测序cheaper-sequencing

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测序覆盖率低的原因

测序覆盖率低的原因英文回答：The low sequencing coverage can be attributed to several factors. One possible reason is the presence of repetitive sequences in the genome. Repetitive sequences are regions of DNA that are repeated multiple times, making it difficult for the sequencing technology to accurately determine the number of repeats. As a result, these regions may be poorly covered or completely missed during sequencing. For example, if a repetitive sequence is not fully covered by sequencing reads, it would result in a lower coverage for that particular region.Another reason for low sequencing coverage could be the presence of sequencing errors. Despite advancements in sequencing technologies, errors can still occur during the sequencing process. These errors can lead to incorrect base calls, resulting in low quality reads. Low quality reads are more likely to be discarded during the data processingsteps, leading to a lower overall coverage. For instance,if a sequencing error occurs in a region that is criticalfor the coverage calculation, it could significantly impact the final coverage value.Furthermore, the presence of GC-rich or AT-rich regions in the genome can also contribute to low coverage. These regions have a high percentage of guanine-cytosine (GC) or adenine-thymine (AT) base pairs, respectively. GC-rich regions can be challenging for sequencing technologies asthe high GC content can cause issues with DNA denaturation and amplification. Similarly, AT-rich regions can bedifficult to sequence due to the weaker hydrogen bonding between adenine and thymine. As a result, these regions may have lower coverage compared to other regions in the genome.In addition, low sequencing coverage can be caused by inadequate library preparation. Library preparation is a crucial step in the sequencing workflow, and any errors or inconsistencies during this process can result in low coverage. For example, if the DNA fragments are notproperly fragmented or size-selected, it can lead to biasedrepresentation of certain regions in the library. This bias can then translate into lower coverage for those regions during sequencing.Lastly, technical limitations of the sequencing platform can also contribute to low coverage. Different sequencing platforms have different capabilities and limitations, and some platforms may inherently have lower coverage compared to others. For instance, certain sequencing platforms may have limitations in read length or throughput, which can impact the overall coverage. Additionally, the sequencing depth or number of reads generated per sample can also affect the coverage. If the sequencing depth is not sufficient, it can result in lower coverage for the target regions.中文回答：测序覆盖率低的原因有多种。

第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介

第三代测序技术（单分子实时DNA测序）与第二代测序技术（高通量测序技术）简介第三代测序技术(单分子实时DNA测序)与第二代测序技术(高通量测序技术)简介第三代测序技术简介如果有人告诉你用显微镜实时观测单分子DNA聚合酶复制DNA，并用它来测序，你一定会认为他异想天开，没有一点生物的sense。

我最初就是这样认为的，然而它不仅可以实现，而且已经实现了～这个就是被称为第三代的测序技术，Pacific Biosciences公司推出的“Single Molecule Real Time(SMRT) DNA Sequencing”(单分子实时DNA测序)。

我有幸在NIH听到了这个技术发明人Stephen Turner博士的讲座，根据自己粗浅的理解记录整理一下。

要实现单分子实时测序，有三个关键的技术。

第一个是荧光标记的脱氧核苷酸。

显微镜现在再厉害，也不可能真的实时看到“单分子”。

但是它可以实时记录荧光的强度变化。

当荧光标记的脱氧核苷酸被掺入DNA链的时候，它的荧光就同时能在DNA链上探测到。

当它与DNA链形成化学键的时候，它的荧光基团就被DNA聚合酶切除，荧光消失。

这种荧光标记的脱氧核苷酸不会影响DNA聚合酶的活性，并且在荧光被切除之后，合成的DNA链和天然的DNA链完全一样。

第二个是纳米微孔。

因为在显微镜实时记录DNA链上的荧光的时候，DNA链周围的众多的荧光标记的脱氧核苷酸形成了非常强大的荧光背景。

这种强大的荧光背景使单分子的荧光探测成为不可能。

Pacific Biosciences公司发明了一种直径只有几十纳米的纳米孔[zero-mode waveguides (ZMWs)]，单分子的DNA聚合酶被固定在这个孔内。

在这么小的孔内，DNA链周围的荧光标记的脱氧核苷酸有限，而且由于A，T，C，G这四种荧光标记的脱氧核苷酸非常快速地从外面进入到孔内又出去，它们形成了非常稳定的背景荧光信号。

