药残检测原理ppt课件
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此处的衍生试剂还没有确定是否和GB中的衍生化试剂类似？
9ຫໍສະໝຸດ Baidu5/2019
12
硝基呋喃-间接竞争ELISA法
孵育
加底物 + Substance
显色
+ Substance
+ Substance
9/5/2019抗原
抗体
二抗
酶标二抗
13
酶联免疫检测病毒抗体的方法类型
实例4. 伪狂犬病病毒(PRV)直接竞争ELISA法
9/5/2019
16
PRRS/US疫苗的间接ELISA法 孵育(1)
阴性
孵育(2)
加底物
显色
阳性
加底物
加底物
9/5/2019抗原
抗体
二抗
酶标二抗
17
第二部分：液质质联用技术在药残 检测中的应用
9/5/2019
18
液质质联用技术
药物在体内经过肝肾等器官的代谢被转化后，经尿液和 粪便排出体外，只有极少部分残留在肌肉组织，在肝脏和肾 脏中的浓度较高，但总体浓度均在ppb级(μg/kg=ng/mL)。痕 量检测最常用的方式是酶联免疫试剂盒和液相-质谱/质谱联 用技术。
在酶标板微孔条上预包被PRRS/US的抗原，阳性对照或样本中的抗 体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗猪 的二抗，第二次孵育时酶标二抗和抗原抗体复合物结合。再次清洗微孔后 加入底物TMB显色，样本吸光值与抗体浓度正相关。即免疫成功，产生 了抗体，显色的OD450值大于阴性对照。
优点：①灵敏度高(ppb) ②操作步骤易掌握；
不足：①有些试剂盒价格昂贵 ②易出现假阳性，导致实验反复
9/5/2019
6
酶联免疫检测兽药残留的方法类型
三种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作 用的底物。
实例1. 瘦肉精，磺胺类药残-间接竞争ELISA法(北京勤邦)
在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，标品或样本中残留的 克伦特罗和预包被抗原竞争抗克伦特罗的抗体，加入酶标二抗 后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物克伦特罗负相关， 根据标准曲线，得出克伦特罗残留量。
抗典型性猪流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的检测均采用直接竞争 ELISA法。
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(PRV)疫苗直接竞争ELISA法
孵育(1)
孵育(2)
显色
阴性
加底物
阳性
加底物
加底物
9/5/20抗19 原
抗体
酶标抗体
15
酶联免疫检测病毒抗体的方法类型
实例5. 猪繁殖与呼吸道综合症(蓝耳病，PRRS/US)的间接ELISA法
10
氯霉素-直接竞争ELISA法
孵育
加底物
显色
+ Substance
+ Substance
+ Substance
9/5/2019抗体
氯霉素
酶标-氯霉素
11
酶联免疫检测兽药残留的方法类型
实例3. 硝基呋喃-间接竞争ELISA法(无锡同昕)
ELISA原理类似于瘦肉精的检测，不同之处是硝基呋喃需要衍生。 硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，代谢物在组织中则能存留 较长的一段时间，所以我们检测的实为硝基呋喃的代谢物。由于代谢物 均为较小分子，属于半抗原，因此制备其抗体时，需要进行衍生后，免 疫动物获得抗体(也有可能是单克隆抗体)。
5
酶联免疫检测的原理
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体 既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体 按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固 相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体 上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
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3
兽药残留检测方法
酶联免疫法：各种试剂盒 液质质联用仪：LC-MS/MS，三重四级杆质谱仪、杂合三
重四级杆(QTRAP) 试纸条： 微流控芯片： 微生物抑制法： 高效液相色谱
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4
第一部分 酶联免疫技术在药残检测和 病毒抗体检测中的应用
9/5/2019
在酶标板微孔条上预包被PRV的抗原PRV gB，阳性对照或样本中的抗 体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗 PRV gB的单克隆抗体，第二次孵育时酶标单抗和样本中的抗体竞争吸附微 孔条中的抗原。再次清洗微孔后加入底物TMB显色，加入酶标二抗后，用 TMB底物显色，样本吸光值与抗体浓度负相关。即免疫成功，产生了抗体， 显色的OD630值小于阴性对照。
实例2. 氯霉素-直接竞争ELISA法(杭州迪恩)
