临床生化检验试剂盒性能评价试验线性范围试验
体外诊断试剂分析性能评估-线性范围
线性范围是指检测方法测量待检测物质时，能够提供一段具有线性关系的测量范围。而 灵敏度则是指检测方法的最小检测物质的能力。
线性范围的重要性
质量控制
其它指标如准确性、精密度等都建立在线性关系的基础上，因此线性范围的确定对质量控制 至关重要。
可靠性
如果测试物质的浓度高于线性范围，分析结果可能会低于实际值；如果浓度低于线性范围， 则可能会高于实际值，影响结果可信度。
发展前景
未来，该技术将继续发展， 以更好地满足人们对生活质 量和健康的需求。
Im proving the m etho d
改进分析方法，增加线性 范围的可靠性和精度。
M etho d com parison
比较分析方法的不同，选 择最适合的实验方法，以 确定线性范围。
总结
方法的优点
确定分析方法的线性范围， 保证分析结果的可靠性和可 比性。
应用价值
该方法广泛应用于医疗、环 境保护、食品安全等领域。
确定线性范围，分析误差和 数据可靠性。
实验条件设置
1
参比物质的选择
根据待测分析物质，选择与目标物
样品组成的影响
2
分析范围相近的参比物质，评估分 析方法的线性范围。
研究待测样品中其他成分对分析结
果的影响，以找到影响线性范围的
因素。
3
实验条件的确定
根据分析物质的特点，选择合适的 实验条件，如适当的反应时间ห้องสมุดไป่ตู้温 度。
数据分析及结果解读
标准曲线的绘制
绘制样品浓度与测量结果的标准曲线，并计算回归方程。
测定未知样品浓度
使用标准曲线计算出未知样品的浓度。
结果的解读
临床生化检验试剂盒性能评价试验—线性范围试验
包栝原包装和工作液在指定条件下稳
定性
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4
线性范围实验
目的与要求 掌握检测临床生化检验商品试剂盒测定线性范
围的原理和方法,计量反应曲线的绘制,统计 方法和性能评价;熟悉线性范围变窄的原因; 了解影响线性的因素.
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原理
使用不同浓度的葡萄糖标准溶液,用GOD-POD法 试剂测定各自的吸光度,以标准浓度为横坐 标,以其对应的吸光度为纵坐标,在方格纸上 作图.即可绘制出一条直线,即剂量反应曲线 (dose-response curve).
值，求估计值Y时，可直接输入X值，随后按 【Y】即可求得；若已知Y值求估计值X，则 输入Y值后按【INV】【X】即可求得X值．
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12
`
① 操作进入LR状态，清除内存【MODE】【2】 【INV】
【AC】 ②输入原始数据X 【X▫.Y▫】， Y 【DATA】 ③输出结果 回归方程的截距【INV】【A】 回归系数【INV】【B】 相关系数【INV】【r】 【A】
2.酶促反应时间曲线或化学反应速度时
间曲线观察.
以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，观察 动态期（包栝延迟期，线性期，混和期）和平衡期 出现，持续和终止的时间，分析有关性能指标。
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3
临床生化试剂盒性能指标主要有
3.稳定性
是指试剂盒在规定条件下储存仍保持其 性能指标的期限
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血糖与GOD-POD试剂剂量反应曲线的 制作
加入物
标准管
5
葡萄糖标准液(ul) 0
4
16 20
8
临床生化检验试剂盒性能评价试验线性范围试验
临床生化检验试剂盒性能评价试验线性范围试验线性范围是指在一定的浓度范围内，检测结果与样本浓度之间呈线性关系的范围。
线性范围试验的目的是确定试剂盒的线性范围及其上下限。
线性范围的确定对于准确测量样品浓度非常重要，因为如果超出了线性范围，测量结果将不准确。
试验前需要准备一系列不同浓度的样品，通常使用稀释法制作。
然后依次使用这些样品进行检测，记录每个样品的测量结果。
在绘制一个标准曲线时，可以将样品的测量结果作为纵坐标，样品的浓度作为横坐标，在纸上标出一系列点，并通过这些点拟合一条直线。
这条直线称为标准曲线。
标准曲线的斜率和截距可以反映试剂盒的灵敏度和误差。
斜率表示单位浓度变化时，测量值的变化情况，斜率越大，灵敏度越高。
截距表示零浓度时的测量值，截距越小越接近零浓度。
通过分析标准曲线的相关系数可以评估试剂盒的线性程度。
相关系数越接近1，线性程度越好。
一般认为，相关系数超过0.99，即可认为试剂盒满足线性要求。
在进行线性范围试验时需要注意以下几个方面：1.样品浓度的选择：应根据所测定物质的生理浓度范围来选择样品浓度，以保证测试的实用性。
2.样品的制备与存储：样品的制备应精确控制，避免因稀释或浓缩不准确而影响试验结果。
样品的存储应避免长时间曝光于大气中，以免发生化学反应导致样品浓度的变化。
3.试剂盒的选择：应根据所测定物质的特性和预期的分析结果，选择适宜的试剂盒进行测试。
4.试剂盒的操作：应按照试剂盒说明书的要求进行操作，严格控制操作步骤和时间，以减少试验误差产生的可能性。
5.数据处理和分析：应根据所测定物质的特性和测量结果，采用适当的统计方法进行数据处理和分析，并在数据分析报告中详细说明试验设计、方法和结果。
通过进行线性范围试验，可以确定试剂盒的线性范围及其上下限，为临床生化检验提供可靠的测试数据，为临床诊断提供准确的参考依据。