而当某一种荧光标记的脱氧核苷酸被掺入到DNA链时，这种特定颜色的荧光会持续一小段时间，直到新的化学键形成，荧光基团被DNA聚合酶切除为止(见图)。

DNA的质量监测通常有两个方法

2）DNA的质量监测通常有两个方法：首先OD260/OD280比值应该在1.8左右（1.7-1.9），否则意味着DNA样品中存在大量的蛋白质或RNA污染。

其次，琼脂糖电泳分析时应主要以超螺旋条带为主。

最多不超过三条带（分别为超螺旋DNA，线性化DNA和环状DNA）。

否则意味质粒DNA的质量不高，应该重新制备。

2.限制性内切酶的活性1）限制性内切酶一般需要低温保存，而且反复的升降温过程对酶活性的损害很明显。

因而为了确保在有效期内的限制性内切酶不会失活，限制性内切酶的日常保存和使用应当很小。

2）建议购买具有保温功能的冻存盒保存限制性内切酶（-20度），而且取用限制性内切酶时，也应该使用具有保温功能的冻存盒，尽量防止酶的温度反复出现大的波动。

3.限制性内切酶的用量1）限制性内切酶的单位定义通常为：在合适的温度下，完全消化1ugDNA底物所需的酶量定义为一个单位。

2）在这个单位定义中，有几个不确定因素：首先是底物，不同的酶单位定义是选择的底物可能不同（常用的几个底物DNA包括：Lambda DNA ,AD2 DNA 和一些质粒DNA）；第二个不确定因素是限制性内切酶在底物DNA上的酶切位点的个数。

由于单位定义中要求完全消化，因而底物上某个酶的酶切位点的个数的多少，就直接影响了该酶的单位定义。

3）因而，在进行酶切时，用1ul酶（一般10IU/ul）消化1ugDNA的通常做法是很不科学的，这也导致在实际工作中，大家要进行多次预实验才能确定最合适酶切条件。

4）以前，我推荐了一个在线的双酶切设计软件，double digestion designer, 可以精确地计算酶切时的限制性内切酶的用量。

使用中，能够注意到，用来进行双酶切的两个酶的用量有时竟然相差近20倍（EcoRI + NheI)，而且发现，小片段PCR产物（100-500bp）进行酶切时，需要的酶量比质粒DNA酶切时用量多10倍以上。

5）该软件目前可以免费使用，用户名和密码都是test。

高通量测序名词解释

高通量测序基础知识汇总一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。

二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。

NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。

基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。

基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。

DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。

脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。

RNA：Ribonucleic Acid，，核糖核酸，一个核糖核苷酸分子由碱基，核糖和磷酸构成。

htseq进行counts计算的原理

htseq进行counts计算的原理
HTSeq是一个Python包，主要用于从高通量测序数据（如
RNA-seq或ChIP-seq）的对齐文件中计算基因或区域的reads
计数。

其主要原理如下：
1. 读取对齐文件：HTSeq首先读取对齐文件（通常是
SAM/BAM格式），其中包含了每个read的比对位置信息。

2. 解析对齐信息：HTSeq解析每个read的比对信息，包括比
对在哪个染色体的哪个位置以及比对是否匹配。

3. 定义基因/区域：用户根据自己的研究目的，选择需要计算counts的基因集合或区域集合。

基因可以通过参考基因组注释
文件（如GTF文件）来定义，区域可以通过用户提供的BED
文件来定义。

4. 计数：HTSeq根据每个read的比对信息，将其分配给相应
的基因/区域。

如果一个read完全落在某个基因/区域内，那么
该read将被计为该基因/区域的一个count。

如果一个read部
分落在某个基因/区域内，那么会根据不同的算法来分配一个fractional count给基因/区域。

5. 输出：HTSeq将计算后的counts输出为一个表格或者文件，其中每一行代表一个基因/区域，每一列代表一个样本，每个
单元格的值为对应基因/区域在该样本中的counts。

