Ch04基因工程的常用载体-质粒载体
基因工程载体质粒
基因工程载体质粒是用于携带、传递和表达外源基因的工具。它在生物学研 究和应用领域起到至关重要的作用。
基因工程载体质粒的定义、作 用和意义
基因工程载体质粒是一种双链环状DNA分子，能够自主复制，并能将外源基 因稳定地引入宿主细胞中。它为基因工程研究和应用提供了可靠的平台。
常见的基因工程载体质粒类型
质粒
小型、可以独立复制的环状 DNA分子。
噬菌体
包裹载体质粒的蛋白外壳。
人工染色体
可容纳更大量级的基因片段的 载体。
基因工程载体质粒的结构和特点
1 起源
包括起始位点、选择标记和调节元件。
2 多样性
3 稳定性
可以按需求设计，适应不同的实验目的。
能够在宿主细胞中稳定传递和复制。
基因工程载体质粒的构建方法和技术
1
互补连接
将多个DNA片段连接起来形成完整质粒。
PCR扩增
2
通过PCR技术扩增需要的DNA片段并插入质
粒。
3
电泳分离
利用电泳将DNA片段分离出来，进行后续的 连接和转化。
应用基因工程载体质粒进行基 因转化的研究进展
通过基因工程载体质粒进行基因转化已经在植物、动物和微生物等领域取得 了重要进展，为基因研究和应用提供了广阔的空间。
随着基因工程技术的广泛应用，合理使用和管理 基因工程载体质粒成为重要课题，以确保安全和 可持续发展。
基因工程载体质粒在农业、医学等领域的应用 案例
农业
医学
利用质粒载体转导抗虫、抗病等功
通过质粒载体传递治疗基因，用于
能基因，提高作物产量和抗逆能力。 基因治疗和药物研发。
生物技术
利用质粒载体进行基因克隆、基因 表达和蛋白质表达等研究。
《基因工程的载体》课件
04
人工染色体载体
人工染色体的概念与特性
人工染色体
指通过基因工程技术构建的染色 体，具有与天然染色体相似的结 构和功能。
特性
具有高容量、可定制、可调控等 特性，能够承载和表达大量的外 源基因，为基因治疗、基因组编 辑等领域提供有力支持。
人工染色体载体的构建
构建方法
通过同源重组、酵母人工染色体技术等方法，将天然染色体或其片段进行改造 和扩增，形成人工染色体载体。
目的基因与质粒载体的连接
将重组质粒导入受体细胞中，通过筛 选和鉴定获得阳性克隆。
质粒载体的选择
根据目的基因的性质和表达要求，选 择合适的质粒载体。
重组质粒的转化
通过限制性内切酶和DNA连接酶将 目的基因插入质粒载体中，形成重组 质粒。
质粒载体的应用
基因克隆与表达
质粒载体是基因克隆和表达的重要工具，可以将目的基因在受体细胞中高效表达。
基因组结构
复制方式
噬菌体的基因组通常较小，易于 操作和改造。
噬菌体通过复制和组装在宿主细 胞内产生子代，能够高效地将外 源基因整合到宿主基因组中。
噬菌体载体的构建
01
02
03
基因克隆技术
利用基因克隆技术将外源 基因插入到噬菌体基因组 中，构建成噬菌体载体。
基因敲除或敲入
通过基因敲除或敲入技术 ，对噬菌体基因组进行改 造，以实现外源基因的表 达或调控。
基因功能研究
人工染色体载体可用于构建基因表达谱和基因敲除细胞系 ，有助于深入研究和了解基因的功能和作用机制。
05
基因工程载体的未来发展
基因工程载体的改进方向
提高载体稳定性
通过优化载体结构，降 低载体在细胞内复制过 程中的突变率，提高基
第四章 基因工程的质粒载体
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒:能自我转移
具有自主复制的基因，控制细菌配对和质粒接合转 移的基因。
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
第二代 酵母表达 穿梭质粒 体系
第三代 哺乳类细 病毒、脂质体 胞表达体系
第四代 基因直接 DNA本身 导入
细菌 酵母 培养动物细胞 生殖细胞、 体细胞、个体
（三）基因工程载体必须具备的条件：
※（1）有复制起点 ※（2）具有若干个限制性内切酶的单一识别位点 ※（3）具备合适的筛选标记 ※（4）具备合适的拷贝数目
（c）所示，F质粒无力帮助mob-突变体进行转移，其中F性须和转移装置虽已 形成，但ColE1 DNA并没有发生缺口。
（d）表示另一种具mob+表型并带有一个顺式显性突变的ColE1突变体，它缺 失了bom位点。在这样的寄主细胞中，虽然能够合成mob蛋白质，但由于不 能发生缺口，因此仍然不能够转移。
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切 限制酶切割之后，发生双链断裂形成 线性分子（IDNA），通称L构型
质粒载体种类
质粒载体种类
质粒载体是在基因工程中经常使用的一种工具，常见的质粒载体种类包括：
1. Shuttle质粒载体：能够在多个宿主生物中复制的质粒载体，通常用于在不同宿主中进行基因表达或基因转导的研究。
2. 表达质粒载体：用于将特定基因的DNA序列插入到质粒载
体中进行表达的载体，通常包括启动子、转录终止子和选择标记基因等。
3. 空质粒载体：通常只包含质粒的骨架结构，没有包含具体的基因，常用作对照实验的负对照。