同时，线性范围试验还可以评估试剂盒的稳定性和重复性，为试剂盒的质量控制提供参考依据。
体外诊断试剂分析性能评估-线性范围
1.2实验样本的制备方法
（1）不同浓度水平的样本可通过将高浓度样本与低浓度样本进行倍 比稀释得到，注意在进行液体吸取时应选择精密度与准确性好的移液 装置。制备时应将样本完全混合并避免蒸发或其他使样本变质的情况。 每份样本的浓度与体积单位应统一。 （2）如果高/低浓度血清的值未知，可将每种血清编码，用编码代表 每个血清的相对浓度。对于等浓度间隔样本，可用连续整数（如1、2、 3、4、5）代表连续样本。进行数据处理时可用样本号代替X值。 （3）样本的特殊处理：在无法得到适用的人血清时，需对样本进行 一些特殊处理以满足实验要求。这些处理过程包括稀释、加入添加物 或透析、热处理等，无论进行何种处理均应以保持基质恒定为基本原 则。在评价报告中应对所使用的稀释液、添加物、溶剂等的材料来源 加以注明。 样本稀释液应选用由厂家推荐或经实验室证明可使用的产品，如 可采用5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。 欲提高样本浓度时可在样本中添加分析物纯品。在添加物为溶液 状态时，应注意添加液体对样本的稀释作用（小于10%）并注明所用 溶剂。
事业发展部-刘会娟
一、概述 二、定义 三、研究时间 四、线性范围评估的基本原则 五、线性范围的评估及数据处理方法
一、概述
线性范围评估资料是评价拟上市产品 有效性的重要依据，也是产品注册所需的重 要申报资料之一。
二、定义
线性范围：是某一方法的校准曲线的直线部 分所对应的待测物质的浓度（或量）的变化 范围。
样本选择
EP6一A中建议应尽可能按以下顺序进行样本种类的选择：①病人混合血清；②用适当 稀释液稀释的病人血清；③添加分析物的病人样本；④用处理过的低浓度物质或处理过的 血清物质稀释的病人血清；⑤商业质控品，校准品／线性物质；⑥使用生理盐水稀释的样 本；⑦稀释不足或过度稀释的商业质控品；⑧水溶液；⑨其他溶剂的溶液。
临床生化检测线性范围的应用及临床意义
临床生化检测线性范围的应用及临床意义临床生化检测在现代医学领域中占据着重要地位，它可以通过测定人体内不同物质的含量，帮助医生了解患者体内发生的生化反应，并根据检测结果进行疾病诊断和治疗监测。
其中，线性范围是生化检测的重要概念之一，它对于保证检测结果的准确性和可靠性具有重要意义。
什么是线性范围？在进行生化检测时，常常需要通过测定样品中物质的浓度来反映生化反应程度。
而所有仪器和试剂在测定物质浓度时都存在一个线性范围，即在这个范围内，仪器可以准确测量物质的浓度，而超出这个范围，仪器的测量结果就不再准确。
例如，某种细胞指标的正常范围为100-1000，那么如果细胞指标的浓度小于100或者大于1000，仪器就无法准确测量。
临床生化检测中线性范围的应用非常广泛。
首先，线性范围可以用于疾病诊断。
通过测量某些指标物质在患者体内的浓度，医生可以判断该指标物质是否处于正常范围内。
例如，糖尿病患者的血糖浓度常常会升高，而通过测量血液中的葡萄糖浓度，医生可以判断患者是否患有糖尿病。
其次，线性范围还可以用于疾病治疗监测。
在疾病治疗过程中，医生通常会选择一些指标物质作为治疗效果的监测依据。
通过定期检测这些指标物质的浓度变化，可以了解患者是否达到预期的治疗效果。
举个例子，对于一些患有高血压的患者，医生通常会测量其血压值，并根据血压值的含量来调整药物的用量。
此外，线性范围还可以用于判断检测结果的可靠性。
在进行生化检测时，为了保证检测结果的准确性，常常需要设置一些标准物质，通过测量标准物质的浓度来判断仪器的准确性。
而这些标准物质的浓度往往可以在线性范围内准确测量，如果测量结果与已知浓度不相符，就可能存在仪器故障或者试剂失效等问题。
因此，线性范围对于保证检测结果的可靠性非常重要。
总的来说，临床生化检测线性范围的应用及临床意义非常广泛。
它可以用于疾病的早期诊断、治疗效果的监测和检测结果的可靠性判断。
通过充分理解和应用线性范围，我们可以更准确地了解患者体内发生的生化反应，及时进行疾病的诊断和治疗。
临床生化检验试剂盒性能评价试验—线性范围试验方案
临床生化检验试剂盒性能评价试验—线性范围试验方案线性范围试验旨在评价试剂盒在一定的浓度范围内是否能够提供准确、可靠的测量结果。
线性范围是指试剂盒能够正常工作的浓度范围，通常以
正常生理范围为基础进行选择。
试验方案包括以下几个步骤：
1.准备样本：选择一种或多种具有不同浓度的标准物质，可以是纯品、混合物或者浓度已知的样本。
确保选取的样本覆盖到试剂盒的线性范围。
2.样本加样：按照试剂盒使用说明书中的方法，将不同浓度的样本加
入到试剂盒提供的反应池中。
同时还可以加入一定浓度的质控品作为质量
控制。
3.反应：按照试剂盒使用说明书中的方法，将试剂盒放入适当的温度
和时间条件下进行反应。
4.测量：使用相应的测量仪器对反应后的样品进行测量。
注意，为了
减小误差，每个样本应重复测量多次。
5.数据分析：根据测量结果，绘制标准曲线。
标准曲线是通过浓度与
测定值之间的关系绘制的，其中浓度为横坐标，测定值为纵坐标。
可以使
用常见的回归分析方法进行数据处理，如线性回归或非线性回归。
6.评价：通过标准曲线的拟合度来评价试剂盒的线性范围。
通常使用
相关系数（R）和决定系数（R^2）来评估标准曲线的拟合度。
相关系数越
接近于1，表明试剂盒的线性范围越好；决定系数越接近于1，表明试剂
盒的拟合度越好。
线性范围试验是评价试剂盒性能的重要指标之一、通过此试验，可以
验证试剂盒在标准浓度范围内测定结果的准确性和可靠性。
