细胞悬浮培养
细胞大规模悬浮培养流程简介
•.
4•
细胞复苏注意事项
· 注意全程无菌操作 · 溶解冻存细胞时速度一定要快 ，避免缓慢升温细胞内形成冰
晶 ，对细胞造成损伤 · 计算合适的接种密度 ，一般CHO细胞培养的接种密度范围在
3.0-6.0*10E5个/ml · 注意安全：取出冻存管时防止冻伤 ， 同时注意有无液氮渗透
细胞株 摇瓶 WAVE或者种子罐
收货细胞液
反应器培养
•.
1 细胞复苏
· 将水浴管 ，用镊子夹住迅速放入水浴锅中晃动， 直至完全溶解后将冻存管表面消毒转移至超净工作台内进行 操作
· 将细胞悬液转移至15ml离心管内，加入约10ml培养液，轻 轻吹打混匀
· 将细胞悬液经800-1000rpm离心5分钟，弃去上清液
CHO细胞培养流程简介
•.
一 悬浮培养特点 （suspension culture)
· 非贴壁依赖型细胞的一种培养方式 · 细胞悬浮于培养基中生长或者维持 · 某些贴壁依赖型细胞经过适应和选择后也可
用此方法培养 · 使用振荡或者转动装置使细胞始终处于悬浮
状态
•.
二 CHO细胞大规模悬浮培养工艺流 程
液打入反应器进行扩培 · 当反应器内细胞密度达到要求后 ，接种至下一级反应器开始
生产阶段培养
•.
4 反应器生产阶段培养
· 取样 · 补碱 · 补料 · 补糖 · 收获
•.
取样
· 取样瓶灭菌 · 将取样瓶连接至反应器取样口 ，开始管路灭菌 · 灭菌完成后等待管路冷却 · 开始取样 · 取样完成后用纯蒸汽冲洗取样管路 · 将所取细胞液测定细胞密度、活力、pH值等参数
第八讲植物细胞悬浮培养技术
第八讲：植物细胞悬浮培养技术摘要悬浮培养技术是一种在液态培养基中培育植物细胞的方法。
这种技术可以用于研究植物细胞的生理、生化、遗传和分子生物学。
本文将介绍悬浮培养技术的原理、方法和应用，并讨论其优缺点。
原理悬浮培养技术是将植物细胞悬浮在液态培养基中，并提供足够的营养和适宜的环境条件，促进细胞生长和分裂。
悬浮培养技术可以通过两种方法进行：自然悬浮和机械悬浮。
自然悬浮是指通过培养基中的液体流动和植物细胞的重力作用来保持细胞悬浮状态。
机械悬浮是指通过磁力搅拌或气泡强制产生的涡流来保持悬浮状态。
方法悬浮培养技术的方法主要包括以下步骤：1.选取适当的植物细胞：悬浮培养技术可以应用于多种植物细胞，例如培养基的类型和成分、植物物种、生长条件等，都会影响细胞的生长和分裂。
2.培养基制备：准备含有足够营养物质和适合生长的植物细胞的培养基。
3.细胞分离：使用细胞壁水解酶、酸碱处理或机械方法去除细胞壁，分离单个细胞。
4.细胞培养：将分离的细胞置于液态培养基中，将培养瓶放置拟南芥上，以恒定光照、温度、湿度和通风条件下日夜持续观察培养。
5.细胞传代：留置旺孔1cm左右的细胞，废弃周边细胞，再次培养。
应用悬浮培养技术可以应用于以下方面：1.生物医学研究：通过悬浮培养技术培养人类细胞，可用于药物筛选、治疗性细胞移植和组织工程学等研究。
2.分子生物学研究：由于悬浮培养技术能够大量培养植物细胞，因此可以用于高通量分析、基因克隆和表达、蛋白质组学和代谢组学研究等。
3.植物细胞与组织培养：悬浮培养技术可以用于植物组织和细胞的体外培养，利用悬浮培养技术可以大量制备植物生长激素和次生代谢产物。
优缺点悬浮培养技术有以下优点：1.可以大规模培养细胞。
2.可以简化分离和培养过程，使得实验成本低廉。
3.可以控制培养环境，减少外界干扰。
悬浮培养技术也存在以下缺点：1.悬浮培养技术对培养条件和营养要求非常苛刻，因此需要经验丰富的实验人员进行操作。
2.悬浮培养技术可能会产生细胞堆积的问题，从而影响细胞生长和分裂。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法：
1. 准备悬浮细胞：首先需要收集悬浮细胞，如白血球、淋巴细胞、骨髓细胞等。
通常，可以采用离心法或者血液透析法来收集悬浮细胞。
2. 培养基准备：根据细胞的种类和需要，选择合适的培养基，加入适量的生长因子、荷尔蒙和营养物质等。
调节培养基的pH值和渗透压等因素，以适应悬浮细胞的生长环境。
3. 培养悬浮细胞：将收集到的悬浮细胞放入已经准备好的培养基中，放入培养箱中进行培养。
注意控制培养箱中的温度、湿度、氧气浓度等因素。
定期更换培养基。
注意事项：
1. 避免过度离心：在离心悬浮细胞的过程中，一定要注意不要离心得太久或太快，以免对悬浮细胞造成不必要的损伤。
2. 控制培养条件：悬浮细胞比较敏感，生长条件的变化会对细胞生长产生影响。
因此，需要掌握培养箱中温度、湿度、氧气浓度等参数，避免不必要的波动。
3. 定期更换培养基：悬浮细胞在培养基中的生长、分裂、代谢需要大量的营养物质和生长因子等，因此需要定期更换培养基，以保持培养基的新鲜度、悬浮细胞的生长状态。
4. 避免感染：元培养含有丰富的营养物质，容易滋生细菌或真菌等，因此需要采取严格的无菌操作，以避免培养基的污染。
第三章 植物细胞的悬浮培养
二. 操作程序
（八）悬浮细胞的活力和生长速度 悬浮细胞的活力和生长速度受到悬浮培养起始密度的 影响，如果培养时间过长（5～7天或更长）、细胞积 累量多时，培养基的成分和pH值均发生较大的改变， 往往造成细胞活力下降，细胞生长减慢。一般继代培 养（更换新鲜培养基）3天时的细胞活力最强，常常用 此时的细胞为材料进行原生质体游离和培养及诱变处 理等。
实例
白木香
二. 操作程序
（十）悬浮细胞的分散度、生长速度与植株再生能力之间的关 系 一般来讲，如果一个悬浮细胞系分散程度越高，生长速度越快， 在一定时间内，细胞分裂的代数也就越多，也就越易产生突变， 其分化能力也就越容易丧失，因此，悬浮细胞在继代培养过程 中，每隔一段时间（1～2个月）就应检查一下它的分化能力。 自诱导愈伤组织到建立一个良好的悬浮细胞系大约需要4～6个 月或更长的时间，因此尽量保持其分化能力极为重要。 保持其分化能力的方法有二个：超低温保存是一个极有效的方 法，经过超低温保存的悬浮细胞，不会影响其各种性质，同对 照组相同。 固体培养基上保持悬浮细胞的分化能力。