4. 感受态质粒载体：这种质粒载体可与RNA或DNA片段融合，形成DNA-RNA复合体，通常用于RNA干扰实验。
5. 水平转移质粒载体：这种质粒载体能够在细菌中进行一种称为水平转移的传递，用于研究基因在不同细菌中的传播。
6. 呈味性质粒载体：这种质粒载体能够在菌落中形成代谢产物，在实验室中常用于菌落筛选。
以上是一些常见的质粒载体种类，不同种类的质粒载体在基因工程中扮演不同的角色，被用于不同的研究目的。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体
基因工程是一种用于改变和改造生物体遗传基因的技术，它是利用分子生物学技术提高生物性状的一种新技术。
在基因工程中，需要使用一种材料将外源基因投入细胞中，这种材料就是载体。
基因工程中常用的载体有以下三种：
1. 质粒载体. 质粒载体是一种比较常见的基因工程载体，具有较强的稳定性，它是一种质粒DNA，也称为质粒DNA，不是单链DNA，它是由细菌质粒的DNA结合其它分子，形成质粒DNA的结构，具有可复制性能，可以在细菌或动物细胞中复制，具有较强的稳定性。
2. 杆状病毒载体. 杆状病毒载体是一种比较常见的基因工程载体，它由病毒的全基因组和其它分子形成，用来转移外源基因到细胞中，可以把外源基因转移到细胞核或任何其它的地方，可以实现基因工程的目的。
3. 化合物载体. 化合物载体是一种新型的载体，它是由多种不同的分子组成的，可以将外源基因转移到细胞核或其它位置，并且可以把这些基因在细胞中表达出来，从而实现基因工程的目的。
基因工程载体
基因工程载体—质粒申小银222011********* 生物技术02班关键字：载体、质粒、自主复制、转移、多克隆位点、标记基因、不相容摘要: 70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。
对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。
那么质粒为什么能作为载体呢？质粒作为载体有什么优势？质粒的一般性质质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价闭合环状DNA分子，其大小常在2到300kb范围内，以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。
F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
某些既能独立地存在于细胞质中又能整合在染色体上的质粒称为附加体。
所有的质粒载体都有三个共同的特征：一个复制子、一个选择性标志和一个克隆位点。
复制子是含有DNA复制起始位点的一段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋白质的基因。
选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。
克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插入质粒内，而且并不影响质粒的复制能力，或为宿主提供选择性表型。
质粒的自主复制性质粒DNA 的复制是伴随宿主菌的胞周期, 以使菌群保持一定浓度质粒的方式进行的, 这可通过监测和调节起始频率, 使每细胞周期每质粒拷贝平均复制1 次的机制来实现。
复制控制元件由质粒编码, 以剂量依赖方式限制Rep 蛋白的水平、前导链引物的获得和活性ori 的数量, 抑制复制的起始。
质粒是细菌中能自主复制的染色体外遗传成分。
它们能为宿主提供一些额外的功能, 如抗药性和毒力等。
为与宿主稳定地共存并把代谢负担减至最低, 质粒必须控制自身的复制。
基因工程载体--质粒
• F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形 因子是雄性决定因子， 因子是雄性决定因子 成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使 成一种叫做性须（ ） 的结果， 经性须进入F 细胞。 细胞则变为F 细胞。 F+经性须进入 -细胞。F-细胞则变为 +细胞。 F因子可以通过接合作用自我转移，也能够 因子可以通过接合作用自我转移， 因子可以通过接合作用自我转移 带动寄主染色体一道转移。 F因子的这种 带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种 整合过程是可逆的。在一定条件下， 细 整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细 胞又可重新变为F+或F-细胞。 胞又可重新变为 细胞。 • 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全 基因工程多选用非接合型质粒， 角度考虑
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
环形质粒分子 环形质粒分子
