2014 免疫细胞化学
免疫细胞化学染色在乳腺癌诊断中的应用价值及质量控制
免疫细胞化学染色在乳腺癌诊断中的应用价值及质量控制贺才标;吴涛;朱娅萍;叶红;胡志勇;王林;陈勇;魏贝【期刊名称】《国际检验医学杂志》【年(卷),期】2014(000)014【摘要】目的：探讨乳腺癌患者癌细胞 ER、PR、C-erbB-2、P53、Ki67表达的应用价值及质量控制。
方法采用细针吸取细胞学涂片或术中细胞学印片获取标本，联合免疫细胞化学染色，研究53例乳腺癌患者癌细胞ER、PR、C-erbB-2、P53、Ki67的生物学表达，并与免疫组织化学染色进行对照分析。
结果53例乳腺癌患者ER、PR、C-erbB-2、P53、Ki67的生物学表达分别为73．58％、58．49％、56．60％、68．63％、81．13％，ER、PR、C-erbB-2、P53、Ki67阳性病例和阳性强度，免疫细胞化学染色与免疫组织化学染色之间差异均无统计学意义（P ＞0．05）。
结论免疫细胞化学染色可替代免疫组织化学染色，在乳腺癌的术前诊断、治疗方案的选择、以及预后的判断具有重要的意义。
全过程的质量控制是做好乳腺癌免疫细胞化学染色的关键。
【总页数】3页(P1923-1924,1927)【作者】贺才标;吴涛;朱娅萍;叶红;胡志勇;王林;陈勇;魏贝【作者单位】湖北省天门市妇幼保健院检验科，湖北天门 431700;湖北省天门市中医院放射科，湖北天门 431700;湖北省天门市妇幼保健院检验科，湖北天门431700;湖北省天门市第一人民医院病理科，湖北天门 431700;湖北省天门市第一人民医院病理科，湖北天门 431700;湖北省天门市第一人民医院病理科，湖北天门 431700;湖北省天门市第一人民医院病理科，湖北天门 431700;湖北省天门市第一人民医院病理科，湖北天门 431700【正文语种】中文【相关文献】1.细胞块石蜡包埋及免疫细胞化学染色技术在胸腹水细胞病理学诊断中的应用价值[J], 黄金长;张功亮;郭广秀;王建;彭芳;陈青2.p16和Ki-67免疫细胞化学染色在宫颈ASCUS中的应用价值 [J], 张建兰;王夷黎;禤坚艳;柳晓春;彭敏;周东华3.免疫检验分析质量控制在临床免疫检验中的应用价值 [J], 吴红兵;曾保证;田长江4.免疫检验分析质量控制在临床免疫检验中的作用及应用价值 [J], 胡迎超5.免疫检验分析质量控制在免疫检验中的应用价值 [J], 张晓佳;刘娟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
免疫细胞化学(coverslip)
免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。
）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。
）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。
）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。
）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。
（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。
）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。
）8.用TBST洗2次，5min/次。
（如抗体的非特异多也可多洗。
）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。
10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。
（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。
细胞(组织)化学和免疫化学染色技术
细胞（组织）化学和免疫化学染色技术细胞化学（cytochemistry）或组织化学（histochemistry），是细胞学（cytology）或组织学与生物化学（biochemistry）相结合的一门科学。
细胞化学染色（cytochemical staining）是在血细胞的原位上研究其化学成分的性质，包括蛋白、脂类、糖类、无机盐和酶等，在保持细胞形态的基础上进行化学的定位、定性及半定量的观察，是血液病形态学诊断中的一个重要手段。
细胞免疫化学（immunocytochemistry）又称免疫细胞化学或免疫组织化学（immunohistochemistry）染色，是鉴定某些细胞或组织的病态细胞（如微小巨核细胞）和白血病的重要的辅助性检验技术。
一、涂片细胞化学和免疫化学染色技术（一）细胞化学染色1.铁染色正常骨髓中存在一定量的贮存铁，以含铁血黄素的形式贮存，多分布在巨噬细胞内，称为贮存铁。
骨髓中幼红和晚幼红细胞含有铁颗粒，为细胞内铁，含内铁的细胞称为“铁粒幼细胞”，少数成熟红细胞也含有小的铁颗粒，称为“铁粒红细胞”。
以上铁质均可用普鲁士蓝反应加以显示。
（1）原理：骨髓内含铁血黄素的铁离子和幼红细胞内的铁颗粒，在盐酸环境下与亚铁氰化钾作用，生成蓝色的亚铁氰化铁沉淀（普鲁士蓝反应），定位于含铁粒的部位。