二伤组织的形成和植株再生 悬浮细胞的分裂、分化通常有两个途径，一个是直接形成体细 胞胚；另一个是先形成肉眼可见的愈伤组织，通过愈伤组织进 一步再生植株。 某些有机附加物如水解酪蛋白、酵母提取物、谷氨酰胺等对悬 浮细胞再生植株均是有益的。另外高渗（如提高蔗糖含量）、 活性炭对体细胞胚的形成也有良好的效果。 对于单细胞、或较小的细胞团、或低密度的悬浮细胞不适于直 接在简单的固体培养基上再生愈伤组织，可先在液体培养基中 静置培养使细胞分裂，形成较大的愈伤组织，看护培养对提高 植板率可能是最有效的方法之一。
杨柏云
南昌大学生命科学学院
植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选
第八章植物细胞悬浮培养与细胞突变体筛选第一节植物细胞悬浮培养体系的建立和愈伤组织诱导与植株再生一、植物细胞悬浮培养的定义植物细胞悬浮培养（Plant cell suspension culture），是指将植物细胞或小的细胞团（包括含少数细胞的小的分生细胞团或细胞聚集体）放在液体培养基中于摇床上进行悬浮培养。
这些细胞或小的细胞团来自愈伤组织，或某个器官或组织，通过物理或化学的方法进行分离而获得。
二、建立一个良好细胞悬浮培养体系应具备的条件建立一个成功的细胞悬浮培养体系（简称悬浮细胞系）必须满足三个基本条件：①细胞或小的细胞团在液体中分散性良好，小细胞团在几十个细胞以下。
很少有完全由单细胞组成的悬浮细胞系。
②均一性好，即细胞形状、大小及细胞团大小均匀一致。
在倒置显微镜下观察，悬浮细胞系内的细胞团体积和形状比较一致。
③液体培养基中细胞分裂旺盛，细胞生长迅速，一般2〜3天生长量可增加一倍。
植物悬浮细胞系不仅为原生质体培养和人工种子的研制奠定良好基础，同时也为遗传转化提供良好受体，还可以用来生产植物次生代谢产物。
因此，植物细胞悬浮培养是植物细胞工程技术中很有价值的技术手段。
三、建立良好悬浮细胞系的技术关键影响建立良好悬浮细胞系的主要因素，见图6.1。
图6.1影响建立良好悬浮细胞系的主要因素1.选择合适的基因型和外植体（1）基因型基因型是影响植物细胞悬浮培养成功的重要因素。
有的基因型容易诱导形成愈伤组织，用其为外植体进行细胞悬浮培养，细胞可以进行分裂，并可持续分裂，进一步同步化后，获得悬浮培养细胞系。
但有的基因型则与之相反。
因此，要重视起始材料基因型的筛选。
（2）外植体选择合适的外植体是细胞悬浮培养成功的另一重要因素。
外植体的选择对以后愈伤组织的诱导十分重要，是愈伤组织诱导的重要条件。
合适的外植体诱导产生疏松易碎愈伤组织，对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
双子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶和叶片等；单子叶植物中常用的外植体为幼胚、成熟胚、幼穗和花药等。
悬浮细胞培养
1、分批培养/成批培养 （Batch culture）
① 特点 • • 培养基体积固定 培养过程中，细胞生长，其数目不断发 生变化，呈S增长。
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继代
9
② 继代的方法
• 用注射器或移管吸取一定量的含单细
胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到
含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进
行培养。
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③最佳继代时期：
第五章 悬浮细胞培养
1
主要内容
一．起始悬浮细胞的制备 二．悬浮细胞培养的基本形式 三．悬浮细胞培养中细胞生长量的计算 四．悬浮培养细胞活力的测定
2
悬浮细胞培养
Suspension cell culture
意义
1. 细胞可以不断增殖，形成高密度的细胞 群体，适于大规模培养； 2. 能够提供大量较为均匀的细胞，为研究 细胞的生长、分化创造方法和条件。 必须指出 悬浮培养中既有单细胞，也有细胞团。
③ FDA法
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①相差显微术法
观察细胞质环流和细胞核存在与否，环流正常、 核存在表明有活力
②伊凡蓝法
活力受损的细胞能够摄取，完整的活细胞则不 能，凡染蓝色的细胞是不具有活力的细胞
③FDA法（荧光素双醋酸酯法）
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FDA法的原理
FDA本身不具有极性，不能发出荧光，可以 自由出入细胞膜。 在活细胞中，FDA被酯酶裂解，释放出有极 性的荧光素。 荧光素不能自由穿越质膜，在活细胞中积累。 荧光素在死细胞中不能积累。 在UV照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧 光。
1. 分批培养：将愈伤组织培养在一定容积的密闭 容器中，最后一次收获的培养方式。 2. 连续培养：将愈伤组织培养在一个恒定容积的 流动系统中，以使培养系统中的细胞数量和营 养状态保持稳定。 --流动系统：一方面以一定速率不断地加入新的 培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物 (菌体和代谢产物) 7
植物细胞悬浮培养的方法
植物细胞悬浮培养的方法植物细胞悬浮培养是一种常用的细胞培养方法，它可以用于研究植物细胞的生长、分化和代谢等方面的问题。
本文将介绍植物细胞悬浮培养的基本原理、培养条件和应用。
一、植物细胞悬浮培养的基本原理植物细胞悬浮培养是将植物细胞从组织中分离出来，以液体培养基为基质，在适宜的温度、光照和气体条件下进行培养。