同时，线性范
围试验结果还可以用于确定测定结果的限制范围，有助于指导临床医生进行判断和诊断。
生化试剂盒线性范围高值的简单评价方法
【 键 词 】 生化 试 剂 盒 ； 线 性 范 围 ； 高值 ； 评 价 方 法 关
Ｄ Ｉ １． ９ ９ｊｉ ｎ １７ —４ ５ ２ １ ． ３ ０８ 文 献标 志码 ： 文章 编 号 ：６ ２９ ５ （０ ２ １—６ ８０ Ｏ ：０ ３６ ／．ｓ ．６ ２９ ５ ．０ ２ １． ８ ｓ Ｂ １ ７—４ ５ ２ １ ）３１ ７—２ 临床 检 验 工 作 中 经 常 碰 到 需 要 对 新 试 剂 盒 进 行 考 察 的 问 题， 而线 性 范 围是 生 化 试 剂 的一 个 重 要 指 标 Ⅲ 。确 定 线 性 范 围 的 实 验 需 要 由 低 到 高 一 系 列 浓 度 的 样 本 ， 中高 浓 度 的样 本 一 其 般 是 通 过 临 床搜 集 或 者 通 过 普 通 浓 度 的 样 本 添 加 纯 物 质 来 获 得 ， 者 具 有 一 定 的难 度 ， 者 成 本 较 高 ， 且 获 得 起 来 也 未 必 前 后 而 方 便 。因 此 需 要 建 立 一种 方 法 ， 以简 单 有 效 地 对 试 剂 盒 的线 可
３ １ 方 法 确 认 和性 能 验 证 对 于 配 套 的 检 测 系 统 ， 验 室 在 ． 实 使用前应该对 Ｆ ＡＭＥ进行 性 能 验证 。 目前 大 多数 实 验 室 采 用
３ ４ 全 面质 量 控 制 除 此 之 外 ， 验 室 还 应 该 对 Ｆ ． 实 ＡＭＥ检 测 仪的各个环节严格把关 ， 确采集 、 正 处理 和保 存 标 本 和试 剂 ， 建 立 仪 器 的 标 准 操 作 程 序 和 常 规 的 质 量 控 制 程 序 ， 仪 器 检 测 的 对 相 关 人 员 进 行 培 训 ， 悉 仪 器 性 能 ， 解 常 见 问题 的 解 决 方 法 熟 了 和仪 器 的 日常 维 护 保 养 。对 仪 器 的 检 测 进 行 全 面 质 量 控 制 。
临床生化检验常用质量评估指标
临床生化检验常用质量评估指标1.精密度：精密度是评估分析方法的复现性和重现性的指标。
它反映了在相同的条件下，同一样本在不同的时间、不同的实验室或不同的仪器上进行检验时，结果的一致性。
常用的评估精密度的方法包括重复测定同一样本，计算相对标准偏差（RSD）或方差。
2.准确度：准确度衡量了分析方法的测量结果与参考值或真实值之间的接近程度。
它可以通过与金标准方法或已知浓度的样本进行比较来评估。
常用的评估准确度的方法包括偏倚分析（bias analysis）、回归分析（regression analysis）和协议试验（protocol trial）。
3.线性范围：线性范围是指方法测量结果的有效浓度范围。
临床生化检验中，很多指标的浓度通常是一个数量级的变化，因此对于线性范围的评估十分重要。
常用的评估线性范围的方法包括制备一系列已知浓度的样本，并绘制浓度与测量结果之间的曲线。
线性范围通常通过斜率和截距来表示。
4.灵敏度：灵敏度是指方法检测到样本中的目标物质的能力。
它通常用最低检测限（LOD）或最低可测限（LOQ）来表示。
LOD是指方法可靠地检测到目标物质的最低浓度，而LOQ是指方法可以进行可靠测定的最低浓度。
5.特异性：特异性是指方法能区分目标物质与其他干扰物质的能力。
在临床生化检验中，特异性非常重要，因为样本中可能存在多种物质，而且有些物质的浓度非常接近。
6.稳定性：稳定性是指在一定条件下，样本的物质浓度是否会发生变化。
稳定性评估可以包括温度稳定性、时间稳定性和冻融稳定性等方面。
它可以通过存储样本在不同时间、温度和条件下的测量结果来评估。
7.参考范围：参考范围是指背景人群中正常人的测量结果的范围。
参考范围的确定可以通过大规模的人群调查和统计分析来获得。
参考范围的确定对于判断检验结果的异常与否具有重要意义。
综上所述，临床生化检验常用的质量评估指标包括精密度、准确度、线性范围、灵敏度、特异性、稳定性和参考范围等。
临床生化检验方法与试剂盒评价
对
第第181页8页
第二节 临床生化检验方法的性能评价
一 方法学的性能指标 二 方法学性能评价的内容 三 方法学评价试验 四 临床生物化学方法学性能判断
第19页
可靠性
一 方法学性能指标
准确度 精密度
实用性
方便性 安全性 可测范围
经济性 简单快速
第20页
准确`度
准确度（accuracy）的传统定义是指测定值 与“真值”的接近程度。是指一次测定的结果 与被测物真值的接近程度。
①制订分析质量目标 ②仪器性能评价 ③确定对比检测系统
④初步评价检测系统
⑤比对
步内
骤容
可接受性判断
第16页
允许不精密度、允许偏倚和 允许总误差
准确度和精密度
参考系统或 公认的测定系统
性能指标
40-100例
测定系统的关键要素
方法学
试剂配方 和来源
操作程序
测定系统
仪器
第17页
校准品
全球性可比性战略实施
第9页
图21-1 各级参考物质和校准品的关系及其量值传递过程
第10页
三 量值溯源
溯源性
溯源性(traceability）是指通过一条具有规定不确 定度（uncertainty）的不间断的比较链，使测量 结果或测量标准的值能够与规定的参考标准（通 常是国家或国际测量标准）联系起来的特性，称 为溯源性。其不间断的比较链称为溯源链。
常规校` 准品
校准（calibration）指的是对由仪器、方法和试 剂所组成的检测系统的校准过程。 电解质、酶类、其他生化指标应合理选择校准品
第7页
标准品 校准品 质控品