（2）试剂：铁染色液（临用时配制）：200g/L亚铁氰化钾溶液5份加浓盐酸1份混合；复染液：1g/L沙黄溶液。
（3）操作：取新鲜含骨髓小粒的骨髓涂片，于铁染色架上，滴满铁染色液；室温下染色30分钟，流水冲洗，复染液复染30秒；流水冲洗，晾干后镜检。
（4）结果判定1）细胞外铁：细胞外铁呈蓝色的颗粒状、小珠状或团块状，细胞外铁主要存在巨噬细胞胞质内，有时也见于巨噬细胞外。
“-”为涂片骨髓小粒全无蓝色反应；“+”为骨髓小粒呈浅蓝色反应或偶见少许蓝染的铁小珠；“++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的片状或弥散性阳性物；“+++”为骨髓小粒有许多蓝染的铁粒、小珠和蓝色的密集小块或成片状；“++++”为骨髓小粒铁粒极多，密集成片。
免疫电镜技术(immunoelectron microscopy,IEM)又称为免
免疫电镜技术（immunoelectron microscopy，IEM）又称为免疫细胞化学技术，是在免疫组织化学技术（immunohistochemistry）的基础上发展起来的，它是利用抗原与抗体特异性结合的原理，在超微结构水平上定位、定性及半定量抗原的技术方法。
该方法为精确定位各种抗原的存在部位、研究细胞结构与功能的关系及其在病理情况下所发生的变化提供了有效的手段。
免疫电镜技术主要经历了铁蛋白标记技术、酶标记技术以及胶体金标记技术三个主要发展阶段。
铁蛋白标记技术适用于细胞膜表面抗原的定位，由于其分子量较大，不易穿透细胞膜，定位细胞内抗原较为困难。
铁蛋白对电镜包埋剂的非特异性吸附很强，不适用于包埋后免疫标记，使其应用受到一定限制。
酶标记免疫电镜技术是将酶（主要是过氧化物酶）与抗体相交联，抗原抗体反应后，加底物显示酶的活性部位，酶反应产物经OsO4处理变为具有一定电子密度的锇黑，可在电镜下观察。
过氧化物酶的相对分子量较小，与其交联的抗体较易穿透经处理的细胞膜，可用于细胞内抗原的定位。
但是酶反应产物比较弥散，因此分辨率不如颗粒性标记物高。
胶体金标记免疫电镜技术是目前应用最广的免疫电镜标记物，该技术是将胶体金作为抗体的标记物，用于细胞表面和细胞内多种抗原的精确定位。
胶体金主要具有以下几个优点：（1）胶体金能稳定并迅速地吸附蛋白，而且蛋白的生物活性不发生明显改变，可制备抗体-胶体金、蛋白A-胶体金、卵白素-胶体金、植物凝集素-胶体金等用于免疫电镜；（2）在电镜下金颗粒电子密度高、圆形且界线清晰，易于辨认，定位比酶反应物更精确；（3）胶体金标记物易于制备，并可以根据需要制备大小不同（1～150nm）的胶体金，因此可进行免疫电镜的双重或多重标记；（4）金颗粒能发射强烈的二次电子，是扫描电镜的理想标记物；（5）胶体金经过银显影增强后，金颗粒外周吸附大量银颗粒而呈现黑色或黑褐色，因此也能用于光学显微镜观察。
【江苏省自然科学基金】_免疫细胞化学_期刊发文热词逐年推荐_20140819
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免疫细胞化学
免疫细胞化学
免疫细胞化学是一种研究免疫系统的细胞和分子机制的方法。
它是运用流式细胞术和免疫组化技术来检测各种免疫反应的分子结构的变化、表达和功能的研究。
免疫细胞化学可以检测细胞内免疫相关蛋白的表达、检测抗原及抗体在细胞内的定位及对其他细胞特异表达，以及研究各类药物和抗原的免疫作用机制。
该技术可以用于探索免疫应答的分子命运以及效应分子信号的调控，在治疗免疫疾病中有重要的指导意义。
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗原和抗体的要求·具有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–对抗体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获得，取决于抗原的纯度。
–对抗原的要求：纯度高，免疫原性强，稳定无变化。
抗原(antigen, Ag)·抗原的概念：凡是在机体内引起体液免疫和(或)细胞免疫反应的物质，称为抗原。
抗原具有两个方面的特性：–免疫原性：引起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特性；–免疫反应性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的结合或反应的特性。
·根据抗原是否显示免疫原性分为：–完全抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并具有较复杂的化学组成。
·免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必需和蛋白质及多糖形成复合物才具有良好的免疫原性。
–半抗原：又称为不完全抗原，分子量较小。
例如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
·半抗原必需与载体结合，才能获得免疫原性。
载体·通常是具有高度免疫原性的大分子物质，具有将免疫原性传递给耦联的半抗原能力。
–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
免疫组化原理、步骤及要注意的事项.