悬浮培养的优势在于可以提供细胞自由生长的环境，有利于探究植物细胞的生理和生化特性。
二、植物细胞悬浮培养的培养条件1. 培养基：植物细胞悬浮培养的基础是培养基的选择。
培养基中应含有适宜的营养物质，如碳源、氮源、无机盐和维生素等。
常用的培养基有MS培养基、B5培养基等。
2. 温度：植物细胞的适宜生长温度通常在20-25摄氏度之间，不同植物细胞可能有所差异，需要根据具体情况进行调整。
3. 光照：光照条件对植物细胞的生长和代谢有一定影响。
一般情况下，光照强度为1000-2000勒克斯，光周期为16小时光照/8小时黑暗。
4. 气体：植物细胞悬浮培养通常需要提供充足的氧气和适量的二氧化碳。
因此，培养容器应具有良好的通气性，可以使用摇床或气体通气系统进行培养。
三、植物细胞悬浮培养的应用植物细胞悬浮培养在植物生理学、生物工程和药物研发等领域具有广泛的应用价值。
1. 植物生理学研究：植物细胞悬浮培养可以用于研究植物的生长发育过程，如细胞分裂、细胞扩增和细胞器的形成等。
2. 生物工程：植物细胞悬浮培养可以用于生物工程的研究和应用，如基因转化、蛋白质表达和次生代谢产物的生产等。
3. 药物研发：植物细胞悬浮培养可以用于药物的筛选和生产，如植物次生代谢产物的提取和纯化，以及药物的生物活性和毒性测试等。
四、植物细胞悬浮培养的优缺点1. 优点：(1) 与传统的植物培养相比，悬浮培养提供了更便利的细胞生长环境，可以快速获得大量的细胞。
(2) 可以对植物细胞的生理和代谢进行深入研究。
(3) 可以为生物工程和药物研发等领域提供重要的研究手段和应用平台。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养介绍悬浮细胞培养是一种将细胞以悬浮状态培养的方法。
相对于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养能够更好地模拟细胞在体内自由悬浮的环境，适用于许多细胞类型的培养和研究。
悬浮细胞培养技术在生物学、医学和生物工程领域得到了广泛应用。
本文将介绍悬浮细胞培养的基本原理、培养条件和常用的培养方法。
基本原理悬浮细胞培养的基本原理是将细胞以悬浮状态培养在培养基中，培养基提供了细胞生长所需的营养物质和环境因素。
在悬浮培养中，培养基通常包含以下主要组分：1.基础培养液：如DMEM（Dulbecco’s Modified EagleMedium）或RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640），提供细胞生长所需的营养物质，如糖类、氨基酸和维生素等。
2.补充物：根据细胞类型的不同，可以添加血清、生长因子、细胞因子等，以促进细胞生长和增殖。
3.pH缓冲剂和非酶性胎牛血清：用于稳定培养基的pH值和提供额外的营养和辅助因子。
在悬浮细胞培养过程中，细胞应保持以单个细胞的形式悬浮在培养基中，以避免细胞聚集和堆积。
为了实现这一点，通常需要采取一些措施，如定期的细胞传代、培养器皿的选择和培养条件的调节等。
培养条件悬浮细胞培养需要适宜的培养条件来维持细胞的健康生长和增殖。
以下是一些常见的悬浮细胞培养条件：1.培养温度：通常在37°C下培养，但也有一些细胞需要较低的温度，如4°C或30°C。
2.CO2浓度：大多数悬浮细胞培养需要保持适宜的CO2浓度，通常在5%左右。
CO2能够调节培养基的pH 值，提供适宜的细胞生长环境。
3.氧气浓度：氧气浓度对悬浮细胞的生长和代谢有重要影响。
不同类型的细胞对氧气浓度的要求有所不同，一些细胞需要低氧（如2-5%）环境才能生长，而另一些细胞则需要高氧环境。
4.搅拌：悬浮细胞培养过程中需要进行适当的搅拌来保持细胞的均匀分布和培养基中氧气、营养物质的均匀分布。
细胞悬浮培养
4.选择单细胞和小细胞团进行继代 选择单细胞和小细胞团进行继代
在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注 射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 射器 ， 但其进液口的孔径必须小到只能通过单细 胞和小细胞团（ 胞和小细胞团 （ (2-4 个细胞 ） ， 而不能通过大的 个细胞） 细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒， 细胞聚集体。 继代前应先使三角瓶静置数秒 ， 以 便让大的细胞团沉降下去， 便让大的细胞团沉降下去 ， 然后再由上层吸取悬 浮液。 浮液。
悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 悬浮培养细胞同步化的方法有两类： 物理方法和化学方法。 物理方法和化学方法。 物理方法主要是通过对细胞物理特性 物理方法主要是通过对细胞物理特性（细胞或小细 主要是通过对细胞物理特性（ 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等） 胞团的大小）或生长环境条件（光照、温度等）的 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 控制，实现高度同步化，其中包括按细胞团的大小 进行选择的方法和低温休克法等。 进行选择的方法和低温休克法等。
5.4 细胞增殖的测定
1. 细胞鲜重 将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去 湿尼龙丝网上，用水洗去培养基， 细胞上沾着的多余水分，称重， 细胞上沾着的多余水分，称重，即求得细胞鲜重 （fresh weight）。 weight）。