一级标准品用高纯化学物质（纯度>99.98%）直接通过称重 配制的溶液，是唯一值。一般由国家标准计量局出具证书。 二级标准品某种成分的浓度可用公认的参考方法测定。由参 考实验室或权威学术组织出具证书，如SRM、BCR、IFCC。
检验科性能验证方案(仅供参考)
批间精密度：浓度分别处于正常和病理水平的混合新鲜临床标本，按照临床标本相同的 检测方法（或将室内质控品按照常规标本的方法一样测定，测定结果在遵照厂商参数不出控 的前提下） ，同批次内检测混合的新鲜临床标本 20 次，同一批号室内质控品某一时间段（至 少 20 天）的室内质控数据逐步累积最终得出均值、标准差。 1.1.3 结果判断
其中： D：表示总共检测天数(D=5)； n：单个样本每天重复检测的次数(n=4)； xdi：每个样本每天四次单独检测的结果； xd：每个样本每天四次检测结果的算数均数； xt：单个样本每天检测结果的算数均数的算数均数。 4.1.3 结果判断（可参考）
4.1.3.1 于批内精密度的判断，具体的计算和判断过程： 1)按照下述公式计算出批内精密度的自由度 ν。
1.2 正确度 1.2.1 卫生部临检中心室间质评含盖的项目，则以卫生部临床检验中心室间质评结果为
准；成绩在 80%者即为验证通过。 1.2.2 卫生部临检中心室间质评未涉及的项目，通过仪器之间的比对来实现，以参加卫
生部临检中心的室间质评的作为比对基准仪器，其最近 1 次参加卫生部临检中心的室间质评 结果。采用 5 个患者的样本，样本浓度水平尽量覆盖测量范围，包括医学决定水平。计算在 医学决定性水平下的系统误差（偏倚%） ，偏倚= ︱测定值-靶值︳/靶值*100%，偏倚%应<1/2 CLIA’88 或卫生部临检中心室间质评最大允许误差，80%以上的数据符合以上要求即为通过。 成绩在 80%以上者即为验证通过。 1.3 线性范围 1.3.1 目的：在确定某项目检测上限的同时检测其检测上下限是否呈线性关系，从而保
D：表示总共检测天数(D=5)； n：单个样本每天重复检测的次数(n=4); 因此，按照我们的验证方案，批内精密度(Swithin)的自由度为 15。 2)按照下述公式计算出 C 值百分点。
体外诊断试剂分析性能评估线性范围
C
符合要 求
该方法 呈线性
停顿
缩小范围？(5.3.3) 能够
不行
该方法是非线 性
舍去非线性显
著处低或高值
B
点(5.3.3)
停顿
第14页
举例: Ca检测: 试验室准备样本和对6个不一样浓度水平标本进行
重复测定，假定试验室设定Ca重复性和非线性误差均为
0.20mg/dL
标本
测量值1
测量值2
均值
1
4.7
如非线性系数b2.b3与0比较，经t检验（p>0.05）， 存在线性关系，不精密度满足条件时，则分析完 成。 如二次多项式模型非线性系数b2，或三次多项式 模型b2或b3中任一个与0比较，有显著差异 （p<0.05），则该组数据存在非线性。
体外诊断试剂分析性能评估线性范围
第13页
设计方法和确定误差目 标（非线性和重复性） (6.3)
138
138.5
3
269
273
271.0
4
337
343
340.0
5
409
404
406.5
从表中数据能够看出，没有显著离群值，但在低水平浓度处重复性很好，
而在高浓度水平处两次测量结果差异较大。重复性差异检测以下:
标本号 1 2 3 4 5
均值 26.35 138.5 271.0 341.0 406.5
体外诊断试剂分析性能评估线性范围
图C4: Ca线性评价差值点图—1-5稀释
第20页
举例
在试验室内准备五个等距浓度标本测定IgM，每标本重复测定两次。假定 试验室设定重复性和线性允许误差范围分别为2%和5%。随机次序测试结 果以下:
临床生物化学检验试剂盒的性能评价
临床生物化学检验试剂盒的性能评价第三节一临床生物化学检验试剂盒的性能评价临床生化检验试剂盒是用化学和生物化学反应的原理二用于完成一个特定体外诊断检验,而包装在一起的一组组分三试剂盒组分可包括抗体二酶二缓冲液二稀释液二校准物二控制物或其他物品和材料,用于体外测定人体体液中的化学和生物化学组分来获取临床诊断信息三它是体外诊断试剂(i nv i t r od i a g n o s i s r e g e n g t s)中的一大类,根据我国国家食品药品监督管理局(S F D A)的‘医疗器械分类目录“,归为临床检验分析仪器类,按医疗器械管理三体外诊断试剂按风险级别进行分类分级管理,Ⅲ二Ⅱ二Ⅰ类产品分别由国家二省级二市级药品监管部门审批,临床生化检验试剂盒多属Ⅱ类产品三一二临床生物化学试剂盒的质量标准2006年制订了‘临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求“,规定了临床化学体外诊断试剂(盒)质量检验的通用技术要求,包括术语和定义二分类和命名二要求二试验方法二标签和使用说明二包装二运输和贮存三适用于医学实验室进行临床化学项目定量检验所使用的体外诊断试剂(盒)三该标准是目前临床化学体外诊断试剂(盒)注册审批的标准三二二临床生物化学检验试剂盒的分类根据其物理性状,可以分为干试剂和液体(湿)试剂,干试剂根据制备工艺不同分为干粉二冻干二片剂二干试剂条等三干试剂的优点是运输方便二保存期长,其缺点是组分均一性较差,瓶间差较大,分装过程中的称量误差和复溶时加入水量的误差,都导致瓶间的不均一性,水质的优劣对试剂的稳定性和测定结果的可靠性有相当大的影响三除干试剂条应用于干式生化仪外,其他干试剂已经逐渐被淘汰三液体试剂因组分高度均一二瓶间差小二测定重复性好二不需复溶直接使用等优点,是目前使用最广泛的剂型三液体试剂主要分为单液体型和双液体型三(一)单液体型单液体型特别适用于半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪三半自动生化分析仪和小型自动生化分析仪因缺试剂瓶位置或试剂瓶位置少,而适用单试剂三从技术角度讲,要保证足够的试剂盒稳定性,在所有剂型中,单液体型试剂盒对稳定技术的要求最高,尤其是酶法分析试剂盒,将酶二辅酶二色原等组合为单一试剂,稳定技术更高三但抗干扰能力无法与双液体试剂比拟三(二)双试剂液体型大多数中二大型生化分析仪有两根试剂针,使用双试剂不会影响分析效率三有时为了稳定性的需要,试剂盒内含有三个试剂,临用前将某两个试剂混合,再按双试剂使用三因具备优点多,是目前主流剂型三1.