总之，HTSeq通过解析对齐文件，并根据用户定义的基因/区
域来计算reads的counts，从而得到了不同基因/区域在样本中的表达水平。

这些counts可以用于后续的差异表达分析、基因表达分析等。

单细胞测序技术——从基因表达到突变检测

单细胞测序技术——从基因表达到突变检测随着生命科学技术的迅猛发展，测序技术也随之不断更新。

在最新的测序技术中，单细胞测序技术可以说是一种非常重要的技术。

与传统的批量测序技术不同，单细胞测序技术可以对单个细胞进行测序，获得单细胞水平的信息。

本文将从基因表达到突变检测这两个方面来介绍单细胞测序技术。

一、基因表达测定基因是遗传信息的基本单位，它通过转录成为 RNA 分子，进而被翻译成蛋白质，来完成对生物体的调控和表达。

在传统的批量测序技术中，大量细胞混合在一起，使得基因表达数据存在种种噪音和偏差，难以精确地研究不同类型细胞间的差异性。

而单细胞测序技术可以获得单个细胞的基因表达信息，从而解决以上问题。

目前，单细胞测序技术主要分为两种：基于微流控芯片的技术和基于膜片染色技术的技术。

前者是通过微流控芯片将单个细胞捕获进氢氧化盐水滴中，再分别分装到独立反应室，分别应用PCR扩增等方法进行基因序列测序。

后者则是将单个细胞分别分装到涂在玻璃片上的单元中，溶解后进行反应扩增等。

基因表达测定的数据分析主要有两大类：one-sample analysis 和differential analysis。

one-sample analysis是对单个细胞进行基因表达谱的分析，主要是绘制某个基因的表达、不均匀性和遗传标记等。

differential analysis则是通过比较不同的细胞，寻找它们之间的差异，如基因型、表达谱、开关元件、微环境等。

二、突变检测癌症是基因突变的结果，而单个单个细胞的突变程度不同，所以对单个单个细胞进行基因突变测序是解决人类癌症研究难题的重要途径之一。

此外，单细胞测序技术还可以帮助研究器官发育，了解体内细胞的分化及神经科学等诸多学科。

单细胞测序技术的突变检测可以分为 Point mutation、indel mutation和 Structural variation 三大类。

其中 Point mutation包括Base substitution和tandem repeat expansion；indel mutation 包括deletion、insertion、mini-satellite variation和Complex variations；Structural variation 包括 Copy number variation和Inversion等。

《二代测序简介》PPT课件

陈竺，日本血吸虫基因组
.
10
Next-Gen Platforms
GA – Illumina/Solexa
SBS with reversible fluorescent terminators
GS FLX – Roche/454 Life Sciences
SBS through pyrosequencing
• 宏基因组学（Metagenomics） • 泛基因组学（Pangenomics）
.
3
3
Key Genomics Technologies
1975 - Southern DNA hybridization technique
1977 - Sanger’s chain-termination and Maxam、Gilbert’s
.
6
Limitation of 1st Gen Sequencer
Throughput
Time-consuming separation of chainterminated fragments
Hard to produce massively parallel system based electrophoretic separation
Template DNA immobilized on primer coated capture beads thru hybridization (1 fragment on each bead)
Thermocyle to amplify (forward primer is biotinylated)
– Asymetric Adaptors ligated (one biotinylated)

测序基础知识--整理

测序基础知识--整理测序：如何计算测序深度，或产出的数据量？ 10的9次⽅=1G 如果测序的read是pair-end的、且每条read长150bp，则，平均测序深度为=（reads数×150bp×2）/（3*10的10次⽅）。

即：测序得到的碱基总数/⼈类基因组的碱基对数=平均测序深度。

⽐如，我想得到30x的测序数据，那么需要的数据量是90G的数据。

（此处，还不甚了解，我觉得应该是900G的数据啊）（⼈类基因组有30亿个碱基对（3*10的10次⽅））测序错误率：⼀般选择的阀值是10的-3次⽅，即测序错误率是0.001。