环形染色体DNA 环形染色体DNA
大肠杆菌细胞 抗菌素抗性基因
质粒DNA 质粒
控制质粒DNA转移的基因 控制质粒DNA转移的基因 质粒DNA
质粒主要包括几个组成部分
• • • • • 复制子（ 复制子（reilcator） ） 复制起始位点(replication origin site) 复制起始位点 多克隆位点（ 多克隆位点（Polylink）(MCS) ） 辅助序列(COS位点等 位点等) 辅助序列 位点等 选择标记(LacZ,抗性等 抗性等) 选择标记 抗性等
基 因 工 程 载体
南 京 农 业 大 学
陈 溥 言
概
述
基因工程是利用酶学方法将不同来源的 DNA或cDNA，在体外切割、修饰、连接插 或 ，在体外切割、修饰、 入到不同目的的基因工程载体中，进行扩 入到不同目的的基因工程载体中， 增和表达，研究基因结构和功能， 增和表达，研究基因结构和功能，基因和 蛋白质关系的一种分子生物学技术。 蛋白质关系的一种分子生物学技术。
基因工程常用的三种载体
基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。
载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。
在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。
下面将详细介绍这三种载体的相关信息。
1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。
质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。
质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。
质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。
例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。
质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。
2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。
噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。
噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。
噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。
噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。
通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。
另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。
3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。
人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。
人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。
初一生物质粒载体的类型及应用
初一生物质粒载体的类型及应用生物质粒载体是一种常用于基因工程研究和应用的工具。
它可以作为DNA分子的携带者，将目标基因插入到细胞中，并通过复制和表达来实现基因传递和功能表达。
本文将介绍初一生物质粒载体的类型及应用。
一、基本概述生物质粒是细菌细胞中的一种非染色体的环状DNA分子，其大小从几千碱基对到几十万碱基对不等。
生物质粒可以在细胞内自主复制和传递，并且能够在宿主细胞中表达外源基因。
因此，生物质粒成为了基因工程研究和生物技术应用中广泛使用的载体。
二、类型及特点1. 质粒型载体质粒型载体是最常见的生物质粒载体类型之一。
质粒型载体通常具有自主复制和表达外源基因的能力，它们可以通过革兰氏阴性菌或者革兰氏阳性菌的转化方式被细菌宿主接收和传递。
质粒型载体通常包括一个选择性标记基因，以便快速筛选正常转化的细菌。
2. 病毒型载体病毒型载体是利用病毒作为基因载体的一种方式。
病毒型载体主要包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等。
病毒型载体可以通过病毒感染宿主细胞，将外源基因导入宿主细胞内并实现表达。
病毒型载体在基因治疗和疫苗研究中具有重要的应用价值。
3. 细胞质化型载体细胞质化型载体是通过将目标基因与带有细胞定位信号序列的质粒结合而形成的一类载体。
细胞质化型载体能够将外源基因转运入细胞质，然后基因能够进一步定位到细胞器或细胞核中。
这种载体多用于研究细胞定位及细胞器功能。
