第六讲固定化酶技术

NH2 + OHC
(CH 2)3
CHO + H2N
E
N
C
(CH 2)3
C
N
E
⑵异氰酸
⑶重氮联苯胺
Cl N N N N Cl + H2N E
双重氮联苯胺
N N 酶 N N N N
-HCl
N N 酶 N N N N
N N N N 酶 N N N N
N N 酶 N N
⑷碳化二亚胺
pH4.75-5.25 COOH + R N=C=C=N R + H2N E O C NH E
1. 载体结合法

该法将酶与水不溶性载体结合形成固定化酶 根据结合的形式不同，可分为：

⑴物理吸附法 ⑵离子结合法 ⑶共价结合法
载体结合法
交联法
凝胶包埋法
微胶囊包埋法
⑴物理吸附法
使酶与载体通过物理吸附形成结合。 可供选择的载体很多；无机载体有活性炭、多孔玻璃、
酸性白土、氧化铝、硅胶、羟基磷灰石、金属氧化物等；
直接在糖环上固定酶可能导致固定和传质阻力大； 在碱性条件下可接枝一个柔性手臂进行改善； 与β-硫酸酯乙砜基苯胺(SESA)反应，生成对氨基苯磺 酰乙基纤维素（ABSE-纤维素），再重氮化偶联。

接枝氨基酸的交联壳聚糖微球与酶反应，接入亲水柔
性手臂。
O OH + HO S O O CH2CH2O
O S O NH2
埋法。该法条件温和，酶不参与反应，活力回收较高。但 是，包埋法受限于底物和产物分子体积。
用于包埋的试剂多为多糖，如海藻酸盐，K-角叉菜、琼
脂、乙基纤维素及聚丙烯酰胺凝胶等。
方法有微胶囊、相分离、乳化、脂质体等。
值得注意的是聚丙烯酰胺凝胶，其聚合反应如下
过硫酸钾 H2C CH CONH 2 + H2C CH CO
第六讲
固定化酶技术

酶催化具有效率高、专一性强、速度快等优点。

但是，酶是蛋白质，分离纯化过程复杂、稳定性差，不
能反复使用，价格较昂贵。

目前，酶主要在医药、食品及高附加值化工产品上广泛
应用，其它领域则相对较少。

为扩大酶的应用范围并降低成本，有效的途径是实现酶
的多次使用或直接使用细胞；固定化酶技术就是在这种

接下来使烷基活化，最后与酶的氨基反应。
Si O Si
OH
H2N（CH2 ） OC2H5 ) 3 3 Si（ （三氧乙基丙基胺） 活化
Si O Si
O
（CH2 ） 3 NH2 Cl CS Cl
OH
O
（CH2 ） 3 NH2
γ-氨基丙基乙氧基硅烷
S Si O Si O （CH2 ） 3 NCS O （CH2 ） 3 NCS H2N E O Si O Si O （CH2 ） 3 NHC S （CH2 ） 3 NHC HN E HN E
①酰化反应

酶蛋白上的氨基与含酰化基团，如酰化叠氮、 酸酐等的聚合物发生反应。

上述反应的pH通常在7.5—8.5之间，反应温 度在4℃左右。
O C H N NH2 NaNO2 HCl
O C N3 H2N 酶
O C H N 酶
酰肼化合物
酰化叠氮化合物 (a)酶与酰化叠氮聚合物的偶联
O C O + H2N C O 含酸酐聚合物 酶
酯；在N位与酶连接的异脲。
R
OH OH
CNBr
R
OC N OH
R
OCONH 2 OH
R
O C=NH O
氨基甲酸衍生物
亚氨碳酸酯衍生物
NH R O C NH E R O C=N O 亚氨碳酸酯衍生物 E R O
O C NH E
OH 异脲型衍生物
OH 氨基甲酸酯衍生物
溴化氰法
对于纤维素载体等多糖

COOH C CH2 COOH O + NH3 固定化天冬氨酸氨化酶 H 2N COOH CH CH2 COOH
一、制备固定化酶的基本策略

⒈固定酶时，必须尽量保证其活性部位的氨基酸残 基不发生变化；

⒉避免导致酶蛋白高级结构破坏的操作（如高温、 强酸，强碱等）；

⒊尽量在温和条件下、使酶被其底物或抑制剂饱和 或抑制下进行。
NaNO2 HCl
CH2
CON3
H2N
E
CH2
CONH
E

该方法对于巯基载体适用
SH + N S S N
S
S
N H2 N E
S
S
E
2. 交联法
利用双功能基团试剂制备固定化酶的方法。 常用的试剂有戊二醛、碳化二亚胺、重氮联苯胺和马来
酸酐共聚物等。
⑴戊二醛
戊二醛使赖氨酸残基上ε-氨基参与交联。
n OHC
O C C O (b)酶与含酸酐聚合物的偶联 NH OH 酶
②芳化和烷基化反应