标品或样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶 标板微孔中固相化的抗氯霉素抗体，通过清洗洗掉未结合的酶 标记氯霉素，通过添加底物显色。样品的吸光值与浓度成负相 关，根据标准曲线，得出氯霉素的残留量。
磺胺七合一直接竞争ELISA法(天津九鼎)
9/5/2019
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瘦肉精-间接竞争ELISA法
孵育
加底物 + Substance
显色
+ Substance
+ Substance
9/5/2019抗原
抗体
二抗
酶标二抗
TMB 底物
8
ELISA显色机理
3,3’，5,5’-四甲基联苯胺(TMB)
TMB 氧化产物
加硫酸终止液后
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9
酶联免疫检测兽药残留的方法类型
奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物。如氯霉素，
克伦特罗，硝基呋喃等。
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2
真菌毒素
黄曲霉素：B1、M1、B2、M2、G1、G2 桔霉素： 展青霉素： 玉米赤霉类：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮
其它
孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫 糖皮质激素：泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可 的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松 雌激素类：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚
药物残留检测的基本原理
王玉峰 2013.04
9/5/2019
1
药物残留 主要包括农药残留和兽药残留、真菌毒素。
农药残留 在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残
存于谷物、蔬菜、果品 、畜产品、水产品以及土壤和 水体中的现象。如滴滴涕，毒死蜱，马拉硫磷等。
兽药残留
是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、
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硝基呋喃-间接竞争ELISA法
孵育
加底物 + Substance
显色
+ Substance
+ Substance
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抗体
二抗
酶标二抗
13
酶联免疫检测病毒抗体的方法类型
实例4. 伪狂犬病病毒(PRV)直接竞争ELISA法
9/5/2019
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PRRS/US疫苗的间接ELISA法 孵育(1)
阴性
孵育(2)
加底物
显色
阳性
加底物
加底物
9/5/2019抗原
抗体
二抗
酶标二抗
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第二部分：液质质联用技术在药残 检测中的应用
9/5/2019
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液质质联用技术
药物在体内经过肝肾等器官的代谢被转化后，经尿液和 粪便排出体外，只有极少部分残留在肌肉组织，在肝脏和肾 脏中的浓度较高，但总体浓度均在ppb级(μg/kg=ng/mL)。痕 量检测最常用的方式是酶联免疫试剂盒和液相-质谱/质谱联 用技术。
在酶标板微孔条上预包被PRRS/US的抗原，阳性对照或样本中的抗 体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗猪 的二抗，第二次孵育时酶标二抗和抗原抗体复合物结合。再次清洗微孔后 加入底物TMB显色，样本吸光值与抗体浓度正相关。即免疫成功，产生 了抗体，显色的OD450值大于阴性对照。
优点：①灵敏度高(ppb) ②操作步骤易掌握；
不足：①有些试剂盒价格昂贵 ②易出现假阳性，导致实验反复
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酶联免疫检测兽药残留的方法类型
三种必要的试剂： ①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作 用的底物。
实例1. 瘦肉精，磺胺类药残-间接竞争ELISA法(北京勤邦)
在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，标品或样本中残留的 克伦特罗和预包被抗原竞争抗克伦特罗的抗体，加入酶标二抗 后，用TMB底物显色，样本吸光值与残留物克伦特罗负相关， 根据标准曲线，得出克伦特罗残留量。
抗典型性猪流感病毒血清，抗口蹄疫病毒血清的检测均采用直接竞争 ELISA法。
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(PRV)疫苗直接竞争ELISA法
孵育(1)
孵育(2)