4. 人工染色体型载体人工染色体型载体是一类将外源基因嵌入到合成的染色体中的载体。
人工染色体型载体在基因治疗及基因组研究领域具有重要的应用前景。
通过人工染色体型载体，科学家可以将大片段的基因组DNA稳定地转移入宿主细胞，从而实现复杂基因组的研究和调控。
三、应用领域1. 基因工程研究生物质粒载体的用途十分广泛，主要用于实验室的基因工程研究。
通过载体介导的基因转移，科学家可以研究外源基因在生物体内的表达和功能，以及基因与表型之间的关联。
生物质粒载体在基因敲除、基因编辑及基因转录调控研究中发挥了重要的作用。
质粒载体种类
质粒载体种类质粒载体是在基因工程和分子生物学研究中广泛应用的一种工具，它可以用来携带和传递外源基因。
根据其特性和功能的不同，质粒载体可以分为多种类型，下面将介绍几种常见的质粒载体。
1. 表达质粒载体表达质粒载体是用于表达外源基因的载体。
它通常包含一个启动子、一个编码区和一个终止子。
启动子可以使外源基因在宿主细胞内得到转录和翻译，编码区则包含了外源基因的编码序列，终止子用于终止翻译过程。
常用的表达质粒载体包括pUC19、pET28a等。
这些载体具有高拷贝数和广谱宿主范围的特点，适用于大多数细菌和酵母的表达。
2. 克隆质粒载体克隆质粒载体用于将外源DNA片段克隆到质粒中。
它通常包含一个多克隆位点，用于插入外源DNA片段，以及一些选择标记，如抗生素抗性基因。
常见的克隆质粒载体有pGEM-T、pBluescript 等。
这些载体具有较高的拷贝数和较大的插入容量，适用于DNA 片段的克隆和扩增。
3. RNAi质粒载体RNAi质粒载体用于介导RNA干扰（RNA interference）。
它通常包含一个RNAi导体，其中包含外源基因的靶向序列，以及一个RNAi表达序列。
外源基因的靶向序列可以与目标基因的mRNA相互配对，从而介导其降解或抑制其翻译。
常见的RNAi质粒载体有pSUPER、pLKO等。
这些载体具有较高的RNAi效率和较强的基因沉默能力，适用于基因功能研究和基因治疗。
4. 荧光蛋白质粒载体荧光蛋白质粒载体用于表达荧光蛋白基因，常用于研究基因的表达和定位。
它通常包含一个荧光蛋白基因，如绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP），以及一个启动子和终止子。
外源基因的表达可以使细胞或生物发出荧光信号，从而实现基因的可视化。
常见的荧光蛋白质粒载体有pEGFP、pRSET等。
这些载体具有较高的表达效率和较强的荧光信号，适用于细胞标记和蛋白定位等研究。
5. 敲入质粒载体敲入质粒载体用于将外源DNA片段整合到宿主基因组中。
质粒在基因工程的用途
质粒在基因工程的用途质粒是指一类自主复制的DNA分子，常见于细菌细胞中，其大小通常为1-300kb。
质粒广泛应用于基因工程领域，具有许多重要的用途。
以下是质粒在基因工程中的主要应用：1. 基因克隆与表达：质粒是基因克隆常用的工具。
通过将目标基因插入质粒的适当位点，构建重组质粒。
然后可以将重组质粒引入宿主细胞，利用宿主细胞的复制、转录和翻译机制表达目标基因，并获得大量的目标蛋白。
这种方法可以用于蛋白质纯化、功能研究、药物研发等许多方面的工作。
2. 质粒载体：质粒可以作为基因的运输工具，将目标基因引入宿主细胞中。
一些质粒载体可以被广泛应用于多种细胞系和生物体，为实验研究和工业应用提供便利。
3. 基因突变和编辑：通过对质粒进行删减、插入等基因编辑技术，可以获得具有特定功能的质粒，用于研究基因的相关功能以及信号通路等方面。
此外，通过质粒载体引入Cas9和sgRNA等基因编辑工具，可以实现基因敲除、基因修饰等精确基因编辑，为研究基因功能和相关疾病提供重要方法。
4. DNA测序：质粒可以用于扩增目标DNA片段，为DNA测序提供足够多的样本。
质粒扩增后，可以通过各种测序技术对其进行测序分析，以获得DNA序列信息。
5. 基因扩增：质粒可以通过PCR等方法进行大规模扩增。
这种技术常用于扩增某一基因的多个拷贝，以获得足够的DNA样本，用于进一步的实验操作。
6. 亚克隆和分子标签：质粒可以用于亚克隆，即获得质粒载体的特定部分用于进一步研究。
此外，质粒上的特定序列可以与荧光蛋白等分子标签结合，为基因定位、表达监测等提供重要工具。
7. 基因转导：质粒可以用于基因转导，将目标基因导入特定的细胞或组织中。
这种技术可以用于研究基因功能和基因治疗等方面。
以上仅是质粒在基因工程中的一些常见用途，随着科学技术的不断发展和创新，质粒在基因工程领域的应用也在不断拓展与深化。
质粒的基本特性以及其在基因工程中的应用，为我们了解基因功能、探索生物学奥秘以及应用于医疗、农业、生物制药等实践提供了有力工具和技术支撑。
基因工程中的运载体——质粒
• 为什么基因工程需要运载体
• 原因如下：
• 1）使用适当的载体可以提高转导率； • 2）载体上有报告基因,可以报告转导是否成功； • 3）单独的目的基因片段如果没有能够重组进入受体细胞
基因组（这种重组频率很低）,那么会被受体细胞识别降 解； • 4）载体具有能在受体细胞内稳定存在,并自主复制的能力, 能保证目的基因在受体细胞内的复制.