（PCR的错误率是10的-6次⽅） coverage与depth的概念：coverage指的是测序数据覆盖的⼈类基因组的碱基数。

depth指的是平均每个碱基被测序read覆盖的次数（即被测到的次数）。

index的含义：index⽤来区分不同的样本。

单端index共6个碱基，排列组合，共4的6次⽅个碱基，⽆法区分66个样本。

故，需要采⽤双端index。

双端index，分为i5和i7端。

i5端有8个碱基，i7端有12个碱基。

测序的cycle：⼀个cycle读取⼀个碱基。

也称为：base call。

若有index序列，则测序仪会多读⼏个cycle。

⽂库构建：加Y型adapter的⽬的：1）区分read1和read2，即DNA链的两端；2）防⽌adapter⾃连。

Y型adapter不是互补的，两端的序列不⼀致。

10ng的DNA就可以建库，测序。

WGS：全基因组的重复率是20%，⽤picard统计duplicate的⼯具（原理：map位置相同，cigar值相同）。

建库流程：提取全基因组，打断、末端不平加A，加adapter，PCR扩增，测序。

区别cfDNA的靶向建库：cfDNA已经是断裂的⽚段，所以不需要打断、末端补平加A的步骤，只要提取游离DNA后，⽤引物扩增即可。

二代测序pooling原理

二代测序pooling原理
二代测序（Next Generation Sequencing, NGS）中的pooling
是指将多个样本的DNA混合在一起进行测序的过程。

这样做的主要
目的是为了提高测序效率、降低成本，并且可以同时对多个样本进
行测序分析。

首先，让我们从测序效率方面来看pooling的原理。

在实际操
作中，如果每个样本单独进行测序，会消耗大量的测序试剂和时间。

而通过将多个样本的DNA混合在一起后再进行测序，可以将这些样
本的测序数据同时生成，从而提高了测序效率。

这种高通量测序的
方式可以节约时间和成本，特别适用于大规模的基因组学研究和临
床检测。

其次，从成本方面来看，pooling的原理也能够降低测序成本。

因为在进行混合测序时，可以减少测序试剂的使用量，同时减少了
测序仪器的运行时间，从而降低了每个样本的测序成本。

另外，从数据分析的角度来看，测序后的数据需要进行分析和
解读。

在进行数据分析时，需要注意将混合测序后的数据进行解混，即将数据还原到各自的样本中。

这需要利用生物信息学的方法对数
据进行分离和比对，以确保每个样本的数据都能够被正确地分析和
解读。

因此，在进行pooling测序时，需要特别注意数据分析的方
法和技术，以确保数据的准确性和可靠性。

总的来说，二代测序中的pooling原理是通过将多个样本的
DNA混合在一起进行测序，以提高测序效率、降低成本，并且可以
同时对多个样本进行测序分析。

然而，在进行pooling测序时，需
要特别注意数据分析的方法和技术，以确保数据的准确性和可靠性。

oxford nanopore长读测序方法

Oxford Nanopore长读测序技术（Oxford Nanopore Long-Read Sequencing）是一种先进的DNA测序方法，通过利用纳米孔技术实现对DNA分子的高效测序。

本文将从技术原理、应用优势以及发展前景等方面对Oxford Nanopore长读测序方法进行详细介绍。

一、技术原理Oxford Nanopore长读测序技术是利用纳米孔中的离子传导来测序DNA分子。

具体而言，当DNA分子通过纳米孔时，其碱基序列会引起离子通道电流的微小变化。

通过检测这些电流变化，就可以确定DNA分子的碱基序列。

其测序原理更加简单易行，相较传统测序方法，Oxford Nanopore长读测序技术显著降低了测序成本和时间。

二、应用优势1. 长读长度：Oxford Nanopore长读测序技术能够实现长达数十KB的DNA分子测序，使其在测序复杂基因组、发现基因组结构变异等领域具有明显优势。

2. 实时测序：相较于传统测序方法，Oxford Nanopore长读测序技术可以实现实时测序，极大地提高了测序效率。

3. 便携性：该技术的测序设备小巧轻便，可随时携带进行测序实验，极大提高了测序的灵活性和便捷性。

三、应用前景Oxford Nanopore长读测序技术已经在各个领域展现出了广阔的应用前景。

在生物医学领域，它可以用于快速测序病原体、分析个体基因组结构等实践；在农业科学领域，可应用于植物和动物基因组的测序和改良；在环境保护领域，可用于测序微生物裙落等。