稳定性能好一与单一液体试剂相比,可以分拆为两个试剂,可采用不同的缓冲体系(离子强度和p H都不同),混合后为最适p H;其稳定技术容易得多,比如,可以将酶和辅酶与色原分开,也可把辅助酶与指示酶分开三2.可消除样品自身空白一可设计成第一试剂与样品不发生化学和生物化学反应,两者混合后读取第一个吸光度,在两点平衡法中可扣除该吸光度,相当于做了一个空白对照三所以,原来传统用单一试剂的方法,如双缩脲法测定总蛋白二溴甲酚绿法测定清蛋白等,都特地分拆成两个试剂,第一试剂的作用等同于蒸馏水,第二试剂经过浓缩,混合后各组分含量同传统的单一试剂,起到消除样品空白的作用三3.提高抗干扰能力一①消除内源性和外源性干扰:首先让试剂Ⅰ与样品中的干扰物质反应,一定时间后再用试剂Ⅱ启动真正的测试反应,最大程度地消除内源性和外源性干扰三如消除甘油对T G二丙酮酸对A L T/A S T二N H4+对尿素的干扰等三②消除杂酶的干扰:如G L D H对待测脱氢酶的干扰三③消除T r i n d e r s反应负干扰,在试剂Ⅰ中的氧化剂与样品中胆红素二维生素C 氧化酶与样品中的维生素C进行预反应三4.预反应一试剂Ⅰ与样品预反应,有足够的时间让辅基或辅酶对酶进行复活,免疫抑制法中使抗体对某一抗原的抑制更彻底三(三)其他剂型多项同测组合试剂是指两个相似的项目在同一反应杯中进行先后测定,其最大的优点可以减少试剂仓位三如直接胆红素和总胆红素二胆固醇和T G的组合试剂等三浓缩试剂则在测定之前,自动生化分析仪先稀释,优点是在工作量繁重时可以减少添加试剂的次数三三、临床生物化学试剂盒的性能指标及评价临床生化试剂盒的性能指标包含了所有方法学的性能指标,并增加了稳定性能的指标三一般来讲,采用化学反应原理的试剂盒稳定性较好,而酶二辅酶二底物二抗体等多不稳定,增加了对试剂盒稳定性的难度三根据‘临床化学体外诊断试剂(盒)通用技术要求“,参考‘临床化学体外诊断试剂(盒)产品技术审评规范“(2011版),试剂盒的性能指标及评价方法如下:(一)试剂空白吸光度用蒸馏水做空白,用指定的空白液加入试剂作为样品测试,是判定试剂质量的一个有效指标三对以N A D H做底物的负反应试剂盒,因N A D H在中性缓冲体系不够稳定,规定其空白吸光度需>1.0,目的是保证足够量的底物N A D H,保证足够的线性范围,避免底物耗尽三以色素原底物的试剂盒,其不稳定因素主要来自于底物三因色素原底物容易自身水解,因此也需要规定其空白吸光度不能超出一定范围,以防止底物不足三对以T r i n d e r s反应原理的试剂盒,防止发色基团的氧化,规定空白吸光度需<0.05;因较高的空白吸光度会导致线性范围变窄,重复性变差三(二)试剂空白吸光度变化速率对于速率法试剂盒,用指定的空白液加入试剂作为样品测试时,测定试剂空白吸光度变化(ΔA/m i n),用来检查试剂在工作状态下的稳定性三但事实上,试剂空白吸光度变化速率无法反映试剂盒的稳定性,因为试剂盒的稳定期一般要求一年以上三若每分钟有明显的吸光度变化,按0.001/m i n计算,37?孵育一天,其总的吸光度变化达到1.44,说明试剂早已失效三试剂空白吸光度变化速率主要反映干扰程度和仪器的稳定性,如反应杯的洁净程度及分析仪的交叉污染严重程度三但若某个试剂中有杂酶,若两个试剂混合后会造成试剂空白吸光度变化速率过高,所以也是评价试剂盒质量性能的指标三(三)分析灵敏度用吸光度差值(ΔA)或吸光度变化(ΔA/m i n)来表示单位浓度的被测物反应所引起的信号变化,其含义类似摩尔吸收系数三分析灵敏度不是越高越好,以适合待测物检测范围为原则三如胆固醇二葡萄糖二尿酸二肌酐的测定方法都用T r i n d e r s反应,血液中这些物质的含量相差数倍甚至几十倍,应使用不同灵敏度的发色剂三对酶法分析试剂盒而言,酶试剂不稳定,可导致灵敏度下降;对免疫比浊法而言,抗体效价下降也会造成灵敏度下降三分析灵敏度一般用于批间比较,较能反映制造商的配方二原料的一致性三(四)线性范围取高浓度样品和低浓度样品按不同比例混合成5个浓度做线性试验三试剂(盒)的线性范围越宽,临床复测几率越小,但与样品/试剂比例成反比三国家对线性范围的要求较低,但要求线性相关系数r应?0.990,同时对线性偏差也作出规定三(五)重复性用质量控制血清3?3(3个批号,每个批号取3瓶)测试批间差,较能反映制造商的配方二原料的一致性三干粉或冻干试剂还需测定批内瓶间差,测定同一批号的试剂20瓶,用变异系数(C V)来表示三(六)准确度1.相对偏差一直接用试剂盒测定参考物质(平行3次),评价测定均值与靶值的偏离程度三如无参考物质,可用由参考方法定值的高二中二低三个浓度的人混合血清,用试剂盒平行测定3次,计算均值与定值的相对偏差三2.回收试验一测定试剂盒若有标准品,也可用回收率衡量比例系统误差三3.比对试验一既无参考物质二参考血清,也无标准品,也可用比对试验来验证准确度三参照E P9A2的方法,用不少于40个在检测浓度范围内不同浓度的人血清样品,以公认的分析系统作为比对方法,用线性回归方法计算两组结果的相关系数三(七)稳定性1.