2.细胞干重 2.细胞干重 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 用已知重量的干尼龙丝网依1的方法收集细胞， 在60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h，细胞干重恒 60℃下干燥48 h或80℃下干燥36 h， 定后，再称重。细胞干重（ weight） 定后，再称重。细胞干重（dry weight）以每毫升 培养物或每10 个细胞的重量表示。 培养物或每106个细胞的重量表示。
细胞悬浮培养的方法和特点1
生长曲线
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量 细胞计数 细胞密实体积 细胞重量
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量
4.1 细胞计数 虽然悬浮培养细胞比较分散，但远没有达到单 细胞分散的水平，因此，需要采用方法使细胞 团分散成为单细胞才能够进行细胞计数。 使细胞团分散的方法有两种，即铬酸法和果胶 酶法。分散后，在显微镜下计数。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
4，悬浮培养细胞生长的计量
例，铬酸法的实验方法 取1份培养细胞（用滤纸吸除表面水分）
加入2份容积的8%的三氧铬酸溶液中，在70 C 加热5-15分钟；冷却后用力振动10分钟分散细 胞团成为单细胞，然后用血球计数板在显微镜 下计数。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
3，细胞悬浮培养的特点
3.1 不用使用琼脂等培养基固化剂，不仅减少 成本而且能使培养结果不受固化剂中杂质的影 响。 3.2 便于更换培养基的操作，借此可以减少人 工劳力。 3.3 在液体培养条件下植物组织失去了生长的 方向性。
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
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第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
1，细胞悬浮培养的方法
摇床有两种摇荡的形式，一种是往复式的（来回 移动，运动面上的每一个点的轨迹都是一条直 线），另一种是涡旋式的（不是旋转，运动面上 的每一个点的轨迹都是一个直径相同的圆圈）。 衡量摇床工作状态的两个参数是每分钟的摇荡频 率和摇荡的位移距离。此外，运转是否平稳和承 载重量是购买时需要考虑的指标。
第一节 细胞悬浮培养的方法和特点
细胞悬浮培养技术操作方法
细胞悬浮培养技术操作方法细胞悬浮培养技术是一种将细胞悬浮在培养基中进行培养的方法，通常使用铺底培养法（adherent culture）相反。
这种培养方法适用于需要大量细胞且细胞生长速度快的细胞类型，比如淋巴细胞、白血病细胞、肝细胞等细胞线。
本文将介绍细胞悬浮培养技术的操作方法。
1. 培养基的准备细胞的悬浮培养需要用到特殊的培养基。
培养基通常包含以下组成部分：基础培养液、生长因子、血清、抗生素等。
基础培养液是细胞生长所必须的营养成分，生长因子可促进细胞增殖和分化，血清可以为细胞提供必要的营养成分，抗生素则可消除培养基中的细菌等外来微生物，以保证细胞的无菌培养。
准备培养基时要根据细胞类型的不同选择不同的基础培养液和生长因子，培养中要注意保持无菌环境。
2. 细胞的预处理在采集细胞之前，要先对细胞进行预处理。
一般步骤如下：（1）将细胞与培养基混合，然后放入离心管中离心，去掉上层液体，取出细胞沉淀。
（2）用PBS洗涤两次，去除多余的培养基和血清成分。
（3）计算细胞的浓度和活性。
（4）按需要调节细胞浓度，如需稀释时，可添加相应的培养基和血清，不要直接加水。
3. 细胞的培养（1）将经过预处理的细胞放入含有培养基的离心管中，并混匀。
（2）将细胞悬液转移至无菌的试管中，每支试管放入适量的细胞数，通常为1x106/mL。
（3）将试管放入恒温摇床或培养箱中，控制温度和CO2颓量，使其保持适宜的生长环境。
保持培养液离开平均氧化还原电位和pH，避免造成对细胞的损害。
（4）细胞的分裂时间根据不同的细胞类型而不同。
在培养过程中，要不断观察细胞的生长状况，检查并确保细胞数量不会超过最大容纳量。
培养时间的长度也根据细胞类型的不同而不同，一般为数天到数周不等。
4. 细胞提取经过一段时间的培养，细胞数量逐渐增多。
在细胞提取之前，需要先收集细胞。
收集过程如下：（1）取出培养的试管，用离心管小心地沉淀细胞。
（2）将上清部分取出，留下沉淀的细胞。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养是一种将细胞悬浮于培养基中进行培养的方法。
这种方法通常用于培养悬浮生长的细胞，如血液中的白细胞、淋巴细胞等。
下面将介绍悬浮细胞培养的方法和注意事项。
1. 准备培养基和细胞首先要准备适合的培养基和细胞。
培养基的选择要根据细胞的需求来选取，一般要添加适量的血清、营养物质等，以满足细胞的生长和分裂需求。
细胞的获取可以通过酶消化、机械剪切等方式获得，注意要保持细胞的完整性和活力。
2. 调整细胞密度将细胞悬浮于培养基中前，需要对细胞密度进行调整。
一般来说，细胞密度应该控制在适当的范围内，过高或过低都会影响细胞的生长和分裂。
可以通过显微镜观察来确定细胞密度，或者使用自动化细胞计数器进行计数。
3. 培养细胞将细胞悬浮于培养基中，放置在恒温恒湿的细胞培养箱中。
要定时观察细胞的生长情况，调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。
此外，还要注意培养箱的清洁和消毒，以避免细菌和其他微生物的污染。
4. 注意事项在进行悬浮细胞培养时，要注意以下几点：- 细胞密度控制：过高或过低的细胞密度都会影响细胞的生长和分裂，要控制在适当的范围内。
- 培养基选择：不同的细胞对培养基的要求不同，要选择适合的培养基。
- 细胞活力：细胞的获取和处理过程中要注意保持细胞的完整性和活力。