Oxford Nanopore长读测序技术以其独特的测序原理、应用优势和潜在前景，成为DNA测序领域中备受瞩目的技术之一。

在未来，随着技术不断的改进和完善，相信这一技术将会在各个领域发挥更加重要的作用。

四、技术改进与发展Oxford Nanopore长读测序技术自问世以来，经过不断改进和发展，已经取得了巨大的进展。

在测序精度上，科研人员通过改进纳米孔技术和信号处理算法，大幅度提高了测序的准确性，尤其是在重复序列和基因组结构变异的测序中取得了显著的改进。

macs2 bdgdiff原理

macs2 bdgdiff原理Macs2 bdgdiff是一种常用的基因组比较工具，用于比较两个ChIP-seq测序实验的测序深度数据，以便找出两者之间的差异。

本文将介绍Macs2 bdgdiff的原理及其在基因组学研究中的应用。

我们需要了解什么是ChIP-seq。

ChIP-seq是一种广泛应用于基因组学研究的技术，用于研究蛋白质与DNA之间的相互作用。

通过将特定的抗体与某个蛋白质结合，然后将其与DNA交联，并通过测序分析DNA片段的分布情况，可以确定蛋白质与DNA结合的位置。

在ChIP-seq实验中，测序深度数据是衡量蛋白质与DNA结合强度的重要指标。

Macs2 bdgdiff就是用来比较两个ChIP-seq实验的测序深度数据，找出两者之间的差异。

Macs2 bdgdiff的原理是基于两个重要的统计模型：基因组均一性模型和差异性模型。

基因组均一性模型假设两个实验之间的测序深度分布是相同的，差异性模型则假设两个实验之间的测序深度分布存在差异。

Macs2 bdgdiff通过比较这两个模型的拟合度来确定差异。

具体来说，Macs2 bdgdiff首先会对两个实验的测序深度数据进行平滑处理，以减少噪音的影响。

然后，它使用基因组均一性模型拟合两个实验的测序深度数据，并计算出拟合度得分。

接下来，Macs2 bdgdiff使用差异性模型拟合两个实验的测序深度数据，并计算出拟合度得分。

最后，Macs2 bdgdiff通过比较基因组均一性模型和差异性模型的拟合度得分，确定差异区域。

Macs2 bdgdiff的应用非常广泛。

例如，在研究转录因子结合位点时，可以使用Macs2 bdgdiff来寻找在不同条件下转录因子结合位点的变化。

另外，Macs2 bdgdiff还可以用于寻找在不同组织或细胞类型中基因表达水平的差异。

Macs2 bdgdiff是一种常用的基因组比较工具，可以用于比较两个ChIP-seq实验的测序深度数据，以寻找差异区域。

单细胞测序提取特定基因表达细胞群

单细胞测序提取特定基因表达细胞群1. 引言1.1 背景介绍单细胞测序技术是一种先进的生物学技术，可以对单个细胞的基因组进行测序分析，揭示单细胞水平上的基因表达情况和细胞类型等信息。