载体质粒应具备的四个条件
(1) 能在宿主细胞内稳定保存并自我复制。
(2) 有一个至多个限制酶切点，以便与外源 基因连接
(3) 具有某些标记基因，以便进行筛选
（4）对受体细胞无害
标记基因存在的作用
• 1、“作为重组DNA载体的重要标记” • 举例：大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗
性基因，当这种质粒与外源DNA组合在一 起形成重组质粒，并被转入受体细胞后， 就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性 来判断受体细胞是否获得了目的基因。当 人们用选择培养基，来培养受体细胞时， 能够在培养基中存活下来的受体细胞就可 以认为是成功的导入了外源DNA，标记基 因就起作用了。
基因工程中的运载体
• 运载体（Vector）：
•
一是用它作为运载工具，将目的基因
转移到受体细胞中去；二是利用它在受体
细胞内对目的基因进行大量的复制。最终
在受体细胞中表达大量目的基因产物，经分离纯化被Biblioteka 们利用。• 常用的运载体：
质粒、噬菌体和动植物病毒两大类等
质粒
标记 基因， 便于 进行 检测。
质粒存在于许多细 菌和酵母菌等生物中, 是细胞染色体外能够 自主复制的很小的环 状DNA分子.
例题.不属于质粒被选为基因运载体的理 由是
D A、能复制
基因工程质粒载体特点
基因工程质粒载体特点基因工程质粒载体是基因工程中常用的一种工具，用于携带和传递外源基因到目标细胞中。
它具有以下特点：1. 大小合适：质粒载体通常是一个环状的DNA分子，大小在1kb 到100kb之间。
这个大小范围适中，既能容纳外源基因，又能被目标细胞较容易地摄取和转化。
2. 多拷贝数：质粒载体在细胞中一般有多个拷贝数，可以增加外源基因的表达量。
一般来说，质粒载体的拷贝数在10到100之间，可以根据需要进行调节。
3. 含有选择标记：质粒载体通常携带了一些选择标记，如抗生素抗性基因，通过在培养基中加入相应的抗生素，可以筛选出带有质粒的细胞。
这样可以方便地筛选出带有外源基因的细胞，而不带有质粒的细胞则会被抗生素杀死。
4. 含有起始子和终止子：质粒载体通常还含有起始子和终止子，这些序列可以使外源基因在目标细胞中得到正确的转录和翻译。
起始子用来启动转录过程，终止子用来终止转录过程。
5. 多克隆位点：质粒载体上通常有多个克隆位点，可以将外源基因插入其中。
这些位点通常是由特定的限制酶切位点组成，通过限制酶切割质粒和外源基因的DNA，可以将外源基因粘接到质粒上。
6. 容易提取和纯化：质粒载体通常可以通过简单的纯化步骤从细胞中提取出来。
一般来说，可以通过离心、酚/氯仿提取或商业化的质粒提取试剂盒来实现质粒的纯化。
7. 可以进行进一步改造：质粒载体可以通过基因工程技术进行改造，如插入或删除特定的序列，改变拷贝数等。
这使得质粒载体成为一个灵活的工具，可以根据实验需要进行定制。
基因工程质粒载体在基因工程和生物技术中发挥着重要的作用。
它不仅可以用于基因的克隆和表达，还可以用于基因编辑、基因治疗和转基因等领域。
质粒载体的特点使得它成为一种方便、灵活和高效的工具，为基因工程研究和应用提供了重要支持。
基因工程的质粒载体
E.coli E.coli 酵母细胞 哺乳类细胞
病毒载体 穿梭载体
动物细胞
动物细胞 和细菌
结构 环状 线状 环状 环状 环状 环状 线性染色体
线性染色体 环状 环状
插入片断 〈 8*
9 - 24kb
〈 10 kb 35- 45kb ≈300 kb
举例
pUC18/19 , T-载体 pGEM- 3z等 EMBL系列， Λ gt系列
OC L
SC
2 质粒DNA的转移
（1）质粒的类型：在大肠杆菌中的质粒，可 以分为：
接合型质粒: 能自我转移
非接合型质粒 不能自我转移
按接合转移功 能分类
非接合型质粒
主要基因
自主复制基因，产生大肠杆菌素基因
按抗性记号 分类
Col质粒
接合型质粒
自主复制基因，抗菌素抗性基 因
自主复制基因，转移基因，细 菌染色体区段
（5）分子量要相对较小 （6）在细胞内稳定性要高 （7）易分离纯化 ※表示载体必须具备的条件
（四）基因工程中常用的载体
基因工程中常用的载体有5类： 质粒（plasmid） 单链DNA噬菌体M13 噬菌体的衍生物 柯斯质粒（cosmid） 动物病毒（virus）
载体的种类和特征
质粒*
受体细胞 E.coli
M13mp系列
pJB8,c2RB, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV
Pel oBAC系列
100 - 2000 kb
PCYPAC1
100 - 2000 kb
〉 1000 kb
SV40 载体，昆虫 杆状病毒载体
pSVK3质粒，PBV, Ti质粒
第一节 质粒载体
一、质粒（plasmid） 是独立于染色体以外的能自主复制的 双链闭合环状DNA分子。
常见的基因工程载体种类和用途
常见的基因工程载体种类和用途你知道基因工程载体吗？听起来好像特别高大上，像是外星科技一样，但其实它就在我们身边，搞不好你今天吃的早餐里就有它的“身影”。
简单说，基因工程载体就是科学家用来在细胞里“传递”基因的“邮差”。