- 消毒措施：细胞培养箱的清洁和消毒很重要，要避免微生物的污染。
- 观察和调整：定时观察细胞的生长情况，及时调整培养基或细胞密度，以满足细胞的需要。
总之，悬浮细胞培养是一种有效的细胞培养方法，但要注意细胞密度、培养基选择、细胞活力、消毒措施等方面的问题。
只有在细心认真的操作下，才能获得高质量的细胞培养物。
悬浮细胞培养的基本方法
悬浮细胞培养的基本方法
悬浮细胞培养是一种常用于细胞学研究的方法，它可以使细胞在悬浮液中自由生长繁殖，而不需要附着于培养基底上。
以下是悬浮细胞培养的基本方法：
1.选取适当的细胞：不同的细胞对悬浮培养的条件要求不同，因此应选择适合悬浮培养的细胞。
2.制备培养液：悬浮细胞培养需要特定的培养液，其中包含细胞所需的营养物质和生长因子。
常用的培养液包括DMEM、RPMI-1640等。
3.设置培养条件：温度、湿度、氧气浓度、培养液pH等条件都需要适当的调整，以适应细胞的生长。
4.稳定细胞生长：将细胞接种于培养瓶中，并保持培养液中的细胞浓度在适当范围内，避免过度密集或过度稀疏。
5.观察细胞生长状态：定期观察细胞的生长、分裂和存活率，及时添加新的培养液和适当的生长因子，确保细胞在良好的生长状态下进行悬浮培养。
以上就是悬浮细胞培养的基本方法，它可以为细胞生长提供极其自由舒适的环境，从而更好地进行生命科学的研究。
悬浮细胞培养
悬浮细胞培养（颜秋生、张雪琴）悬浮细胞培养是指已建立的愈伤组织或离体的植物细胞，转移到液体培养基中进行无菌振荡培养。
用这种培养方法所得的细胞，较为均匀一致，它不仅为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统，而且细胞增殖速度快，适于进行大规模培养，在植物产品工业化生产上有巨大的应用潜力。
1仪器设备超净工作台、高压灭菌器、旋转摇床、台式离心机、荧光显微镜、刻度离心管(15ml)、三角瓶(300ml)、吸移管等。
2操作方法2.1悬浮细胞的培养2.1.1愈伤组织的诱导：经过表面清毒的植物外植体，置于含有适当激素的固体培养基上，即可建立起组织培养物。
通常使用的激素包括生长素和细胞分裂素。
在这种培养基上，外植体愈伤组织化，这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。
把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，这个过程称做继代。
通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。
2.1.2分批悬浮培养一般技术：把已建立的外观松散、生长快、浅黄色的愈伤组织转移到含有液体培养基的三角瓶中，然后置于旋转摇床上不断振荡，由此得到的培养物叫做“悬浮细胞培养物”。
在培养过程中，除了气体和挥发性代谢产物可以同外界空气交换外，一切都是密闭的。
培养所用的容器一般是100-250ml三角瓶，每瓶中装有20-50ml培养基。
摇床的转速是可控的，对于大多数植物组织来说，以转速30-150转/分为宜，冲程范围应在2-3cm左右。
转速过高或冲程过大会造成细胞的破裂。
当培养基中的主要营养物质耗尽时，细胞的分裂和生长即行停止。
为了使培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜培养基中（大约稀释5倍)。
培养用的液体培养基，对某一特定种而言，凡适合愈伤组织生长的培养基，只要除去其中的琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。
细胞悬浮培养
3.细胞密实体积
为了测定细胞密实体积（packed cell volume, PCV )，将一已知体积的均匀分散的悬浮液 （10~20 mL）放入一个刻度离心管（15~50 mL） 中，在2 000~4 000 r/min下离心5 min。细胞密实 体积以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示。
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(4)镁、钾、钙
到目前为止，几个报道已经表明，这些大量元 素是绝对必要的。有关这些元素如K＋的最适浓度 （胡萝卜为l mmol/L,矮牵牛和烟草为20 mmol/L)的 研究认为，不同培养物在吸收能力方面存在差异。 例如，在大豆等植物的培养中，在培养期间几乎所 有的K＋都被培养细胞所吸收；相反，在烟草的细 胞培养中，发现到了培养末期仍有最初浓度（20 mmol/L）的一半的K＋留在培养基中未被利用 （Kato等，,1977)。
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为了使分批培养的细胞能不断增殖，必须进行继代，方 法是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转移到成分相同的新鲜 培养基中（大约稀释5倍）。
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滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细 胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。
当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较长， 而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。
如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞 或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能 生长。