氨基与含有卤代芳环或卤代杂环的载体作用实现偶联。
例如用氯化三嗪活化载体，即将其连接于载体上而活化； 多糖类可与氯化三嗪连接，例如琼脂，纤维素及葡聚糖等。 该反应的速度比酰化反应慢，且要求未质子化的亲核试剂，与反应的 pH关系很大。通常在pH8.5～9.0下进行。
• 酶蛋白中，可用于共价固定酶的功能基有氨基
（Lys-ε-NH2和N-末端α-氨基）；羧基（Asp、
Glu、 C-末端α-羧基）；酪氨酸的酚羟基；半
胱氨酸的巯基；羟基（Ser、Thr、Tyr）；His 咪唑基；Trp的吲哚基等，其中以氨基和羧基最 常用。 • 共价固定酶的主要化学反应有；酰化反应、芳 化和烷基化反应、溴化氰反应、重氮化反应以 及硅烷化反应等。
成双偶氮化合物；此外，Arg胍基，Trp吲哚
基也能发生重氮化偶联。
NH2
HNO2 HCl
N
N
+
H2N pH9
E N N E
⑤硅烷化反应

无机含硅载体，例如多孔玻璃或多孔陶瓷，其来源
丰富，价格低廉，机械强度高而又耐有机溶剂，是
固定化酶的良好载体。

将无机载体与有机硅化合物（包括硅烷偶联剂）作
用，实现硅烷基化
上的咪唑基发生偶联反应，使酶固定。

偶联的结果增加了固定化酶的疏水性，不利于在水
环境发挥催化作用，但似乎有利于在疏水环境下催
化。若要在水环境中催化，可用多糖作偶联剂抵消
疏水作用。
NH2
HNO2 HCl
HO N N+ pH9
E
H N N H
E

除Tyr、His以外，蛋白质N末端上α-氨基和
赖氨酸上ε-氨基也能与活化载体偶联，形
⑸二环氧化物

用两末端都含有环氧基团的化合物 ,如1,4-丁二醇二缩水甘油醚，
二环氧辛烷，与具有亲核性的基团，如羟基、伯氨基或巯基作用
（与羟基作用在高pH、氨基在弱碱性）
O R' O R O OH R O R' OH R' OH O R
R
OH
+
O R OH + R'
O
E
OH
OH O E
R
OH +
O R'
E
O
C2H3
N
+
(C2H3)2 + OOC
-EO源自C2H3N-OOC +
(C2H3)2
特点；操作简单，处理条件温和，高级结构不被破坏，
能得到酶活力收率较高的固定化酶；缺点和吸附法相
似，受电解质浓度影响极大。
已有工业化成功实例 DEAE纤维素及DEAE葡聚糖固定化氨基酸酰化酶用于拆
分DL外消旋氨基酸。
Cl N OH + Cl N X HN N O N X N E N O N X N N H2N-E Cl
③溴化氰反应

在碱性条件下（pH10—11.5），溴化氰活化多糖 的羟基成环化的亚氨基碳酸盐，然后与酶蛋白中
的氨基形成共价键，使酶固定。

该类反应通常产生三种不同的结构，即在N位与酶
连接的氨基甲酸酯；在N位与酶连接的亚氨基碳酸
思路下发展起来的。

自上世纪60年代初就有人研究过固定化酶，最初
是以色列人以木炭、骨髓等吸附酶，

然后是日本的千佃一郎领导的制药公司，首先将 氨基酰化酶固定于葡聚糖凝胶中，用于拆分DL-氨 基酸；

接着召开了两次固定化酶的国际酶工程年会。
R
CH NH
COOH CO R‘
+ H2O
R 氨基酸酰化酶
O C OH
S 1 H2 N O CH 6 7 C CH 5 N 4
H 2 C(CH3)2 3 CH 6-氨基青霉烷酸 COOH
葡萄糖异构酶生产高果糖浆
H OH H HO HO H H OH H OH
O
固定化葡萄糖异构酶
H OH HO HO HO H H OH O H
H
上世纪70年代出现固定化细胞技术。利用固定化大 肠杆菌生产L-天冬氨酸
天然高分子载体有淀粉、多糖、谷蛋白等； 人工合成载体有大孔径吸附树脂、人工陶瓷、疏水载
体等。
•吸附法利用载体表面分子内聚力不均匀的特 点吸附酶，该法不破坏酶的活性中心和高级 结构。因此，固定的酶活力回收高； •载体与酶的结合力是物理吸附，结合力弱， 酶易脱落，半衰期短。
•⑵离子结合法
•通过形成离子键固定化酶 •载体有多糖类离子交换剂（DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖、 CM纤维素）；合成高分子离子交换树脂，例如Amberlite IRA-系列。
⑶共价结合法