你肯定会问，为什么需要邮差？其实很简单，我们的基因就像是一本超级复杂的食谱，而载体就是帮忙把食谱送到目标细胞的“快递小哥”。
它们的作用就是帮助那些有价值的基因进到细胞里，进而制造出我们需要的蛋白质或者其他有用的物质，能帮我们做药、治病、改善农作物，简直就是科技的神奇魔法棒！好了，说到载体的种类，那可是五花八门。
最常见的就是质粒载体。
质粒其实就是细菌里的小小DNA环。
它们能在细菌之间自由复制和传递，好像是细菌界的小银行，存储着它们的“小秘密”。
我们通常把想要转入细胞的基因装在质粒里，然后让这些质粒进入目标细胞，好像给细胞“寄”了一份礼物。
这个方法非常常用，毕竟，质粒不挑细菌，而且操作起来也比较简单。
只要用一些小手段让细菌“吸收”这些质粒，基因就可以顺利进入细胞，开始工作了。
说到质粒，有一个特别重要的概念叫做表达载体。
它不仅仅是帮你传递基因，还能让细胞“理解”这个基因，开始制作你想要的蛋白质。
这种载体的背后有个小小的“剧本”，确保细胞能够按照设定的规则生产出目标蛋白。
所以，你能想象一下，表达载体就像是给细胞发了一张详细的操作手册，它不仅告诉细胞：“嘿，你现在要做这个。
”还告诉它：“怎么样做才是最完美的。
”想要生产大量的蛋白质？没问题，交给它就行了。
再来说说病毒载体。
你以为病毒都是坏家伙？不，其实有些病毒特别“配合”，它们天生就能把基因传送到宿主细胞里。
科学家们正是利用了这一点，设计了各种病毒载体。
比如，腺病毒和逆转录病毒这两个大明星，它们通过感染细胞，把目标基因送进去。
你可能会想，病毒不就是用来害人的嘛，怎么还用它们？它们被科学家“改造”过，变得安全多了，只传递基因，不会带来任何危害。
Ch04基因工程的常用载体-噬菌体和病毒载体
4. M13载体的构建 （1）选定克隆区域 1）M13基因间隔区（intergenic region, IG区） 514 nt (5501-6014)
4
M13 6.4 Kb
2）酶切位点 IG区内有两个 BsuI(HaeIII)（GG↓CC）位点 其余8个BsuI位点分布在其它部位
基因4
M13 IG区序列
第四章 基因工程载体
邢万金 内蒙古大学生命科学学院生物学系
第二节 噬菌体载体
一、单链噬菌体载体
单链环状DNA的丝状大肠杆菌噬菌体： M13、f1、fd 等噬菌体 pIII(5) pVIII(2700) pVII
pVI(5) +DNA
M13丝状噬菌体
pIX(5)
1. M13单链噬菌体DNA的基因组织
（3）常用的 pBluescript 载体 pBluescript SK（+/-）/pBluescript KS（+/-） SK：表示lacZ′ 的转录方向是沿MCS上的 SacI → KpnI KS：反向（ KpnI → SacI ，MCS相反） +（f1+）：单链复制起始方向背离 lacZ′， 能回收lacZ′ 的编码链（+） -（f1-）：能回收lacZ′ 的非编码链（-）
5. 对M13mp1载体的改进 M3mp2：在LacZα中引入单一酶切位点EcoRI M3mp1的LacZα的第6氨基酸有个EcoRI星号位点： ATGACCATGATTACGGATCCA TACTGGTACTAATGCCTAAGT O
O N N CH3 NH2
CH3 Eco RI* H2 N-Met Thr Met Ile Thr Asn Ser------N-甲基-N-亚硝基脲 l M13mp 2 ATGACCATGATTACGAATTCA 5 ′ ATGACCATGATTACGAATTCA5′ATGACCATGATTACGGATTCA----7250 bp GT TACTGGTACTAATGCTTAA 3 ′ TACTGGTACTAAhr Asp Ser------4
基因工程质粒载体特点
基因工程质粒载体特点基因工程质粒（Gene engineering plasmids）是被广泛应用于基因工程和生物技术领域的重要工具。
质粒是一种环状或线性的双链DNA分子，能够自主复制和传递基因信息。
以下是基因工程质粒的一些主要特点：1. 自主复制能力：质粒具有自主复制能力，不依赖于宿主细胞的DNA复制机制。
质粒含有一段或多段复制起始点（origin ofreplication，ori），能通过该起始点启动DNA复制过程。
2. 大小可变性：质粒的大小可以从几千到几百万碱基对不等。
大多数基因工程质粒大小在3-15 kb之间，这个范围使得将自己感兴趣的基因或DNA序列导入其中成为可能。
3. 可选载体：质粒可以用作可选的载体，供外源DNA在宿主细胞中复制和表达。
质粒通常包含一个多克隆位点（Multiple Cloning Site，MCS），可以容纳外源DNA片段并提供识别位点供限制性内切酶切割。
4.标识与选择性：质粒通常携带有选择标记位点。
这些标记可以是抗性基因，比如抗生素抗性基因，使得使用抗生素选择在培养基上生长的带有质粒的细胞，而无质粒的细胞则在抗生素存在的环境中死亡。
5.融合蛋白及表达：质粒可以被改造为含有目的蛋白的表达载体。
通常，在质粒上添加一个感兴趣的基因，这个基因会编码一个融合蛋白，该融合蛋白包含了目的蛋白和其他功能模块，如信号肽、表达增强子、抗性标记等。
这样的质粒可以更高效地表达目的蛋白。