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（二）抑制法
使用DNA合成抑制剂如5-氨基尿嘧啶、羟基脲和 胸腺嘧啶脱氧核苷等，也可使培养细胞同步化。当 细胞受到这些化学药物的处理之后，细胞周期只能 进行到G1期为止，细胞都滞留在G1期和S期的边界 上。当把这些抑制剂去掉之后，细胞即进入同步分 裂。应用这种方法取得的细胞同步性只限于一个细 胞周期。
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化学方法的原理是使细胞遭受某种营养饥饿，或 是通过加人某种生化抑制剂阻止细胞完成其分裂 周期。化学方法中常用的有饥饿法和抑制法两种。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养是一种将细胞悬浮在培养基中进行培养的方法。
相比于贴壁细胞培养，悬浮细胞培养可以更好地模拟细胞在体内的环境，因此被广泛应用于细胞生物学、药物筛选等领域。
在进行悬浮细胞培养时，需要注意以下几点：
1. 培养基的选择：不同类型的细胞需要不同的培养基，通常包括基
础培养基、补充物和生长因子等。
在选择培养基时需要根据细胞类型和实验要求进行选择。
2. 细胞密度的控制：悬浮细胞培养中，细胞密度的控制是非常重要的。
密度过低会导致细胞生长缓慢，而过高则容易导致细胞凋亡。
在不同的实验中，所需的细胞密度也不同，需要根据实验要求进行调整。
3. 细胞培养的环境：细胞需要适宜的培养环境才能正常生长，包括
适宜的温度、二氧化碳浓度和湿度等。
在进行悬浮细胞培养时，需要确保培养环境的稳定性和一致性。
4. 细胞的检测和分离：在培养过程中，需要对细胞进行定期检测，
并在必要时进行分离。
常用的方法包括离心、贴壁培养等。
在进行细胞分离时，需要注意不要对细胞造成伤害，避免影响实验结果。
总之，悬浮细胞培养是一种重要的细胞培养方法，需要严格遵守操作规程，并注意培养基的选择、细胞密度的控制、培养环境的稳定性和细胞的检测和分离等。
只有在操作规范、技术娴熟的情况下，才能获得准确、可靠的实验结果。
悬浮细胞培养方法和注意事项
悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养方法和注意事项悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养技术，适用于无法附着于培养皿底的细胞，如血液细胞、淋巴细胞等。
以下是悬浮细胞培养的方法和注意事项。
悬浮细胞培养方法：1. 准备培养基：将完整的无血清培养基预先冷却，最好使用无菌操作。
2. 细胞分离：将需要培养的悬浮细胞从组织中分离出来。
一般的方法是通过离心或梯度离心分离细胞。
3. 调整细胞密度：根据需要培养的细胞数量，调整细胞密度。
通常使用仪器进行计算，以确保细胞密度在适当范围内，不过也可以通过肉眼观察来估算细胞浓度。
4. 加入培养基：将细胞悬浮液与冷却的培养基混合，使其均匀悬浮。
5. 培养：将混合好的细胞悬浮液置于培养箱内，设置适当的温度、CO2浓度和湿度。
一般情况下，细胞应该在无菌的条件下进行培养。
悬浮细胞培养注意事项：1. 良好的无菌操作：悬浮细胞容易被外界污染，因此进行悬浮细胞培养前，一定要保证无菌操作的严格。
使用消毒剂清洁工作区域和器具，穿戴好手套，确保操作环境和器具的洁净。
2. 细胞密度的调整：细胞密度的过低可能导致细胞生长缓慢，而过高则可能导致细胞的死亡或分化。
因此，选择适当的细胞密度进行调整很重要，可以通过显微镜或细胞计数仪进行测量。
3. 培养基的选择：悬浮细胞培养所使用的培养基应该与细胞类型相匹配，以确保细胞在培养中获得足够的养分和生长因子。
4. 培养条件的调整：不同类型的细胞对温度、CO2浓度和湿度要求不同，因此应该根据具体细胞类型进行调整。
在培养过程中，应定期检查细胞生长状态，以便及时调整培养条件。
总之，悬浮细胞培养是一种常用的细胞培养技术，需要进行严格的无菌操作和细胞密度、培养基和培养条件的合理选择。
只有正确的操作和调整，才能获得稳定的细胞培养效果。
悬浮培养流程
悬浮培养流程
答案：
1.将准备好的冻存细胞放入37℃水浴中解冻。
2.用70%乙醇对顶端进行消毒，用吸管将细胞转移到含有5miwan全MEM-10培养基的25cm2组织培养瓶中，轻轻摇动培养瓶，使细胞均匀分布于培养瓶中，放入5%C02加湿培养箱中37℃培养过夜。
3.将培养基吸出，用0.5ml37°℃的胰酶/EDTA覆盖细胞，消化30~40s。
4.加入10ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞转移至50ml的离心管中。
室温1800g离心5min，弃上清。
5将细胞沉淀悬浮在5ml的旋转瓶wan全培养基-5中，上下吹打，将细胞团打散。
6.在100ml或200ml通气旋转瓶中加入50ml旋转瓶wan全培养基-5，并将细胞悬液转移到瓶中。
7.取出1ml细胞悬液，用血细胞计数器进行细胞计数。
加入适量的旋转瓶wan全培养基-5，使细胞密度为(3~4)x105细胞/m1。
将细胞放入无CO2培养箱，37℃旋转培养，
8.随后的两天让细胞继续生长，并且每天对细胞进行计数，加入适量的旋转瓶wan全培养基-5以维持(3~4)x105细胞/ml的细胞密度
9.取1ml的细胞县液，用血细胞计教器对细胞进行监测。
10.当细胞密度达到(4~5)x105细胞/ml时，隔天或每天用培养基将细胞稀释至1.5x105或2.5x105细胞/ml。
11.分别将装有50ml或100ml细胞县液的100ml或200ml通气旋转瓶放入37℃C无CO2培养箱旋转培养。
每天或隔天传代。
