原生动物（103）②采样方法：选择适当地点和场所、用无菌器皿取样十克，装入袋中，记录采样地点、时间、环境等等。
2、富集培养：在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，是目的微生物在最适的环境下，迅速生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
A：控制营养条件----纤维素酶产生菌B：控制培养条件----施加压力、pH、温度、氧气、根据特殊生理特征、C：添加特殊抑制剂---抗生素3、纯种分离：富集培养而得到微生物，并不能达到纯化标准，杂菌并没有死亡、还需要进一步纯化----纯培养粗放型：菌落纯精细型：菌种纯划线分离法A：粗放型涂布分离法稀释分离法平板划线分离法：接种针挑取含有微生物样品，在固体培养基表面上划线，适当条件培养后，挑取单菌落。
稀释分离法用1ml无菌吸管精确地吸取1ml大肠杆菌悬液放入10-1的试管中，使其混合均匀。
另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中……其余依次类推。
涂布分离法用涂棒蘸取培养液，在固体培养基表面均匀涂平，获得单菌落。
精细型：毛细管分离法：利用培养皿或凹玻片等分离小室进行细胞分离。
也可以利用复杂的显微操作装置进行单细胞挑取。
流式细胞仪：流式细胞仪（Flow CytoMeter, FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析和检测、筛选技术。
第二章菌种选育、保藏与复壮
（一）样品采集
① 原则
样品来源越广泛，获得新菌种的可能性越大。
② 土壤采样方法
土壤的细有菌机、质放线含菌量：和耕通地风、状菜园况和（近5～郊土25壤cm；深度） 土壤的酵p母H和菌植：果被园状树况根的土壤中；
•pH＜7.0 ：霉菌、酵母菌居多 地理条霉件 菌：动植物残体及霉腐土层中； 季•p节H7.条0黑件～曲7.霉5：：细稻菌场、、谷放物线堆菌积丰处富。
黑曲霉
黑曲霉 栖土曲霉 根霉 毛霉 青霉菌 木霉菌 黄曲霉菌 红曲霉
产物 谷氨酸 肌苷酸 淀粉酶 蛋白酶
葡萄糖异构酶
酒精 单细胞蛋白 乳糖酶 柠檬酸 柚苷酶、酸性蛋白
酶 单宁酶、糖化酶 蛋白酶 糖化酶、甾体激素 蛋白酶 葡萄糖氧化酶 纤维素酶 淀粉酶 糖化酶、红曲色素
用途 食用、医药 食用、医药 葡萄糖、糊精、酒精发酵、啤酒酿造 酱油速酿、饲料
❖ 控制传代次数：不超过7代，易变异的不过5代 ❖ 砂土管、冻干管保藏的原种，开启不能超过3次，以防污染。 ❖ 选择良好保藏方法：保证菌不死、不衰、保存活性及原有典型性状 ❖ 良好的培养条件：注意斜面菌株的培养条件（保藏、活化培养基） ❖ 采用不同类型的细胞进行接种
产孢子霉菌 细菌
二、菌种的复壮
❖ 自然选育的定义
利用微生物在一定条件下产生自发变异，通过分离、筛选，排除劣质性 状的菌株，选择出维持原有生产水平或具有更优良生产性能的高产菌株， 达到纯化与复壮菌种、保持稳定生产性能的目的。其主要原理是微生物 群体分离。
❖ 自然选育的方法
（1）通过表现形态淘汰不良菌株； （2）考察目的代谢产物产量； （3）进行遗传基因型纯度试验，考察菌种纯度； （4）传代稳定性试验：斜面传3-5代。
❖ 菌种退化的主要表现 ① 产量下降，目的代谢产物减少，原料转化率下降； ② 生长速度缓慢，目的代谢产物合成能力下降，发酵周期延长； ③ 产孢子能力变弱，孢子形成数量减少； ④ 抗逆性减弱； ⑤ 形态畸形等。
川西北高寒草甸植物根际促生菌筛选及其特性研究
Abstract： The study aimed to obtain multi-functional plant, growth promoting rhizobacteria (PGPR) and clarify theirphysiological and biochemical characteristics? including nit.rogenfixat.ion, phosphorusand potas sium solubilization, rhizosphere soil and roots from five widely distributed alpine meadow plants were used to isolate the bacterial strains?and a total of 44 strains were obtained. The results showed that. 25 strains were inorganic-phosphorus-dissolving ones and 24 strains were organic-phosphorus-dissolving ones, the ca pacities of phosphorus-dissolving for these t.wo strain types were 1 0. 