随着技术的不断发展和成熟，单细胞测序技术在研究生物学、医学和生物信息学等领域具有广泛的应用前景。

提取特定基因表达细胞群是单细胞测序技术的一个重要应用方向。

通过筛选和标记特定基因表达的细胞，研究人员可以深入探究这些特定细胞在生物体内的功能和作用，从而为疾病诊断、药物研发等领域提供重要参考依据。

本文将介绍单细胞测序技术的基本原理和特点，探讨提取特定基因表达细胞群的方法及其在生物学研究中的应用。

通过实验设计与结果分析，我们将探讨影响因素在提取特定基因表达细胞群过程中的作用，探究技术的优势和应用前景。

希望通过本文的介绍，读者能够更全面地了解单细胞测序技术及其在提取特定基因表达细胞群方面的应用。

1.2 研究意义单细胞测序是一种可以揭示单个细胞内部基因表达情况的技术，在生物医学领域有着广泛的应用前景。

提取特定基因表达细胞群则是单细胞测序技术中的一项重要应用，可以帮助研究人员深入了解特定基因在细胞群中的表达模式和功能。

这项技术可以帮助我们发现不同细胞亚群之间的功能差异，进一步深化我们对细胞类型和功能的认识，有助于识别潜在的治疗靶点和疾病机制。

通过提取特定基因表达细胞群，我们可以更好地理解细胞群内部的细胞异质性，解析不同细胞亚群之间的相互作用和调控机制。

这对于研究细胞发育、分化、疾病发生等方面具有重要意义，有助于揭示生物系统中的复杂性。

通过单细胞测序提取特定基因表达细胞群的研究，还可以为个性化医疗、药物研发等领域提供重要参考，为精准医学的实现提供科学依据。

研究提取特定基因表达细胞群的意义重大，对于推动生命科学领域的研究和发展具有重要的促进作用。

2. 正文2.1 单细胞测序技术概述单细胞测序技术是一种能够在单个细胞水平对基因组、转录组和表观转录组进行高通量测定的技术。

全基因组重测序方法

全基因组重测序（Whole Genome Sequencing，WGS）是一种高通量测序技术，用于获取一个个体的完整基因组序列信息。

全基因组重测序方法可以揭示个体的遗传变异、基因组结构和功能等方面的信息，对于研究遗传疾病、人类进化、种群遗传学以及农业和生物多样性等领域具有重要的意义。

以下是几种常见的全基因组重测序方法：
1. Sanger测序：虽然现在已不常用于全基因组重测序，但Sanger测序是第一种用于测序基因组的方法。

该方法通过DNA链延伸的方式，使用特殊的标记测定碱基序列。

2. Illumina测序：Illumina测序是目前最常用的全基因组重测序方法之一。

它基于DNA文库的构建，将DNA片段连接到测序芯片上的特定DNA序列上。

然后，通过化学反应和光学信号检测，测定每个DNA 片段的碱基序列。

3. PacBio测序：PacBio测序利用第三代DNA测序技术，采用单分子实时测序（Single Molecule Real-Time Sequencing）原理。

它通过监测DNA聚合酶在DNA模板上的合成过程，实时测定碱基的加入顺序。

4. Oxford Nanopore测序：Oxford Nanopore测序也是第三代DNA 测序技术，基于纳米孔电流测序原理。

DNA片段通过纳米孔时，测量的电流变化与碱基序列有关，从而实现测序。

这些全基因组重测序方法各有优缺点，如测序精度、读长、覆盖度、成本等方面存在差异。

研究人员和实验室选择具体的方法通常取
决于他们的研究目标、预算以及可用的技术设备。

高通量测序：第二代测序技术详细介绍

在过去几年里，新一代DNA 测序技术平台在那些大型测序实验室中迅猛发展，各种新技术犹如雨后春笋般涌现。

之所以将它们称之为新一代测序技术（next-generation sequencing），是相对于传统Sanger 测序而言的。

Sanger 测序法一直以来因可靠、准确，可以产生长的读长而被广泛应用，但是它的致命缺陷是相当慢。

十三年，一个人类基因组，这显然不是理想的速度，我们需要更高通量的测序平台。

此时，新一代测序技术应运而生，它们利用大量并行处理的能力读取多个短DNA 片段，然后拼接成一幅完整的图画。

Sanger 测序大家都比较了解，是先将基因组DNA 片断化，然后克隆到质粒载体上，再转化大肠杆菌。

对于每个测序反应，挑出单克隆，并纯化质粒DNA。

每个循环测序反应产生以ddNTP 终止的，荧光标记的产物梯度，在测序仪的96 或384 毛细管中进行高分辨率的电泳分离。

当不同分子量的荧光标记片断通过检测器时，四通道发射光谱就构成了测序轨迹。

在新一代测序技术中，片断化的基因组DNA 两侧连上接头，随后运用不同的步骤来产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列（polony）。

每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。

之后进行引物杂交和酶延伸反应。

由于所有的克隆都是系在同一平面上，这些反应就能够大规模平行进行。

同样地，每个延伸所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，来获取测序数据。

酶拷问和成像的持续反复构成了相邻的测序阅读片段。

Solexa 高通量测序原理--采用大规模并行合成测序法(SBS, Sequencing-By-Synthesis)和可逆性末端终结技术（Reversible Terminator Chemistry）--可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。

--具有高精确度、高通量、高灵敏度和低成本等突出优势--可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究----将接头连接到片段上，经PCR 扩增后制成Library 。

hierarchical shotgun sequencing测序原理-概述说明以及解释

hierarchical shotgun sequencing测序原理-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述部分的内容可以参考如下：在现代基因组研究中，测序技术扮演着非常重要的角色。