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细胞悬浮培养摘要：悬浮培养是非贴壁依赖性细胞的一种培养方式，是一种十分有用的实验体系，在液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交流，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作和生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供前期技术基础。
但该技术目前在国内尚未得到广泛应用，生物制品生产仍主要采用病毒产率低、生产成本高、劳动强度大的转瓶细胞培养方式。
随着现代生物技术发展，利用细胞悬浮培养技术进行生物制品生产是生物制药行业发展的必然趋势。
关键词：单个细胞细胞悬浮培养愈伤组织同步化1．细胞悬浮培养的定义定义1：细胞悬浮培养（cell suspension culture）是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术[1]。
应用学科：细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）定义2：在流动的液体培养基中培养非贴壁的悬浮细胞或小细胞团的细胞或组织的培养方法。
细胞附着在微运载体上的培养也是一种悬浮培养。
应用学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）2．单细胞制备的方法2.1 机械法早期用机械法分离叶组织单细胞。
Ball和joshi（1965）、joshi和noggle（1967），以及joshi和Ball（1968）曾先后用小解剖刀从花生成熟叶片中刮离体细胞，这些离体细胞可直接在液体培养基中培养，很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。
随后，人们用机械法相继从菠菜、大豆和石刁柏等多种植物中分离得到叶肉细胞，并能够分裂和形成愈伤组织。
Rossini（1972）指出，只有在薄壁组织排列松散、细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功[2]。
2.2 酶解法酶解法分离单细胞主要是利用果胶酶将细胞之间的中胶层解离，获得分散的细胞。
人们最早用果胶酶处理烟草叶片，分离到大量有代谢活性的叶肉细胞，将这种方法用到了18种其它草木植物上也获得成功。
由于果胶酶不仅能降解细胞之间的中胶层，而且还能软化细胞壁，因此在用酶解法分离细胞的时候必须对细胞给予渗透压保护，即在酶液中加入一定浓度的渗透压稳定剂。
酶解法一般利用叶片作为分离细胞的材料，但此法不能分离单子叶作物如小麦、大麦和玉米的叶肉细胞[3]。
2.3 愈伤组织诱导法以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先必须诱导出适宜的愈伤组织。
用于建立悬浮系的愈伤组织必须有较好的松散行，使之在悬浮培养的起始阶段细胞容易打散。
同时，愈伤组织还必须具备较强的增殖和再生能力。
诱导符合这些要求的愈伤组织，首先，必须选择适宜的植物外植体材料。
其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响。
由于一般愈伤组织的细胞并不是均匀一致的，直接由外植体诱导的愈伤组织，若不经过继代则很难获得均匀一致的疏松性。
只有在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致、疏松易碎、适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。
由愈伤组织建立悬浮培养细胞系是目前细胞培养中广泛采用的一种方法。
3. 悬浮培养的条件一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个基本条件：一是悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；二是均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；三是生长迅速。
要建立良好悬浮细胞系需注意以下事项：不同的培养基可以使愈伤组织具有不同的生长速度，结构也可松可紧，利用这些特征可使愈伤组织分散成为单细胞或很小的细胞团。
诱导出疏松易碎的愈伤组织对以后建立悬浮细胞系可以起到事半功倍的效果。
一般用颗粒细小、疏松易碎、外观湿润、鲜艳的白色或淡黄色的愈伤组织，比较疏松易碎，经过几次筛选、继代稳定后，可以用于诱导悬浮细胞系。
用于培养愈伤组织的培养基，可以继续用于悬浮培养，这种培养基就称为条件培养基（conditioned medium），但遇到悬浮细胞变褐、生长很慢或停止等，就要用心得培养基。
悬浮细胞进行继代与选择的方法有：将培养物摇匀，静置片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物（此处细胞团小而均一，胞质浓厚），也可通过过滤收集到小细胞团进行继代培养[4]。
4. 细胞初始培养细胞初始悬浮培养的做法是，把适宜的愈伤组织转移到三角瓶或其他适当容器里的液体培养基中，将容器置于摇床上振荡培养。
振荡培养作用是：○1可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们分散成小细胞团和单细胞；○2振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布；○3液体培养基的运动促进培养基和容器内空气之间的气体交换，避免细胞缺氧而抑制生长。
根据培养基在容器中的运动方式来区分，有4中振荡培养方法：即○1旋转培养。
培养瓶呈360º的缓慢旋转移动，使细胞培养物保持均匀分布和保证空气供应。
○2往返振荡培养。
机器带动培养瓶在一直线方向往返振荡。
○3旋转振荡培养。
机器带动培养瓶在平行面上作旋转振动。
○4搅动培养。
利用搅拌棒不断转动，使培养基被搅动。