6.宿主范围广泛：质粒能够在多种不同的细胞中复制，由于存在质粒复制和拷贝数的控制机制，它可以得到有效的复制。
7.相对稳定性：质粒在宿主细胞内相对稳定，继代传递时通常会被垒积传递给新的宿主细胞。
8.可选择的培养方法：质粒对于宿主细胞的生长没有任何损害，它们可以在细胞培养基中培养和维持。
9.易于操作：质粒可以通过使用限制性内切酶和DNA连接酶进行修改和重组。
这种易于操作的特性使得基因工程质粒成为构建基因工程目的的理想载体。
基因工程中常用载体及其主要特点
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
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pMB8 pMB1 pMB3
1/4361
R1 drd19
pBR313 pSC101 pMB9 pBR312
pBR322 pMB1 3145
1763
Ampr
2pBR322
RSF2124 Col E1
40 4153
86
EcoRI(4359) HindIII(29)ClaI(23) BamHI(375) SalI(651)
1900 2519
2pUC19
1745
pUC19 2686 bp
HindIII(233) SphI(243) PstI(249) SalI(251) AccI(251) HincII(251) XbaI(257) BamHI(263) SmaI (268) XmaI(268) KpnI(272) SacI(278) EcoRI(284)
5273
62
EcoRI(6645) ScaI(6440) SmaI(5354) ScaII(5151) BtgI(5148)
601
1190 Col E1 6646 bp
NgoMIV(2142) NaeI(2144) ClaI(2311)
5140
BclI(4646) SnaBI(4255) MluI(3898)
1gcgcccaata 51gcagctggca 101gcaattaatg 151tatgcttccg 201acacaGGAAA 251gtcgactcta 301TTTTACaacg 351cttgcagcac 401caccgatcgc 451tgatgcggta 501tggtgcactc cgcaaaccgc cgacaggttt tgagttagct gctcgtatgt CAGCTATGAC gaggatcccc tcgtgactgg atcccccttt ccttcccaac ttttctcctt tcagtacaat ctctccccgc cccgactgga cactcattag tgtgtggaat CATGattacg gggtaccgag gaaaaccctg cgccagctgg agttgcgcag acgcatctgt ctgctctgat
3. 1stringent plasmid 13 2relaxed plasmid 1060
1. RNACol E1 RNAII RNAIRNAII RNAI(108 nt) 5 3
RNAI RNAI RNAII RNAII Pol I
origin 3 5
RNaseH
RNAII(555 nt)
4StreptomycinStr
O CH3 HO HO HO H HO O O HN CH 3 O HO O N H2N OH N OH NH2 NH2 NH2
16S rRNAfmet-tRNA
Strr 30S
NH2 C C N HC O5' C C --P-O --P-O -CH 2 O O N O -P-O O N O- O- O H C 1' 4'C H H C C H OO= = = -
O
S
N H
O OH3C CH3 O OP O P O N H OOOH
N O N N
N
OH
O + N OHN
OH
Cl Cl O
Acetyl-CoA
O OH O P OO-
3kanamycinKan
NH3+ HO HO O HO HO O +H N 3 O O OH NH3+ OH OH NH3+
16 S rRNAmRNA
lacZ
pUC18
5GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT 3
EcoRI SacI KpnI BamHI XbaI SalI AccI HincII PstI SphI HindIII
SmaI XmaI
3pUC19lacZ_MCS lacZ_ lacZ_ promoter MCS(multiple cloning sites)
4pBR322
mobrop
5pBR322 pBR325: HaeII S1 4566 EcoRI
EcoRI(4779) EcoRI HindIII HindIII 86 BamHI SalIBamHI
5225
phage P1 Cmr DNA 4155ScaI (A/G) GCGC(T/C) (T/C)CGCG (A/G)
parA parA parA
parAparB parBparA
2. par
1. 1 1 ori 2 3
Plasmid cloning vector ori