而hierarchical shotgun sequencing（层次式散弹测序）是一种常用的测序方法，具有高效快速的特点。

其原理基于分层测序的思想，通过先分析大片段，再逐步细化测序区域，最终得到目标DNA序列。

该测序方法主要分为三个关键步骤：建库、分层测序和数据分析。

首先，通过将目标DNA进行裂解和片段化处理，得到一系列随机片段。

这些片段会被连接到载体上形成文库，然后进行扩增和纯化步骤，得到完整的测序文库。

接下来，分层测序的阶段开始进行。

先选择一部分基因组片段进行测序，产生较短的测序reads。

这些reads会被通过比对分析与已知的基因组序列进行比对，得到初始的定位。

然后，根据初始的定位信息，选择更多基因组片段进行测序。

这些片段会覆盖之前的定位区域，并扩展到周围的未测序区域。

如此循环迭代，逐渐扩展测序覆盖范围，直到覆盖整个目标DNA序列。

最后，通过数据分析和序列拼接技术，将测序所得的reads按照重叠关系进行比对和组装，得到最终的DNA序列。

相比于传统的全基因组测序方法，hierarchical shotgun sequencing 具有快速高效的优势。

它不需要对整个基因组进行测序，只需在关键区域进行深度测序，大大节省了时间和成本。

同时，该方法还可以准确地定位和组装不同基因组区域的片段，为后续的基因组分析提供了重要的基础数据。

综上所述，hierarchical shotgun sequencing是一项重要的测序技术，可以在基因组研究中发挥重要作用。

它通过分层测序的方式，高效快速地获得目标DNA序列，为基因组分析和生物信息学研究提供了宝贵的资源。

随着测序技术的不断发展，相信这一方法将在未来的研究中发挥更加重要的作用。

测序名词解释

什么是高通量测序？高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统Sanger测序（称为一代测序技术）**性的改变, 一次对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。

什么是Sanger法测序（一代测序）Sanger 法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。

直到掺入一种链终止核苷酸为止。

每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。

由于ddNTP 缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。

终止点由反应中相应的双脱氧而定。

每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。

它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

什么是基因组重测序（Genome Re-sequencing）全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。

随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。

通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。

什么是de novo测序de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。

高通量测序技术及原理介绍

高通量测序技术及原理介绍高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（“Next-generation”sequencing technology），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。

高通量测序技术应用测序技术推进科学研究的发展。

随着第二代测序技术的迅猛发展，科学界也开始越来越多地应用第二代测序技术来解决生物学问题。

比如在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。

在转录组水平上进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；或者进行小分子RNA测序（small RNA sequencing），通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。

在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。

这边需要特别指出的是第二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。

这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。

目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。

科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。

甲基化分析解决方案

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转录组测序

转录组测序今天我们来学习一些关于转录组测序的知识，从转录组的一些基本概念开始。

第一章Intron：内含子，间隔存在于真核生物细胞DNA中的序列，转录时存在于前体mRNA中，通过剪接过程被去除，最终不存在成熟的mRNA中。

Exon：外显子，真核生物DNA中的序列，与Intron对应，序列在剪接过程中不被去除，最终存在于成熟的mRNA分子中。

UTR：Untranslated regions，非翻译区，信使RNA分子两端的非编码片段。

5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽直至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子直至PolyA尾的前端。

CDS：code DNA sequence，基因编码区域，mRNA序列中编码蛋白质的序列，以起始密码子开始以终止密码子结束的片段。

转录本（Transcript)：基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。

可变剪切：从同一个mRNA前体出发，通过不同剪接方式、选择不同的剪接位点，产生不同的mRNA剪接异构体的过程，可以产生多个转录本。

融合基因：来自不同基因的外显子组合形成新的mRNA，最终产生与外显子来源基因表达产物不同的蛋白质。

start codon，起始密码子；stop codon，终止密码子转录组（Transcriptome）：特定生物体在某种状态下所有基因转录产物的总和。

链特异性文库：鉴定真核生物的反义转录本或原核生物的ncRNA。

合成第二链cDNA时用dUTP代表dTTP，使得第二链cDNA上布满含dUTP的位点，然后用特异性识别尿嘧啶的酶消化第二链，得到只包含第一链cDNA信息的文库。

转录组:转录组被测序的物种已经有一个参考基因组。

在分析数据时，不需要拼接转录本，只需要将转录组测序数据与参考基因组进行比较，就可以确定每个基因的表达水平。

无转录组:转录组被测序的物种没有参考基因组，因此需要拼接转录组数据以获得样品中的转录本信息，然后对这些拼接的转录本进行功能注释，然后将转录组数据与拼接的转录本进行比较并计算其表达水平。