效期稳定性一取已到效期的试剂盒按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价三可作为审批的依据,但对该批次的试剂盒的稳定性意义不大三2.热稳定性试验一对同批次试剂盒稳定性目前没有很好的评价方法三生化试剂盒一般置2~8?保存,为了快速有效地评价试剂盒的稳定性,可以用加速试验来估计三即将试剂盒置于37?孵育箱,每天按以上评价方法对试剂盒性能指标进行评价三根据蛋白质在不同温度下稳定性换算公式估算,37?孵育一天相当于2~8?一个月三但因为试剂盒成分复杂,各种酶的耐热性有很大差别,所以只能对该批次试剂盒的稳定性做大概估计三3.开瓶稳定性一也称在仓稳定性,是指试剂盒置分析仪试剂仓在使用过程中的稳定性三试剂曝露于空气会影响缓冲体系的p H等,仪器的交叉污染也会影响使用中的稳定性三在临床实际工作中,更关注开瓶稳定性三评价方法是每天记录空白二校准和质控品的吸光度,以及绘制质控图,按质控规则判断三(八)临床试验完成以上试剂盒的性能指标评价后,还需按照‘体外诊断试剂注册管理办法“(试行)及‘体外诊断试剂临床研究技术指导原则“进行临床试验三1.临床试验文本一要有临床机构伦理委员会确认的文件;有两家省级医疗卫生单位完成临床研究的研究报告三2.临床样本比较试验一新诊断试剂(盒)应与该诊断疾病的金标准针对临床样本进行盲法同步比较; 已有同种批准上市的试剂(盒)应与已批准上市产品针对临床样本进行比对试验三3.临床样本的要求一综合不同地区人种二流行病学背景二病原微生物的特性等因素选择研究单位,症状典型和非典型的,一般临床研究的总样本数至少为200例,新诊断试剂(盒)1000例三四、临床生物化学试剂盒的发展趋势我国使用临床生化试剂盒的历史只有20多年,分析仪的普及和试剂盒的使用是临床生化实验室的一大革命,基本满足了临床生化检测数量日益增长的需求,更重要的是检验结果的质量得到了大幅度的提升三因生化试剂盒相对于免疫试剂盒技术要求低二研发周期短二研发成本低,已基本实现了国产化,国产试剂盒的质量也与先进国家相媲美三但原材料(酶二抗体)和核心技术都还依赖进口,自主研发能力较为薄弱三有必要对临床生化试剂盒的发展趋势进行简单总结三(一)适应生化分析仪的要求生化分析仪为了追求分析效率,操作步骤简单,分立式分析仪无法完成离心二煮沸步骤,反应时间短(多不超过10m i n)三因此,针对分析仪的这些特点,对常规方法进行了修改三原来采用无蛋白血滤液的测定方法,通过使用表面活性剂二减少样品/试剂比例二提高灵敏度等措施来防止蛋白质的干扰,以达到不需样品预处理的目的三但是,有些简化步骤或改变条件是以牺牲方法学性能为代价,如:①缩短反应时间三如为了缩短反应时间,双缩脲法测定总蛋白不得不修改试剂配方;葡萄糖氧化酶测定血糖的试剂盒添加了变旋酶三②统一测定温度在37?三为此,I F C C修改了酶活性参考方法的温度三③简化步骤三高(低)密度脂蛋白胆固醇的均相法不经离心直接测定,但原理不够严密二特异性不够高;又如对改良J G法作了进一步修改,虽不需要终止反应,但导致直接胆红素的结果不够准确三④样品/试剂比例受限制三B C G法测定清蛋白,原推荐方法中,样品/试剂比=1?500,而多数分析仪最大样品/试剂比例不足1?250,导致线性范围变窄三(二)酶法分析的应用酶的高度特异性使酶法分析可以不需样品预处理而直接测定待测物三正因为酶法分析的操作简便二条件温和二安全,才使生化试剂盒产业蓬勃发展三酶法分析是试剂盒发展的方向,研发者千方百计使用酶法来取代化学法三在不断涌现商品酶的同时,生化检验试剂盒随之日新月异,试剂酶的生产与试剂盒的研发已经形成良性循环的局面三面对越来越多的商品酶,应从纯度二价格二催化效率二稳定性二耐热性等方面综合考虑,遵循实用二可靠的原则,选择使用三(三)免疫比浊法的应用近20年来,医学检验的飞速发展离不开杂交瘤抗体生产技术三吸收光度法受灵敏度的制约,很难检测微量物质三免疫比浊法很好地结合了免疫技术,使很多微量蛋白质等的生化测定成为可能三但浊度法的检测波长不是特异光吸收,受到样品自身空白和其他浊度的干扰,抗体的效价二与抗原(游离或复合物)反应性的差异二校准品的选择二校准曲线的拟合二质量控制二抗原过剩等问题都还需要标准化三(四)高灵敏度试剂盒的应用酶法和免疫比浊法是临床生化试剂盒研发的两大方向三围绕这两种原理,通过提高灵敏度,开发了一系列新的生化项目三1.胶乳凝集免疫比浊一高敏C反应蛋白二肌钙蛋白二肌红蛋白二胱抑素C二糖化血红蛋白二脂蛋白(a)等借助于胶乳凝集免疫比浊技术,提高了灵敏度,应用于自动生化分析仪三可以预见,目前只能用散射比浊或化学发光检测的特定蛋白二激素二肿瘤标志物二病原抗原等,不久也会有胶乳凝集免疫比浊法试剂盒推出和应用三2.酶循环法一像胆汁酸二氨二同型半胱氨酸等在体内含量甚微,甚至只有不足10μm o l/L,传统的生化方法无法测定三利用酶循环法的原理使不可能成为可能,酶循环法的应用将会越来越广泛三3.发色剂的合成一自然界氧化酶种类繁多,但因酚类色原灵敏度和稳定性的限制,T r i n d e r s 反应的应用目前只停留在10-1~102m m o l/L水平,像乙醇目前还无法直接测定三可以预见,随着新色原的发现,将会有更多的试剂盒使用T r i n d e r s反应的原理三4.