5. 细胞悬浮培养的类型5.1分批培养（batch culture ）分批培养在小规模和大规模细胞培养中都适用，不同的是前者适用的培养容器小，而后者适用大容器的生物反应器[5]。
通过生物反应器的培养中，为了控制PH 值而进行酸碱的添加，但在培养结束之前不进行培养基成分的添加和产物的回收等。
所以，由于培养基成分的浓度随时间而不断减少，所以细胞和产物的产量等受到加入的培养基成分和产生的抑制物质的积累等的影响[6]。
在分批培养中，细胞数目增长的变化情况表现为S 形曲线。
细胞数与培养时间关系示意图培养初期悬浮细胞处于滞后期，细胞很少分裂；进入对数生长期后，细胞分裂活跃数目迅速增加；经过3~4个细胞世代之后，培养基中某些营养物质已经耗尽，或是有毒代谢产物的积累，增长逐渐缓慢，进入静止期后，增长完全停止[7]。
5.2 连续培养(continuous culture)滞后期对数生长期减慢期静止期细胞数连续培养是通过控制加入定量的营养物质使细胞生长率和细胞密度保持不变的一种培养方式，主要用于研究和生产次生代谢物质[8]。
连续培养主要用于大规模细胞培养，通过添加新鲜培养液和排放已利用的培养液来平衡营养水平，使培养细胞长期处于静止期状态。
连续培养又分封闭式和开放式连续培养。
两者的区别是，前者排放出的培养液中有培养细胞，将这些细胞收集后又置于原容器中培养，所以培养细胞能持续增加；后者排放出的培养液也有培养细胞，但不将培养细胞放回原容器。
开放式连续培养有2种类型，即通过恒化器的连续培养和通过恒浊器的连续培养[9]。
连续培养中伴随着长期的培养操作。
所以在连续的新鲜培养基的供应和长期的氧供应、细胞送回操作等中杂菌污染的危险性增大[10]。
6.悬浮培养细胞的同步化细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期[11]。
由于植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。
但通过一些物理和化学处理，可以使细胞同步化状态获得一定程度的改善，实现部分同步化。
6.1 物理方法6.1.1 体积选择法通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中，从而可能保持相同培养体系中的细胞具有较好的一致性。
这种方法的优点是操作简单，分选细胞维持了自然生长状态，因而不会有其它处理所带来的对细胞活力的影响[12]。
6.1.2 低温处理法冷处理也可以提高培养体系中细胞同步化的程度。
收集细胞，在4摄氏度温度下处理数天，添加新鲜培养液。
6.2 化学方法6.2.1 饥饿法饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。
在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，而导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可以重新恢复。
饥饿导致的细胞分裂受阻，常常使细胞不能合成DNA，即不能进入S期；或细胞分裂不能进行，即不能进入M期[13]。
6.2.2 抑制法通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期-----G1期的同步化细胞[14]。
7. 国内悬浮培养技术产业化存在的挑战和展望7.1 国内悬浮培养技术产业化的挑战国际上反应器悬浮培养技术已广泛用于生物制药生产，且在高表达细胞株的构建、个性化培养基的研发等方面不断发展。
大量新建反应器和产物表达量的提高已导致反应器容量过剩，发达国家市场出现饱和、向发展中国家扩展的趋势。
各大生物制药巨头开始通过合作或购并等方式进入新兴的中国市场。
制药巨头赛诺菲-安万特看中中国兼具研发和新兴市场这两种特质，在药品研发、生产、包括动物疫苗生产等领域在中国进行了大量投资；而诺华公司则在2009年底，通过收购中国第二大甲流疫苗供应商—浙江天元生物股权，快速进军中国疫苗行业。
7.2 展望应该认识到，快速实现悬浮培养技术在疫苗生产中的应用只是搭建了一个升级的工艺平台，而不是最终目的，行业和企业发展真正的动力是新药、新疫苗、新工艺以及配套技术的创新。
例如：无血清培养病毒生产技术的开发，包括无血清培养基的开发；利用合适的培养基和转染或驯化技术实现贴壁细胞的悬浮培养构建；新宿主细胞表达品种开发，如同一种产品采用新的宿主细胞表达或是开发一种高效表达的宿主细胞适应几种产品的表达；利用基因工程技术，开发更安全的疫苗品种；以及生物制品相关的关键技术和产品国产化，如个性化细胞培养基、生物反应器、微载体、纯化装置、佐剂等。
参考文献1、谢从华，柳俊，植物细胞工程，高等教育出版社，2004，p130-1312、李胜，李维，植物组织培养原理与技术，化学工业出版社，2008，p1673、肖尊安，植物生物技术，化学工业出版社，2005，p834、周维燕，植物细胞工程原理与技术，中国农业大学出版社，20015、佐天榮三，小林猛，本多裕之：生物工学序，p1146、日本生物工会学，生物工程，科学出版社，2008，p365-3667、潘瑞炽，植物细胞工程，广东高等教育出版社，2006，p978、小林猛，本多裕之：生物化学工学，p98，东京北学同人(2002)9、姬研茹等，生物技术通报，2005，p4110、小林猛，本多裕之：生物化学工学，p92，东京北学同人(2002)11、李宝健，曾庆平，植物生物技术，湖南科学出版社，1990，p25612、李志勇，细胞工程，科学出版社，2006，p5613、司徒镇强，吴军正，细胞培养，世界图书出版公司，199614、刘国民等，实用植物组织培养技术教程，甘肃科学技术出版社，200215、林世康，胡云龙，施国民，动物细胞无血清培养基的应用及研究进展[J/OL]，细胞生物学杂志，2000年03期16、陈志南，杨向民，基于抗体等重组蛋白表达产品的哺乳动物细胞大规模发酵技术[J/OL]，中国医药生物技术，2009 年10 月第4 卷第5 期。