98 〜90. 27 /tg • mL 1 and 1 0. 58 〜 64. 56 /g • mL 1 , respectively； Additionally? 20 strains were able to fix nitrogen biologically nitrogenase activity： 5. 23〜64. 87 nmol (C2 H4 ) • h 1 • mL 1 and 21 strains were able to release potassium (potassium releasing capacity：. 23 〜73. 21 /g • mL 1 ). On basis of morphological? physiological and biochemical characteristics, 1 2 strains with multiple functions (phosphorus-solubilizing, nitrogen-fixing and potassiumreleasing) were finally screened out. These 1 2 strains were identified as Acinetobacter, Serratia , Pseudo moas ,Bacillus, Del fiia and Sienoirophomonas with molecular method. The study provides a good reference for developing high quality soil microbial fertilizers in the northwestern Sichuan Plateau. Key words: Alpine meadow; Plant, growth-promoting rhizobacteria (PGPR) ; Screening strains; Physiological
《耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选及促生作用研究》范文
《耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选及促生作用研究》篇一一、引言近年来，随着工业化和城市化的快速发展，土壤和水体污染问题日益严重，尤其是盐分和重金属污染对农业生态系统的负面影响愈发显著。
为了应对这一挑战，微生物学领域的研究者们开始关注具有耐盐耐重金属特性的微生物群落。
PGPR（Plant Growth Promoting Rhizobacteria）菌株作为一种具有显著促生作用的微生物，其在改善土壤环境、提高作物产量和品质方面具有巨大潜力。
因此，筛选耐盐耐重金属的PGPR菌株并研究其促生作用，对于改善受污染环境的农业生产和生态保护具有重要意义。
二、方法本研究采用平板法、液体培养法及分子生物学技术等手段，对耐盐耐重金属的PGPR菌株进行筛选、鉴定和促生作用研究。
（一）耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选1. 采样：在受污染的农田、盐碱地等不同环境中采集土壤样品。
2. 分离纯化：采用平板法对土壤样品进行分离纯化，获得单菌落。
3. 耐盐性筛选：通过在含有不同浓度NaCl的液体培养基中培养菌株，筛选出耐盐性强的菌株。
4. 耐重金属性筛选：采用类似的方法，在含有不同浓度重金属（如Cu、Zn、Pb等）的液体培养基中筛选耐重金属菌株。
（二）PGPR菌株的鉴定1. 形态学观察：对筛选出的菌株进行形态学观察，初步判断其种类。
2. 分子生物学鉴定：采用16S rRNA基因序列分析等方法，对菌株进行分子生物学鉴定，确定其种类和亲缘关系。
（三）促生作用研究1. 盆栽试验：在受污染的土壤中种植作物，接种筛选出的PGPR菌株，观察其对作物生长的影响。
2. 生理生化指标测定：测定接种菌株后作物的根长、株高、叶绿素含量等生理生化指标，评估其促生作用。
三、结果与讨论（一）耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选结果经过一系列的筛选和鉴定，本研究成功筛选出多株耐盐耐重金属的PGPR菌株，其中以某菌株表现最为突出，该菌株在NaCl 浓度达到5%的条件下仍能正常生长，且在Cu、Zn、Pb等重金属浓度较高的环境中也表现出较强的适应性。
《耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选及促生作用研究》范文
《耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选及促生作用研究》篇一一、引言随着工业化的快速发展，土壤污染问题日益严重，尤其是盐分和重金属的污染对农业生产和生态环境造成了严重影响。
PGPR （Plant Growth Promoting Rhizobacteria）是一种具有促进植物生长特性的微生物，对土壤污染修复具有重要意义。
本文旨在筛选耐盐耐重金属的PGPR菌株，并研究其促生作用，为农业生产和环境保护提供新的微生物资源和技术支持。
二、材料与方法1. 样品采集与处理从受盐碱和重金属污染的农田、湖泊、工业废料场等地区采集土壤样品，并进行初步处理，去除杂质。
2. 菌株筛选采用富集培养、平板分离法等手段，筛选出具有耐盐耐重金属特性的PGPR菌株。
3. 鉴定与分类利用分子生物学技术（如PCR、16S rRNA基因测序等）对筛选出的菌株进行鉴定和分类。
4. 促生作用研究通过盆栽试验、生长指标测定等方法，研究PGPR菌株对作物的促生作用。
三、结果与分析1. 耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选结果经过富集培养和分离纯化，共筛选出50株耐盐耐重金属PGPR菌株。
其中，10株菌株在不同浓度的盐分和重金属条件下均表现出良好的耐受性。
2. 菌株鉴定与分类通过分子生物学技术对筛选出的菌株进行鉴定和分类，发现这些菌株属于不同的属种，如芽孢杆菌属、假单胞菌属等。
这些菌株具有不同的生理特性和代谢途径，为后续研究提供了丰富的资源。
3. 促生作用研究结果通过盆栽试验和生长指标测定，发现耐盐耐重金属PGPR菌株对作物具有明显的促生作用。
其中，某菌株在施用于小麦、玉米等作物后，显著提高了作物的生物量、叶绿素含量和根系发育等指标。
此外，该菌株还能分泌多种植物生长调节物质，如植物激素等，进一步证实了其促生作用。
四、讨论1. 耐盐耐重金属PGPR菌株的筛选与鉴定本文成功地从受污染的土壤中筛选出耐盐耐重金属的PGPR 菌株，并进行了初步的鉴定和分类。
这些菌株具有不同的生理特性和代谢途径，为进一步研究其生物学特性和应用潜力提供了基础。
培养基 无机磷基本培养基
溶磷能力的定性及定量测定培养基无机磷基本培养基( NBRIP［6］: Glucose 10 g，Ca3 ( PO4 ) 2 5．0 g，MgCl2 5．0 g，MgSO4 7H2 O 0．25 g，KCl 0．2 g，( NH4 ) 2 SO4 1 g，Deionized H2 O 1 000 mL，Agar 15 g，pH7．0将菌株点接接种到相应培养基上，看看有没溶磷圈。
需要器材配制100ml 培养基接种环、灭菌培养皿、酒精灯、记号笔等(2)采用比色法[ 20 ]测定L144菌株分泌生长素能力:将菌株接种于盛有50 mL LB液体培养基的三角瓶中，置于转速125 r /min、温度28 ℃的摇床培养16 h后, 取L144菌株培养液 1 mL于试管中, 加 1 mL 比色液(0.5 mol /L FeCl 3、98% H2S O4 30mL、蒸馏水50 mL) , 对照为L144菌株培养液, 置于室温下15 min后观察颜色的变化(粉红色为阳性,表示菌株能够分泌吲哚乙酸( I AA) , 粉红色颜色越深表示分泌I AA能力越强; 无色为阴性,表示菌株不能分泌I AA)。
需要器材LB培养液、比色液（0.5 mol /L FeCl 3、98% H2S O4 30mL、蒸馏水50 mL）、1ml枪头、试管采用比色法测定根瘤菌分泌生长素( IAA) 能力, 测定培养基采用改良的刚果红液体培养基, 组成: 0. 5 g K2 HPO4 .3H2O; 0. 2 g Mg SO4.7H2O; 0. 1 g NaCl, 1 g 酵母膏, 10 g 甘露醇, 10 mL 0. 25% 刚果红, 1 g NH4NO3 , 100 mg/ L 色氨酸, 1 000 mL 蒸馏水, pH 值7. 0。
比色液配方: 0. 5 mol/ L FeCl3 , H2 SO4 30 mL, 蒸馏水50 mL后,取根瘤菌悬浮液100 uL 置于白色塑料比色板上,加100 uL 的比色液, 15 min 后观察颜色变化。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
磷细菌PB12菌株的选育及培养条件的研究郭树凡,朱春玉,李 辉,胡永飞,李 昱(辽宁大学生命科学学院,辽宁沈阳 110036)摘 要 以P B21P为出发菌株,经紫外线诱变,获得1株解磷高产菌株P B12。
在以磷酸三钙为惟一磷源的培养基中接种P B12菌株,28℃,振荡培养5d,培养基上清液中磷含量达61.21mg/L,是出发菌株的2.03倍。
同时研究了各种理化因素对P B12菌株生长的影响,确定了最佳培养条件,即玉米粉1.0%,豆饼粉2.0%, pH7.0,装液量为100mL(500mL三角瓶),36℃培养42h,有效活菌数可达10.2×108cfu/mL。
