2018年细胞工程-第三节 植物细胞悬浮培养-医学文档
植物细胞悬浮培养技术
植物组织培养技术的过程：
离体的 脱分化 植物组 织、器 官、细 胞 愈伤 组织 再分化 丛芽、根 试 管 苗 小 植 株
鉴别培养基
微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发 生特定的化学反应，产生明显的特征变化
胚状体
细胞的全能性
生物体的细胞具有使后代细胞发育成完整 1、定义：
个体的潜能的特性。
2、原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特
有的全套遗传物质，都有发育成为完整个 体所必需的全部基因，从理论上讲，生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。
3、差异： 受精卵 ＞ 生殖细胞 ＞ 体细胞
植物细胞＞动物细胞
液体培养基
不加任何凝固剂
大规模工业生产及在实验室进行微生 物的基础理论和应用方面的研究
含有 途 不 同 划 分
基础培养基 加富培养基 选择培养基
在基础培养基中加入某些特殊营养 物质制成的一类营养丰富的培养基 如血液、血清、酵母浸膏、动植物 组织液等 用来将某种或某类微生物从混杂的 微生物群体中分离出来 用于鉴别不同类型微生物的培养基
机械法(研或刮） 酶解法
机械法和酶解法比较 机械法
1. 细胞不受到酶的伤害； 2. 不用质壁分离； 3. 细胞产量低； 4. 细胞易破。 1. 细胞受到酶的伤害； 2. 要质壁分离； 3. 细胞产量高； 4. 细胞不易破。
酶解法
2
由培养组织（愈伤组织）分离单细胞
材料：胡萝卜肉质根
步骤：
[讲解]植物细胞悬浮培养
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[讲解]植物细胞悬浮培养现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养(in vitro culture)，就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
?组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法。
?细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法。
?器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官)、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1.差异:细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2.分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
细胞悬浮培养
细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
第三章 细胞工程(三)
缺点：
存在扩散限制，颗粒太大时细胞生长不 良； ② 培养过程中忌钙沉淀剂或整合剂 ，如磷 酸盐、柠檬酸盐、EDTA等均会使凝胶溶 解。
①
3.抗凋亡技术
细胞凋亡，是指为维持内环境稳定，由 基因控制的细胞自主有序地死亡。 细胞死亡是维持细胞高活性和高密度的 最大障碍，死亡的细胞80%是凋亡所导致， 而不是坏死。因此抗凋亡技术的应用在 细胞大规模培养中显得极为重要。
3.灌流式操作
灌注式操作是指细胞接种后进行培养，一方面 新鲜培养基不断加入反应器。一方面又将反应 液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使 细胞处于一种不断的营养状态。 优点： ①细胞可处在较稳定的良好环境中，营养条件 较好，有害代谢浓度较低。 ②可极大地提高细胞密度，一般都可达107～ 108个/ml，从而极大地提高了产品产量。 ③产品在罐内停留时间缩短，可及时收留在低 温下保存，有利于产品质量的提高。 ④培养基的比消耗率较低，加之产量质量的提 高，生产成本明显降低。
中 试 生 物 反 应 器
动物细胞融合
细胞融合是正Байду номын сангаас的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
细胞融合又称细胞杂交。是指将二种或二 种以上的细胞或原生质体合并形成一个细 胞，不经过有性生殖过程而得到杂种细胞 的方法。
自然融合 自然情况下发生的融合 人工诱导融合 在体外用人工方法促使融合
细胞融合技术
用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图
聚乙二醇 （PEG） 法细胞融 合过程
电融合 诱导法 原理示 意图
动物细胞融合的过程
动物融合最成功的例子就是“杂交瘤”— —能够产生单克隆抗体的融合细胞。
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术一、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min 的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d 时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
二、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子三、操作步骤1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。
所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL 的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。
植物细胞悬浮培养与生长量的测定课件
的测定
植物细胞悬浮培养 技术 （Suspension culture）
概念：是指一种在受到不断摇动的液体培养 基里，培养单细胞及小细胞团的组织培养系 统。
