摇床培养确定酵母菌的培养条件或营养条件完整版

摇床培养确定酵母菌的

培养条件或营养条件 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

摇床培养确定酵母菌的最适营养条件和培养条件

实验方案

酵母是单细胞微生物，形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆形、柠檬形或藕节形等，一般为1～5或5～20微米，它属于高等微生物的真菌类。酵母菌是兼性厌氧菌，在有氧的情况下，它把糖分解成二氧化碳和水且酵母菌生长较快。在缺氧的情况下，酵母菌把糖分解成酒精和二氧化碳。酵母菌能在PH值为～的范围内生长，最适PH值为6~7。在低于水的冰点或者高于47℃的温度下，酵母细胞一般不能生长，生长温度一般在20～30℃，最适生长温度范围为28～30℃。

一、实验目的

1、认识了解酵母菌的细胞形态和生理特性；

2、学习了解酵母菌的营养需求，确定酵母菌生长的最适条件；

3、掌握摇床培养酵母菌的操作技术及工艺流程；

4、掌握正交试验的概念、原理、方法及运用领域，学习设计兵进行正交试验

操作；

5、学习掌握生物量的测定方法，利用比浊法和计数法分析确定酵母菌的最适

营养条件和培养条件。

二、实验原理

酵母菌的最适营养条件和培养条件是利用PDA液体培养基摇床培养，通过正交实验设计进行的。正交试验设计(Orthogonal experimental design)是研究多因素多水平的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法，是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。正交表是一整套规则的设计表格，用L表示正交表的代号，a为试验的次数，b为水平数，c为列数，也就是可能安排最多的因素个数。本实验采用了三因素三水平的正交试验来确定酵母菌的最适营养条件和培养条件。

生物量的测定方法有比浊法、计数法和直接称重法等。由于酵母在液体摇床发酵培养过程中是以均一性的混浊液状态存在的，所以可以利用紫外分光光度计进行直接比色法来测定其生物量。

三、实验设备、材料及试剂

（一）设备

超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、恒温振荡培养箱、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、电子天平、显微镜、电磁炉、锅、酒精灯、锥形瓶（250mL 10支）棉塞、

烧杯（1000mL 1个，500mL、250mL、100mL各3个）以及试管若干、移液枪

（5mL、1mL各一支）及枪头（无菌）若干、10mL离心管18支、血球计数板

（25*16）、漏斗、pH试纸、玻璃棒、打火机、接种针、吸水纸、擦镜纸、报纸、标签纸等。

（二）材料

1、菌种：酵母菌菌种

2、培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂

（三）试剂：

蒸馏水、1mol/L的氢氧化钠溶液、1mol/L的盐酸溶液、75%酒精溶液。

四、实验方法

（一）正交试验进行酵母菌的摇床培养

在酵母菌的培养条件和营养条件中，营养条件包括碳源、氮源、矿物元素和生长因子等方面，培养条件包括摇床培养的温度、转速、时间，以及培养基的pH、装液量和接种量等，根据实验需求，本次实验选择了碳源、pH值和培养时间为因素，设计了如下的三因素三水平的正交试验进行探究，确定酵母菌的培养条件和营养条件。（每100mL培养基的配置标准）

表1 正交表试验设计

因素水平葡萄糖(A)pH值(B)培养时间(C)

1 68h

2 710h

3 812h

表2 正交表实验方案

编号葡萄糖

(A)pH值

(B)

培养时间

(C)

(1)111

(2)122

(3)133

(4)212

(5)223

(6)231

(7)313

(8)321

(9)332（二）比浊法和计数法测定酵母菌的生物量

酵母菌在波长为560nm的时候对光的吸收最强，利用比浊法可以间接测定酵母菌的生物量大小，进行比较。同时，也可以用血球计数板计数酵母菌悬液的菌落数。

五、实验步骤

（一）菌种的活化

1、培养基的配置

（1）菌种试管斜面（活化）培养基及母种扩大培养基

马铃薯琼脂糖培养基：马铃薯（去皮）200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ， pH自然。试验用量为1/5。

①称量取去皮马铃薯40g，葡萄糖两份，每份2g，琼脂。琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量差的应适当增加。

②将马铃薯切成小块，放入锅中，加水200mL，煮沸30 min。用双层纱布滤去马铃薯残渣，滤液加蒸馏水定容到200mL，搅拌均匀。

③取100mL滤液，装入250mL的锥形瓶内，加入2g葡萄糖，搅拌使糖溶解，然后加塞包扎，等待灭菌。该培养基即为酵母菌扩大培养的液体PDA培养基。

④将剩余100mL马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。

⑤加入2g葡萄糖，葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容到100mL。

⑥分装将煮好的培养基分装于试管中，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。

⑦加塞在管口塞上棉塞。棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发。

⑧包扎加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层报纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称。

⑨灭菌将上述培养基以，121℃，高压蒸汽灭菌20 min。

⑩搁置斜面将灭菌的试管培养基竖直放置，冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。

（2）进行摇床培养的PDA液体培养基

①称量取去皮马铃薯180g，分别称取葡萄糖1g、2g、3g各三份。

②将马铃薯切成小块，放入锅中，加水900mL，煮沸30 min。用双层纱布滤去马铃薯残渣，滤液加蒸馏水定容到900mL，搅拌均匀。

③分装将煮好的培养基分装于9个锥形瓶中，每支锥形瓶100mL培养基，编号（1）-（9），用记号笔注明。