关键词 菌种选育;P B12菌株;解磷;培养条件中图分类号 Q939.14 文献标识码 A 文章编号 1005-7021(2007)02-0049-04Breed i n g and Culture Cond iti on s of Phospha te D issolv i n g Bacter i u m PB12G UO Shu2fan,ZHU Chun2yu,L I Hui,HU Yong2fei,L I Yu(Coll.of L ife Sci.,L iaoning U niv.Shenyang110036)Abstract P B12with str ong ability of diss olving phos phate was obtained fr om P B21P thr ough UV mutagenesis.It was cultured in shaking flask containing mediu m with Ca3(P O4)2as the only phos phor ous s ource,five days after shaking culture under25℃,phos phor ous content in the supernatant was61.21mg/L2.03ti m es that of the original strain.A t the same ti m e,influence of different physical and che m ical fact ors on the gr owth of P B12were als o studied t o con2fir m the op ti m u m culture conditi ons,they are1.0%maize powder,2.0%s oybean powder,pH7.0,filling a mount 100mL(in500mL flask),culture under36℃for42hours,the effectively live bacteria could reach up t o10.2×108cfu/mL.Keywords strain breeding;P B12strain;phos phate diss olving;culture conditi on 磷是农作物营养中的三大要素之一,又是农作物体内有机化合物的重要组成成分,对农作物早熟、高产、优质具有重要作用。
我国农田土壤中2/3缺磷,特别是北方广大农田土壤严重缺磷[1]。
土壤中的磷素主要以磷灰石、磷酸钙和有机磷的形式存在,作物难以吸收利用。
利用微生物的解磷作用能够将难溶性的磷酸盐和有机磷化物转化为水溶性有效磷,从而改善了作物磷素营养状况,促进作物的生长[2,3]。
因此,开展高效溶磷微生物的研究和应用,对农业高效持续发展具有重要的理论意义和实际意义。
以P B21P菌株为出发菌株,经紫外线诱变,选育出一株高效解磷突变株P B12,并对其培养条件进行了研究,旨在为微生物肥料的生产提供高效稳定的菌株。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 出发菌株 巨大芽胞杆菌(B acillus m ega2 terium),保藏菌株代号为P B21P,辽宁大学生命科学学院实验室分离保藏的菌种。
1.1.2 培养基 ①斜面培养基:牛肉膏蛋白胨培养基;②无机磷细菌培养基:葡萄糖10.0g, (NH4)2S O40.5g,MgS O40.3g,NaCl0.3g, KCl0.3g,FeS O40.03g,MnS O40.03g, Ca3(P O4)25.0g,蒸馏水1000mL,pH7.0;③基本培养基:K2HP O42.0g,MgS O41.0g,CaCO3 1.0g,蒸馏水1000mL,pH7.0。
1.2 方法 收稿日期:2007-01-21 作者简介:郭树凡 男,副教授。
现从事土壤微生物学研究。
94微生物学杂志 2007年3月第27卷第2期 JOURNAL OF M I CROB I O LOGY M ar.2007Vol.27No.21.2.1 诱变方法 ①菌悬液的制备:从斜面上挑取菌苔1环,接入到装有50mL牛肉膏蛋白胨培养基的三角瓶中。
28℃,180r/m in振荡培养18h。
将培养好的菌液在3000r/m in,离心10m in,弃去上清液,用无菌生理盐水洗涤3次,并调整细胞浓度为108个/mL;②UV处理:打开紫外灯(15W)预热20m in。
取5mL菌悬液加入到无菌培养皿中,将培养皿放在离紫外灯垂直距离30c m处的磁力搅拌器上,打开皿盖进行搅拌照射处理,照射时间分别为60、120、180和300s。
在红灯下用10倍稀释法把诱变菌液依次稀释至10-6。