显色
阴性
加底物
阳性
加底物
加底物
9/5/20抗19 原
抗体
酶标抗体
15
酶联免疫检测病毒抗体的方法类型
实例5. 猪繁殖与呼吸道综合症(蓝耳病，PRRS/US)的间接ELISA法
10
氯霉素-直接竞争ELISA法
孵育
加底物
显色
+ Substance
+ Substance
+ Substance
9/5/2019抗体
氯霉素
酶标-氯霉素
11
酶联免疫检测兽药残留的方法类型
实例3. 硝基呋喃-间接竞争ELISA法(无锡同昕)
ELISA原理类似于瘦肉精的检测，不同之处是硝基呋喃需要衍生。 硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，代谢物在组织中则能存留 较长的一段时间，所以我们检测的实为硝基呋喃的代谢物。由于代谢物 均为较小分子，属于半抗原，因此制备其抗体时，需要进行衍生后，免 疫动物获得抗体(也有可能是单克隆抗体)。
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酶联免疫检测的原理
①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体 既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体 按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固 相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体 上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本 中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅定性或定量分析。
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兽药残留检测方法
酶联免疫法：各种试剂盒 液质质联用仪：LC-MS/MS，三重四级杆质谱仪、杂合三
重四级杆(QTRAP) 试纸条： 微流控芯片： 微生物抑制法： 高效液相色谱
9/5/2019
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第一部分 酶联免疫技术在药残检测和 病毒抗体检测中的应用
9/5/2019
在酶标板微孔条上预包被PRV的抗原PRV gB，阳性对照或样本中的抗 体在第一次孵育时和包被抗原特异性结合；清洗微孔后加入酶标记的抗 PRV gB的单克隆抗体，第二次孵育时酶标单抗和样本中的抗体竞争吸附微 孔条中的抗原。再次清洗微孔后加入底物TMB显色，加入酶标二抗后，用 TMB底物显色，样本吸光值与抗体浓度负相关。即免疫成功，产生了抗体， 显色的OD630值小于阴性对照。
实例2. 氯霉素-直接竞争ELISA法(杭州迪恩)
标品或样品中的游离氯霉素与酶标记的氯霉素竞争结合酶 标板微孔中固相化的抗氯霉素抗体，通过清洗洗掉未结合的酶 标记氯霉素，通过添加底物显色。样品的吸光值与浓度成负相 关，根据标准曲线，得出氯霉素的残留量。
磺胺七合一直接竞争ELISA法(天津九鼎)
9/5/2019
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瘦肉精-间接竞争ELISA法
孵育
加底物 + Substance
显色
+ Substance
+ Substance
9/5/2019抗原
抗体
二抗
酶标二抗
TMB 底物
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ELISA显色机理
3,3’，5,5’-四甲基联苯胺(TMB)
TMB 氧化产物
加硫酸终止液后
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酶联免疫检测兽药残留的方法类型
奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物。如氯霉素，
克伦特罗，硝基呋喃等。
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真菌毒素
黄曲霉素：B1、M1、B2、M2、G1、G2 桔霉素： 展青霉素： 玉米赤霉类：玉米赤霉烯酮、玉米赤霉醇、β-玉米赤霉醇、玉米赤霉烷酮
其它
孔雀石绿、隐性孔雀石绿、结晶紫、隐性结晶紫 糖皮质激素：泼尼松龙、甲基泼尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可 的松、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松 雌激素类：己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚
药物残留检测的基本原理
王玉峰 2013.04
9/5/2019
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药物残留 主要包括农药残留和兽药残留、真菌毒素。
农药残留 在农业生产中施用农药后一部分农药直接或间接残
存于谷物、蔬菜、果品 、畜产品、水产品以及土壤和 水体中的现象。如滴滴涕，毒死蜱，马拉硫磷等。
兽药残留
是指用药后蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、