特点： ? 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适
于大规模培养； ? 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生
长、分化创造方法和条件。 必须指出： 悬浮培养中既有单细胞，也有小细胞团。
3 12
1 滞后期
(lag phase)
2 指数生长期
(exponential phase)
3 直线生长期
(linear phase)
培养时间 4 减慢期
培是养极由由细细少于胞胞于细生，细有所很培胞长甚胞毒处少养分几至生的分代基裂乎开生裂长谢中长活，处始和产某期其跃于死发物和时些，停亡育的转间营细止。最积入长养胞状快细短累物数态胞取的5，质数目决，时细量已于(d迅细静期pe胞r的c在经o速e胞止gl的多e继r耗er增数a期s增少代tsii尽ov加目n时e长，p增原h逐a或s种加e)
③将已接种的培养瓶置于旋转式摇床上， 在转速 100-120rpm ，25℃下进行震荡培养。
1、起始悬浮液的制备
转速30～150rpm
愈伤组织
防细胞破裂
液体培养基 摇床振荡
悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小， 不适于悬浮培养
（2）培养细胞的生长量测定 ① 鲜重测定 采用直接测量法，将悬浮培养的细胞用细 胞筛过滤，过滤后用水冲洗，除去培养基， 然后离心除去水分。将获得的沉淀细胞称 量即为悬浮细胞的鲜重。
② 干重测定 将鲜重测定得到的细胞置于 60℃烘箱内烘 12～24h（因材料大小、数量多少而定） 取出，冷却后立即称量，即为悬浮细胞干 重。
第三章 植物细胞的悬浮培养
二. 操作程序
（八）悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受到悬浮培养起始密度的 影响，如果培养时间过长（5～7天或更长）、细胞积 累量多时，培养基的成分和pH值均发生较大的改变， 往往造成细胞活力下降，细胞生长减慢。一般继代培 养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用 此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处 理等。
实例
白木香
二. 操作程序
（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。
二伤组织的形成和植株再生 悬浮细胞的分裂、分化通常有两个途径，一个是直接形成体细 胞胚；另一个是先形成肉眼可见的愈伤组织，通过愈伤组织进 一步再生植株。 某些有机附加物如水解酪蛋白、酵母提取物、谷氨酰胺等对悬 浮细胞再生植株均是有益的。另外高渗（如提高蔗糖含量）、 活性炭对体细胞胚的形成也有良好的效果。 对于单细胞、或较小的细胞团、或低密度的悬浮细胞不适于直 接在简单的固体培养基上再生愈伤组织，可先在液体培养基中 静置培养使细胞分裂，形成较大的愈伤组织，看护培养对提高 植板率可能是最有效的方法之一。
杨柏云
南昌大学生命科学学院
植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选
第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。
二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件：①细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。
很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。
②均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。
在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。
③液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2〜3天生长量可增加一倍。
植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。
因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。
三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。
图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1.选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。
有的基因型容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。
但有的基因型则与之相反。
因此，要重视起始材料基因型的筛选。
（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。
植物细胞悬浮培养技术
植物细胞悬浮培养技术一、基本原理利用固体琼脂培养基对植物的离体组织进行培养的方法在某些方面还存在一些缺点，比如在培养过程中，植物的愈伤组织在生长过程中的营养成分、植物组织产生的代谢物质呈现一个梯度分布，而且琼脂本身也有一些不明的物质成分可能对培养物产生影响，从而导致植物组织生长发育过程中代谢的改变而利用液体培养基则可以克服这一缺点，当植物的组织在液体培养基中生长时，我们可以通过薄层震荡培养或向培养基中通气用以改善培养基中氧气的供应。
植物细胞的悬浮培养是指将植物细胞或较小的细胞团悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过程中能够保持良好的分散状态。
这些小的细胞聚合体通常来自植物的愈伤组织。
一般的操作过程是把未分化的愈伤组织转移到液体培养基中进行培养。
在培养过程中不断进行旋转震荡，一般可用100～12Or/min的速度进行。
由于液体培养基的旋转和震荡，使得愈伤组织上分裂的细胞不断游离下来。
在液体培养基中的培养物是混杂的，既有游离的单个细胞，也有较大的细胞团块，还有接种物的死细胞残渣。