从10-5和10-6中各取0.1mL菌悬液分别加入到牛肉膏蛋白胨平板培养基(5次重复)上,涂抹法接种,28℃恒温培养48h。
1.2.2 突变株的筛选方法 ①初筛:从平板培养基上选择性地挑取具典型特征的菌落接入斜面试管活化,28℃恒温培养48h后,制成菌悬液。
将其接种到无机磷平板培养基上,28℃培养72h,根据溶磷圈直径的大小来判断菌株的解磷能力;②复筛:将初筛选定的菌株接入斜面试管,28℃培养20h后,制成菌悬液。
取5mL菌悬液加入到装有100mL培养基/500mL三角瓶中,对照接入等量灭活的菌液,28℃,180r/m in,振荡培养5d,测定并选出解磷能力高的菌株,同时进行传代试验。
试验重复3次。
1.2.3 P B12菌株发酵条件[4～6] 研究了碳源、氮源、pH、培养温度和装液量对菌体生长的影响。
培养条件:在500mL三角瓶中加入100mL培养基,接种5mL菌悬液,32℃,180r/m in,振荡培养42h,测定培养液中的有效活菌数量。
试验3次重复。
1.2.4 测定方法 ①解磷量测定:将培养结束后的发酵液在4000r/m in离心20m in,用钼蓝比色法测定上清液中的磷含量[7];②pH测定:用PHS225C酸度计测定;菌体数量测定;③稀释平板计数法。
2 结果与分析2.1 诱变时间与致死率和正突变率的关系将诱变处理后所选取菌株进行初筛和复筛,根据溶磷圈的大小和培养基上清液中的磷含量来确定正突变率,结果见表1。
表1 诱变时间与死亡率和正突变率的关系Table1 Relati on of mutagenesis ti m es anddeath rates,positive mutati on ratest/s致死率/%挑菌数/株正突变株正突变率/%6062.140512.512079.6401127.518089.2401332.530096.34037.50 从表1可以看出,随着诱变剂量的增加,菌体的死亡率也随之增加。
菌体经过UV照射120和180s后,解磷量正突变株数量较多,正突变率分别为27.5%和32.5%,所以诱变剂量采用致死率在80%～90%范围内为宜。
2.2 突变株与出发菌株解磷量的比较初筛后选出具有较强解磷能力的菌株13株,通过摇瓶发酵,选出了解磷量高于出发菌20%以上的正突变株7株,其中P B12菌株解磷量最高,为61.21mg/L,是出发菌株的解磷量的2.03倍,并对7个突变株与出发菌株解磷量进行了差异显著性分析,结果见表2。
表2 突变株与出发菌株解磷量的比较Table2 The P2diss olving capacities of mutati ons and start strain差异显著性差异显著性菌株平均解磷量/(mg・L-1)菌株平均解磷量/(mg・L-1)0.050.010.050.01P B1261.21a A P B1338.25cd CP B2648.46b B P B4437.56cd CP B2147.52b B P B1936.22d CP B3838.74c C P B21P30.14e E05 微 生 物 学 杂 志 27卷2.3 PB12菌株遗传稳定性试验将P B12突变株接种到斜面培养基上进行传代培养,同时测定每代的解磷量。
从表3可以看出P B12菌株在传代20代的试验中解磷量基本稳定在(60.99±1.27)mg/L 范围内,经方差分析,F <F 0.01,差异不显著。
这说明P B12菌株是一个解磷量高且性状稳定的突变株,具有一定的应用前景,为此对P B12菌株培养条件进行了研究。
表3 遗传稳定性试验Table 3 The heredity stability of P B12代时Generati ons P 2P 8P 14P 20解磷量/(mg ・L -1)P 2diss olving capacities62.47±2.161.38±0.859.45±1.760.64±1.42.4 PB12菌株的培养条件2.4.1 碳源试验 在基本培养基中加入蛋白胨2.0%,然后分成5等份,再分别加入葡萄糖、蔗糖、甘露醇、玉米粉和可溶性淀粉5种碳源,其浓度为1%,配成5种不同碳源培养基,结果见图1。
图1 碳源对菌体数量的影响Fig .1 Effects of carbon s ources on bacteria number 1:葡萄糖;2:糖;3:甘露醇;4:玉米粉;5:可溶性淀粉 从图1可以看出,培养基中的碳源种类对菌体数量的影响较大,玉米粉是最佳碳源,可溶性淀粉次之,蔗糖和葡萄糖较差,甘露醇最差。
以玉米粉为碳源时有效活菌数量为7.15×108cfu /mL,是蔗糖的1.4倍。
同时玉米粉来源广泛,价格低廉,营养丰富,是P B12菌株发酵生产的最适碳源。
2.4.2 氮源试验 在基本培养基中加入玉米粉1%,分成5份后,再分别加入蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉、硫酸铵和硝酸钾5种氮源,其浓度为2%,结果见图2。