人工合成底物一人工合成底物是医学检验与化工二生物合成等领域结合的产物,因方法简单,特别适合于水解酶类和转移酶类的测定,人工合成底物不限制在色素原底物,将会有更多的选择空间三(五)提高方法特异性的措施试剂盒的临床应用除了方便,还应有准确度和稳定性保证三试剂盒的准确度主要取决于方法学的特异性,但通过合理的配方二合理的组合可以提高方法的特异性:①液体双试剂能有效的消除干扰三②指示通路的合理选择,如T G的酶法不下5种,除考虑酶的来源和价格因素外,提高方法特异性是首先应考虑的问题;酶活性测定的正二逆反应的选择,测底物还是测产物的选择,都应首先考虑方法的特异性三③抑制剂的使用,试剂中的杂酶二样品中的干扰酶可以采用加入抑制剂(高浓度的杂酶产物),干扰物可以通过引进一个副反应来解决三(六)提高试剂盒稳定性的措施生化检验的推荐方法和参考方法,其主要成分的配方都是公开的三生化试剂盒研发的关键是稳定技术三近几年酶稳定剂的发展使酶法试剂盒的质量得到了很大的提高三试剂盒的稳定性主要取决于酶或辅酶的稳定和底物的稳定三酶的本质是蛋白质,要使酶稳定首先能稳定蛋白质,一个适合的缓冲体系至关重要三再从活性中心出发,设法保护催化基团和结合基团三稳定的措施包括使用防腐剂(抑制细菌生长)二蛋白稳定剂(防止水化二聚合)二蛋白酶抑制剂(防止蛋白酶的水解)二巯基酶保护剂(防止巯基氧化),以及隔绝空气(对氧化酶)等;稳定底物的措施有含水量的控制和缓冲体系的选择等三(沈财成)。
如何评估体外诊断试剂盒线性范围
如何评估体外诊断试剂盒线性范围线性范围评估资料是评价拟上市试剂盒有效性的重要依据，也是诊断试剂盒注册所需的重要申报资料之一。
目前我国定量体外诊断试剂盒注册检验包括线性范围、准确度、特异性、最低检出限、精密度等指标。
本文根据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则》（征求意见稿）对体外诊断试剂盒线性范围评估进行分析。
要求：体外诊断试剂盒校准品的浓度应覆盖整个厂家声明的线性范围的系列浓度。
绘制散点图及离群值的发现和处理：散点图的绘制对于线性范围评价非常重要，其作用包括：①初步获得数据的线性关系（直线、抛物线或S型曲线等），以初步核实企业标准中声明的线性回归方程的正确性。
②观察数据的精密性，当与其他浓度相比某个浓度水平精密度较低时，特别是发生在声明的线性范围的两端，应注意线性范围是否过宽的情况；发现离群值，明显的离群值可以通过观察散点图被容易的发现。
若只有一个离群值，则可剔除，不必重复实验，但当离群值多于一个时，应仔细分析，找出问题所在并重复实验，然后使用新数据进行分析。
线性回归分析：使用企业声明的方程，通过适当的软件，对数据进行回归分析，置信水平一般为双侧0.05，计算方程的相关系数r或确定系数R2，应符合企业注册标准中的规定。
根据行业标准，相关系数r的绝对值一般应不小于0.98。
当散点图明显提示拟合的曲线可能过原点时，或数据计算是已扣除零点样本读数时，应注意检验回归方程中的截距项。
利用样本对体外诊断试剂盒线性范围评价要求：定量体外诊断试剂产品注册检验线性评价涉及的样本通常是临床样本、企业内部校准品、国家参考品或国际标准品等。
样本应不少于5个、能覆盖整个厂家声明的线性范围，每个浓度水平样本测定应不少于2次。
各样本可以是绝对浓度或相对值来标识。
理想的情况下，应使用高值和低值临床样本按比例混合得到系列浓度的样本，这主要考虑的是基质效应对检测结果的影响。
绘制散点图及离群值的发现和处理：同校准品的线性范围评价。
生化试剂盒评价
试验记录
时间（min）
吸光度
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
试剂空白 待测样本
时间反应曲线试验—试剂空白
试剂盒性能指标
• 试剂空白吸光度：在480nm处（光径 1cm），试剂空白吸光度应≤0.50。 • 效期稳定性：原包装试剂在2~8℃避光 贮存，有效期为12个月。 • 试剂开盖稳定性：试剂开盖后在2~8℃ 避光保存，稳定期为15天。
生化检测试剂盒的评价
华中科技大学同济医学院附属 同济医院 李辉军 熊志刚
2011.06
评价内容
• • • • 重复性试验 回收试验 线性试验 比对试验
• 时间反应曲线试验 • ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ定性试验
时间反应曲线试验—目的
• 掌握终点法和连续监测法测定时间反应 曲线试验的方法、原理和意义。
• 熟悉时间反应曲线的绘制方法和注意事 项。
• 了解终点法和连续监测法测定的参数及 其性能评价方法。
时间反应曲线试验—原理
• 终点法测定的是化学反应达到平衡时的 产物生成量，这样才能较可靠的反映待 测物的量。 • 用稍高于参考值上限的标准液或定值血 清，用已知质量可靠的试剂盒，并按试 剂盒说明书的要求进行测定，以观察反 应达到平衡期的时间以及反应持续和终 止的时间，即可分析该试剂盒测定的性 能。
氯测定试剂盒（硫氰酸汞比色法） 检验原理
• 血清中的氯离子与试剂中的硫氰酸汞反 应生成极难解离的氯化汞，同时产生硫 氰根。 • 硫氰根进一步与三价铁离子结合形成红 褐色Fe(SCN)3。 • 在480nm测量吸光度，吸光度增加与氯 离子的浓度成正相关。
试验步骤
试剂空白 蒸馏水 样本 试剂 15ul ---3ml 待测样本 ---15ul 3ml
实验十四临床生化检验试剂盒 - 副本
（一）终点法时间反应曲线试验
• 试剂 • 操作步骤
（一）终点法时间反应曲线试验
• 性能评价
• 试剂空白吸光度是否符合要求 • 试剂空白的反应速度时间曲线平坦，吸光度 在整个反应期间无明显波动，否则，说明试 剂本身不稳定，会导致测定偏差。 • 反映能否在规定时间内达到平衡，达到平衡 时间应在临床生化自动分析仪终点法读取测 定吸光度的时间之前。 • 反应测定期观察
（二）连续监测法时间反应曲线试验
• 目的与要求
• 掌握试剂盒连续检测法测定时间反应曲线的 方法和原理，并弄清试验的意义。 • 连续检测法测定时间反应曲线图绘制方法 • 熟悉试剂盒连续检测法测定的参数及其性能 评价方法