在液体悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将进入分裂的静止期。
对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第18～25d时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。
在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。
若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。
目前这项技术已经广泛应用于细胞的形态、生理、遗传、凋亡等研究工作，特别是为基因工程在植物细胞水平上的操作提供了理想的材料和途径。
经过转化的植物细胞再经过诱导分化形成植株，即可获得携带有目标基因的个体。
二、器材超净工作台、高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、磁力搅拌器、恒温空气摇床、镊子、锥形瓶、水稻种子三、操作步骤1．配制培养基按照培养基配方取各种药品，最后用蒸馏水定容到所需体积。
所配制的培养基经高压蒸汽灭菌后备用，固体琼脂培养基分装在250mL的锥形瓶内，每瓶约分装30mL。
[医学]植物细胞悬浮培养
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悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化： 同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
• 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不 同程度的分化状态 ， 因此 ， 要达到完全同 步化是十分困难的。
• 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同 一细胞周期 ， 这种差异使悬浮细胞分裂 、 代谢以及生理生化状态等复杂化。
• 通过一定的理化措施可以使同一体系中的 细胞达到相对同步化 。 什么措施？
• 细细胞周期
• 细胞起始密度： 30～80个/室。
双层滤纸植板培养
• Horsch等 （ 198
培培养基基
培培养养细胞胞
转转移滤滤纸纸
培培养皿 饲养细胞层 看护滤纸
固体培养
• 固体培养是在培养基中加入一定量的凝固 剂 ，经加热溶解后 ， 分别装入培养用的容 器中 ， 冷却后凝结成固体培养基。
• 优缺点
–简便易行 、所占空间小 –生长的不平衡 ， 易出现极化现象 – 易堆积生长过程中排出的有害物质 –有些生理生化指标测定不方便
150~250ml flask
100~ 120 rmp culture transfer 1 time/3d
centrifuge isolation
80 rpm
subculture
成功的悬浮细胞培养体系特征
• 悬浮培养分散性良好 ， 细胞团较小 ， 一般 在30～50个细胞以下。
• 均一性好 ， 细胞形状和细胞团大小大致相 同 。悬浮系外观为大小均一 的小颗粒 ， 培 养基清澈透亮 ， 细胞色泽呈鲜艳的乳白或 淡黄色。
• 两阶段连续培养法
–于第一反应器中投入生长培养基并连续加入该 培养基 ，而于第二反应器中投入生产培养基。
植物细胞的悬浮培养技术
毕业论文(设计)中国·武汉二○一二年四月目录摘要 (3)关键词 (3)Abstract (3)Key words (3)前言 (4)1.细胞悬浮培养的定义 (4)2.单细胞制备的方法 (4)2.1 机械法 (4)2.2酶解法 (4)2.3 愈伤组织诱导法 (4)3.悬浮培养的条件 (5)4.细胞初始培养 (5)5.细胞悬浮培养的类型 (5)5.1分批培养 (5)5.2连续培养 (6)6.悬浮培养细胞的同步化 (6)6.1 物理方法 (6)6.1.1 体积选择法 (6)6.1.2低温处理法 (6)6.2 化学方法 (6)6.2.1 饥饿法 (6)6.2.2抑制法 (6)7.规模化培养 (7)8.存在问题与前景展望 (7)8.1植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势 (7)8.2植物细胞培养过程中存在的困难 (7)8.3前景展望 (7)参考文献 (8)致谢 (8)植物细胞的悬浮培养技术摘要悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛的应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低，生产成本高，劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现在生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words.Plant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株.三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用.由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.1 细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。
植物细胞悬浮培养(组培实验报告)
3、 继代培养。 （由于时间关系以及条件有限， 本次实验只进行了一次悬浮培养） 在接种两个星期之后继代。继代方法是：先用孔径为 100um 的无菌尼龙滤筛 将培养物滤去。除去滤筛上的愈伤组织碎块和大的细胞团。
4、通过镜检查看实验结果。 用一定规格的无菌尼龙滤筛将培养物过滤，滤出含单细胞的液体盛于一洁净 的培养皿内。在倒置显微镜下观察单细胞。 （理论上还应对培养物中进行单细胞计数以及活力测定，但因条件有限，未 能完成。这是本次实验的一大遗憾。 ）
罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半 连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。 连续培养(continuous culture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基， 排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的 现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖 速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。 （4）细胞悬浮培养的培养基 从理论上讲，能形成生长快、疏松愈伤组织的培养基一般来说也同样适用于建 立该物种的悬浮培养，只是琼脂当然要从中去掉。旺盛生长的悬浮培养物中， 无机磷酸盐迅速地被利用，以致使无机磷酸盐成为了一个限制生长的因素。此 外，培养基的 pH 值和启动密度也是不容忽视的。pH 值可能随细胞生物产量的 增加而改变。需要监测和调整悬浮培养物中的 pH 值。启动低密度细胞培养时， 要条件培养基。 （5）由悬浮细胞再生植株的途径：由悬浮细胞直接形成体细胞胚：先将悬 浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。 由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结 构，称为胚状体。胚状体方式：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴 的胚状结构，进而长成完整植株。胚状体形成在植物有性生殖中，精子和卵结 合形成合子， 合子进一步发育成胚。 但在组织培养条件下胚状体的发育过程是： 细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心 形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。在生长素比细胞分裂 素比值高的时候使细胞进行增殖。水解酪蛋白属于铵态氮，对胚状体诱导起重 要作用。 （6）悬浮培养中细胞生长的测定常用方法： 细胞计数、细胞密实体积(packed cell volume,PCV)、细胞鲜重、 重、细胞有丝分裂的指数。 （7）培养细胞活力的测定常用方法： 相差显微术法、四唑盐还原法(TTC 法)、荧光素二乙酸酯法(FDA 法)、伊凡蓝 染色法。 细胞干
细胞悬浮培养
（一）饥饿法 在这种方法中， 在这种方法中 ， 先对细胞断绝供应一种进行 细胞分裂所必需的营养成分或激素， 细胞分裂所必需的营养成分或激素 ， 使细胞停滞 在 G1 期或 G2 期 ， 经过一段时间的饥饿之后 ， 当重 期或G 经过一段时间的饥饿之后， 新在培养基中加入这种限制因子时， 新在培养基中加入这种限制因子时 ， 静止细胞就 会同步进入分裂。 会同步进入分裂。
5.1悬浮培养的方法
分批培养
连续培养
（一）分批培养(batch culture)
是指将一定量的细胞或细胞团分散在一定容 积的培养基中进行培养， 积的培养基中进行培养，目的是建立单细胞培 养物。 养物。
分批培养的特点
在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可 以同外界空气交换外，一切都是密闭的， 以同外界空气交换外，一切都是密闭的，当培养 基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长 基中的主要营养物质耗尽时， 即行停止。 即行停止。
化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿， 化学方法 的原理是使细胞遭受某种 营养饥饿 ， 或 的原理是使细胞遭受某种营养饥饿 生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 是通过加人某种生化抑制剂 是通过加人某种 生化抑制剂 阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法 抑制法两种 周期。 化学方法中常用的有 饥饿法 和 抑制法 两种。 饥饿法和 两种。
加入培养基
排出培养基及其培养物
连续培养的类型 封闭型 开放型
封闭型连续培养的特点
排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充， 排出的旧培养基由加入的新培养基进行补充， 进出数量保持平衡。 进出数量保持平衡。 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集起来 之后，又被放回到培养系统中。 之后，又被放回到培养系统中。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。 随着培养时间的延长，细胞数目不断增加。
植物细胞悬浮培养技术52页PPT
26、要使整个人生都过得舒适、愉快，这是不可能的，因为人类必须具备一种能应付逆境的态度。——卢梭
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27、只有把抱怨环境的心情，化为上进的力量，才是成功的保证。——罗曼·罗兰
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28、知之者不如好之者，好之者不如乐之者。——孔子抵得上武器的精良。——达·芬奇
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30、意志是一个强壮的盲人，倚靠在明眼的跛子肩上。——叔本华
植物细胞悬浮培养技术
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只有处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
50、弱者比强者更能得到法律的保护 。—— 威·厄尔
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谢谢！
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起始悬浮液的制备