2
GAATTC CTTAAG
ori
Ampr, Kanr, Tetr, Strr, Neor, Cmlr
2. 1 pSC101 9263 bp Col E1 6646 bp 2 pSC101 EcoRI, XhoI, PvuII, SacII, HpaIMlu I 3 pSC101 Tetr ColE1colicin E1
H+
H+
Mg2+
Tet R
Tet O
Tet A
3
(+)
(-)
4. 1pBR322 1977Boyer F. BolivarR.L. Rodriguez 1 ori pMB1Col E1 Ampr RSF2124Ampr Tetr pSC101Tetr
EcoRI
(Tn3)Ampr, Cmlr, Strr Sur, Kanr
DD PBP penicillin-binding proteins
-beta-lactamase Ampr- -
NH2 H N O
H S HN OH O
OOH CO2
2ChloramphenicolCml
OH OH Cl O+ N OHN O Cl
50S23s rRNA
Cmlr
NH2 O
885 442
287
pUCMCS lacZ pUC19
5 AAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCGGGGTACCGAGCTCGAATTC3
HindIII SphI PstI SalI AccI HincII XbaI BamHI SmaI XmaI KpnI SacI EcoRI
9256
8597 7916
XhoI(8188) PvuII(7794) SacII(7565) MluI(7182)
EcoRI(9262) HindIII(30) 86 BamHI(376) SalI(652) 1276 pSC101 9263 bp 4051 2936 HpaI
7242 6223 repA
ATP
N
O CH3
HO HO HO
OH H
3' 2'
H HO O O HN CH 3
O HO O N H2N
OH N OH NH2 NH2 NH2
5TetracyclineTet
CH3 HC HO CH3 3 N OH OH OH O NH2 O
OH O
30StRNAA
pBR322
H+ 2+ Mg Mg2+
PstI ScaI PstI
pBR322 pBR325 4361 bp 5996
SalI
1276 3140 1917 2521 2108
pAT153: mobrop pBR322703 bprop 1.5-3 86 3450
Sca II Sca Pst II Pst Eco EcoRI RI HindIII dIII Hin BamHI HI Bam Sal Sal II
2.pSC101 repA repArepA repA ori(250 bp)
par par A-T RNA Pol repA
repA
R1 R2 R3 R4 R5 R5
DnaA
mRNA(1kb)
repA
1. Partitioning parparAparB RNA Pol promoter par operon parB parB parB
ScaI(3844) PstI(3607)
3293
pBR322 4361 bp
1276 3138 2519
NdeI(2295)
21061915来自3pBR322 PstI
ScaI PstI EcoRI HindIIIClaI BamHI SalI
pBR322 4361 bp
+Tet
+Amp
4361 bp >10 kbDNA 1000~3000 copy mobmobilization
pUC19lacZMCS
atgaccatgattacgccaagcttgcatgcctgcaggtcgactctagaggat M T M I T P S L H A C R S T L E D ccccgggtaccgagctcgaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgac P R V P S S N S L A V V L Q R R D tgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccct W E N P G V T Q L N R L A A H P P ttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaa F A S W R N S E E A R T D R P S Q cagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctcctt Q L R S L N G E W R L M R Y F L L acgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatc T H L C G I S H R I W C T L S T I tgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgct C S D A A