（二）连续监测法时间反应曲线试验
• 原理
• 连续检测法测定的实化学反应的初速度。本 试验用HK法测定血糖的试剂盒进行测定， 观察动态反应中的延迟期，线性期，混合期 的出现，持续和中止的时间，即可分析连续 检测法试剂盒的性能指标。
注意事项
• 有的测定特别是酶法测定，当酶量相对 不足时，用标准液所作的线性范围可以 达到指定的高限，但在测定同样高值的 样品时，结果却明显偏低，这往往是样 品中的介质效应引起的。
线性范围确定
• 测定上限 应使95％的临床标本不经稀 释即可进行测定，具体数值必须通过线性 范围实验加以确定，因为检测上限是不可 超越的界限，当测定值高于上限临界值时， 应减少标本用量或将标本稀释后重新测定 • 测定下限 实测多少就报告多少，如未 经验证，随意延长测定下限的做法是不正 确的
• 使用高浓度和低浓度临床标本若干分进 行实际的线性检查，理想的情况是该方 法的分析范围的最高浓度上限能使95％ 的临床标本不经稀释均能得到正确的测 定结果。 • 试剂盒测定线性范围是该试剂盒按其说 明使用时可准确测量的范围。
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4
线性范围实验
目的与要求 掌握检测临床生化检验商品试剂盒测定线性范
围的原理和方法,计量反应曲线的绘制,统计 方法和性能评价;熟悉线性范围变窄的原因; 了解影响线性的因素.
2021/3/10
5
原理
使用不同浓度的葡萄糖标准溶液,用GOD-POD法 试剂测定各自的吸光度,以标准浓度为横坐 标,以其对应的吸光度为纵坐标,在方格纸上 作图.即可绘制出一条直线,即剂量反应曲线 (dose-response curve).
3.酶法测定时,有时当酶量相对不足时,用标准液所 作的线性范围可以达到指定的高值,但在测定同样 高值样本时,结果却明显偏低,这往往
是样本中介质效应引起的，值得注意.
2021/3/10
11
线形回归计算法
1.按下【MODE】【2】.进入回归分析状态, 显示“LR”,同样数据前要先按【INV】 【AC】,以清除可能存储的其他数据,输入X 值后既按【X▫.Y▫】键，输入Y值后既按 【DATA】键.若已知变量X的一个观察
临床生化检验试剂盒性能评价试验线 性范围试验
临床生化试剂盒性能指标主要有
1.线性范围
这一点在试剂盒评价中很重要,是指试 剂盒按说明书使用可准确测量的范 围。试剂盒测定线性范围是衡量其 质量的重要指标,也是保证正确使 用和鉴定试剂盒关键指标之一。
2021/3/10
2
临床生化试剂盒性能指标主要有
2.酶促反应时间曲线或化学反应速度时
值，求估计值Y时，可直接输入X值，随后按 【Y】即可求得；若已知Y值求估计值X，则 输入Y值后按【INV】【X】即可求得X值．
2021/3/10
12
`
① 操作进入LR状态，清除内存【MODE】【2】 【INV】
【AC】 ②输入原始数据X 【X▫.Y▫】， Y 【DATA】 ③输出结果 回归方程的截距【INV】【A】 回归系数【INV】【B】 相关系数【INV】【r】 【A】
2.线性评价统计 采用回归分析,求出此直 线的截距a和斜b,建立直线回归方程y=a+bx; 并作相关分析,求出相关系数(r).
2021/3/10
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注意事项
1.葡萄糖标准液的加量必须十分准确,应用计量性 能准确度很高的微量进样器加样.
2.本方法线性可达22.24mm/L,(指生化分析仪)造成 线性变窄的原因试剂配料中组分投料不足;试剂配 制后组分稳定性差;因运输或储存不当等导致试剂 组分的含量发生变化.
2021/3/10
13
汇报结束
谢谢大家! 请各位批评指正
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8
血糖与GOD-POD试剂剂量反应曲线的 制作
加入物
标准管
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液(ul) 0
4
16 20
8
12
蒸馏水(ul) 10
20
16 12
8
4
0
GOD-POD试剂 3
3 (ml)
3
3
3
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结果计算
1.测定结果 5个不同浓度的标本,(应每管 平行做3管取平均值)
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试剂
1. 25mmol/L葡萄糖标准溶液
2. 其他试剂 同GOD-POD法试剂,试剂配制: 用蒸馏水将试剂2进行10倍稀 释,然后等量与试剂1混合成 酶
2021/3/10
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操作步骤
按表操作.为提高计量反应曲线制作的可靠 性,可将表中葡萄糖标准液和蒸馏水同时扩 大10倍,制备1,2,3,4各浓度管,然后分别取 20ul,各加GOD-POD试剂3ml测定.
间曲线观察.
以吸光度为纵坐标，反应时间为横坐标作图，观察 动态期（包栝延迟期，线性期，混和期）和平衡期 出现，持续和终止的时间，分析有关性能指标。
2021/3/10
3
临床生化试剂盒性能指标主要有
3.稳定性
是指试剂盒在规定条件下储存仍保持其 性能指标的期限
包栝原包装和工作液在指定条件下稳
定性
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