转速30-150rpm 2-3cm冲程 防细胞破裂
愈伤组织
液体培养基
摇床振荡 悬浮培养
质地疏松，细胞分散程度大； 质地紧密，细胞分散程度小，不适于悬浮培养
二 、培养方法
植物细胞悬浮培养通常深层培养可分为： 分批式．流加式．半连续式．连续 式．和灌注式五种。
1、分批培养/成批培养（Batch culture）
一、细胞悬浮培养原理
植物离体培养可产生愈伤组织, 将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基 中并在振荡条件下培养一段时间后，可 形成分散悬浮培养物。
细胞的悬浮培养示意图
（一）悬浮培养Suspension culture
特点 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞群体，适于大规模培养； 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究细胞的生长、分化创造方法和条件。
（2）流加工艺中的营养成分主 要分为三大类
① 葡萄糖：葡萄糖是细胞的供能物质和 主要的碳源物质。 ② 谷氨酰胺：谷氨酰胺是细胞的供能物 质和主要的氮源物质。 ③ 氨基酸．维生素及其他：主要包括营 养必需氨基酸．营养非必需氨基酸．一 些特殊的氨基酸如羟脯氨酸．羧基谷氨 酸和磷酸丝氨酸；此外还包括其他营养 成分如胆碱．生长刺激因子。
流加式培养是在批式培养的基础上，采 用机械搅拌式生物反应器系统，细胞初 始接种的培养基体积一般为终体积的 1/2～1/3，在培养过程中根据细胞对营 养物质的不断消耗和需求，流加浓缩的 营养物或培养基，从而使细胞持续生长 至较高的密度。 整个培养过程没有流出或回收，通常在 细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回 收整个反应体系，分离细胞和细胞碎片，
（1）流加培养特点：
பைடு நூலகம்
① 流加培养 根据情况流加浓缩的营养 培养基，流加的速率与消耗的速率相同， 保证合理的培养环境与较低的代谢产物 抑制水平。 ② 培养过程以低稀释率流加，细胞在培 养系统中停留时间较长，总细胞密度较 高，产物浓度较高。 ③流加培养细胞培养基的设计和培养条 件与环境优化，是整个培养工艺中的主
（1）培养物的体积逐步增加； （2）可进行多次收获； （3）细胞可持续指数生长，并可保持产 物和细胞在一较高的浓度水平，培养过 程可延续到很长时间。 （4）该操作方式的优点是操作简便，生 产效率高，可长时期进行生产，反复收 获产品，在动物细胞培养和药品生产中 被广泛应用。
4．连续式培养（continuous culture）
• 4．培养时需供氧，培养液粘度大： • 5．具有群体效应； • 6． 因为有细胞壁, 培养细胞产物滞留于 细胞内，产量较低； • 7．细胞培养过程有结构与功能全能性,因 而易分化,从而导致目的产物低于原植物 体内浓度； • 8． 悬浮培养中要求有一定的细胞浓度， 否则不生长（25000~50000个/ML）。
5．灌流式培养（perfusion culture）
该方式的特点
培养周期短，染菌和细胞突变的风险小。 培养基体积固定，不添加任何营养成分。 直观反映细胞生长代谢的过程。培养过 程中，细胞生长，其数目不断发生变化， 呈S增长。 反应器系统属于封闭式，必须适当搅拌 控制温度．pH值和通气 。
2．流加式培养（feeding culture）
连续培养（Continuous culture）示意图
加入培养基
二者体积相等 排出培养基及其培养物
连续式培养的特点
① 细胞维持持续指数增长； ② 产物体积不断增长； ③ 可控制衰退期与下降期。
连续培养意义： ①植物细胞代谢调节的研究（某种生长限速物质浓度对细胞生长的影响）； ②次生物质的大量生产。
反复补料分批式培养
②反复补料分批式培养是在单一补料分 批式操作的基础上，每隔一定时间按一 定比例放出一部分培养液，使培养液体 积始终不超过反应器的最大操作容积， 从而在理论上可以延长培养周期，直至 培养效率下降，才将培养液全部放出。
3．半连续式培养（semicontinuous culture）
必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
（二）植物细胞悬浮培养的特 性
• 1．植物细胞较微生物细胞大得多，有纤 维素细胞壁．细胞耐拉不耐扭，抵抗剪 切力差； • 2．培养过程生长速度缓慢，易受微生物 污染，需用抗生素； • 3．细胞生长的中期及对数期．易凝聚为 直径达350µm一400µ m的团块，悬浮培养 较难；
连续培养方法，即培养若干天后连续收
获细胞培养物的同时不断补充培养液的 方法。连续式培养是一种常见的悬浮培 养模式。 该模式是将细胞接种与一定体积的培养 基后，为了防止衰退期的出现，在细胞 达最大密度之前，以一定速度向生物反 应器连续添加新鲜培养基；同时，含有 细胞的培养物以相同的速度连续从反应
（3）流加式培养分为两种类型
单一补料分批式培养 反复补料分批式培养。
单一补料分批式培养
① 单一补料分批式培养是在培养开始时 投入一定量的基础培养液，培养到一定 时期，开始连续补加浓缩营养物质，直 到培养液体积达到生物反应器的最大操 作容积，停止补加，最后将细胞培养液 一次全部放出。该操作方式受到反应器 操作容积的限制，培养周期只能控制在 较短的时间内。
半连续式培养即每隔一定时间（如1---2天）
收获部分培养物，再加人等量培养基的方法。 又称为重复分批式培养或换液培养。 采用机械搅拌式生物反应器系统的悬浮培养 形式。在细胞增长和产物形成过程中，每间 隔一段时间，从中取出部分培养物，再用新 的培养液补足到原有体积，使反应器内的总 体积不变。
半连续式特点
含义：将愈伤组织培养在一定容积的密闭容器中进行培养。它是进行细胞生 长 和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。 但要进行下一批培养，则生长一定时间后，需要继代转移。
分批式培养（batch culture）
该方式大多采用机械搅拌式生物反应器， 将细胞扩大培养后，一次性转入生物反 应器内进行培养，在培养过程中其体积 不变，不添加其它成分，待细胞增长和 产物形成积累到适当的时间，一次性收 获细胞、产物、培养基的操作方式。