免疫组化一，免疫组织化学简介免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
二，免疫组化技术的基本原理免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。
在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。
免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。
直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。
目前通常选用免疫酶组化间接染色法。
三，免疫组化步骤1，切片，烤片60℃，1h；2，脱蜡及复水二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；4，微波修复将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；8，PBS洗涤3次，每次3min；9，滴加二抗，37℃，15-30min；10，PBS洗涤3次，每次3min；11，滴加SABC，37℃， 30min；12，PBS洗涤3次，每次5min；13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；16，苏木素复染2min，自来水冲洗；17，脱水30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；18，树胶封片，镜检。
免疫细胞化学步骤
细胞爬片1、PBS清洗标本3次各1 min。
2、冰丙酮固定15 min。
3 、空气干燥5min。
4 、PBS清洗标本3次各2 min。
5 、0.5%Triton X-100( DPBS配) 孵育1次20 min。
6 、PBS清洗标本3次各2 min。
7 、3%H2O2孵育15 min。
8、PBS清洗标本3次各2 min。
9 、滴加一抗，室温或37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液10、PBS清洗标本3次各2 min。
11、滴加试剂1，室温或37℃孵育10~20 min。
12 、PBS清洗标本3次各2 min。
13 、滴加试剂2，室温或37℃孵育10~20 min。
14 、PBS清洗标本3次各2 min。
15、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。
16、蒸馏水洗2次1 min。
17、苏木素复染0.5~1min。
18、自来水洗30min。
19、树胶封片。
2、冰丙酮固定后玻片可密闭保存于4℃冰箱，冰丙酮固定时会使细胞收缩，可用80%冰丙酮或2%多聚甲醛固定。
3、冲洗时只须轻轻振荡培养皿，（不可用吸管太用力吹，易脱片）4、加一抗、二抗后冲洗时第一次须将玻片倾斜5、Triton X-100（屈立通）表面活性剂，脱去细胞膜中最主要的成分脂质，对于抗原表达在胞浆或胞核者方使用，对于抗原表达在胞浆者时间要控制好，使其破坏细胞膜而核膜破坏较少。
这是试剂盒和网上的综合。
固定的目的是保持细胞形态尽量与生活时相似，防止细胞内的酶将蛋白质分解而自溶，沉淀或凝固细胞内物质，保持其与组织生活时相仿的成分，使细胞各部分易于着色。
一般涂片如宫颈涂片、痰涂片，涂好后应立即固定。
但如液体很稀薄，含蛋白质很少的尿液、胸腹水等，涂片后潮干固定，以免细胞漂落太多，影响制片质量。
(一)固定方法1．浸入法涂片直接浸入固定液内，因固定液充足，固定效果较好。
但细胞易脱落而发生交叉污染，因此应该分瓶固定，固定液回收时应过滤。
免疫组织化学
内室温孵育15～25min，然后吸去孵育液，
不冲洗。（封闭）
5）滴加PBS适当稀释的第一抗体，湿
盒内孵育，或4℃过夜，或室温2～4h。 6）PBS充分冲洗，3次，2min
7）滴加适当稀释的酶标第二抗体， 湿盒内孵育45～60min（室温或37℃）。
8）PBS漂洗，3次，2min。漂洗后，
冰冻切片可用福尔马林固定，固定后再
0.1mol／L Tris－HCl缓冲液（pH8.3）,
用前加入坚牢红TR盐（1mg／ml）。切片
入此液，室温10～15min。取出后用Tris －HCl缓冲液洗净。
10）将切片置流水中终止呈色反应。
11）按需要可进行甲绿或苏木精复染
细胞核。
12）DAB显色标本可经脱水、透明、
树胶封固。其它显色反应用水溶性介质
为抗原制得，其分子量为 HRP的 2～3
倍，比较稳定，内源性 ALP较易清除，
常用于免疫组织化学染色。
2．胶体金标记
其标记就是蛋白质吸附并结合在金颗 粒表面的过程，是由于金颗粒表面带负电 荷和蛋白质表面所带正电荷有静电吸引， 这种吸附取决于pH值，pH值也与胶体金的
聚合状态有关。胶体金标记蛋白（抗体）
所谓抗体标记技术，即利用荧光素或酶或 重金属颗粒使之结合于抗体分子上。
利用双价或多价结合力的物质，如植 物血凝素、生物素－亲和素等，一方面与 标记物（如荧光素、酶等）结合，另一方 面又可与细胞组织内某种物质（如抗体） 结合，这种利用一种物质对组织内某一成 分亲和能力发展起来的技术，即称亲和免 疫组织化学（affinity immunohistochemistry）。
一、抗体的保存
①冷冻干燥；
②添加防腐剂或保护剂；
细胞毒理学(2014)
研究内容
细胞毒性作用 细胞形态学观察 细胞恶性转化 细胞生物学（生长、死亡、衰老、分化） 作用机制（信号转导、细胞损伤、修复）
18
体外细胞实验的优点
细胞来源充足 条件容易控制 结果重复性好 操作简便 试验周期相对较短
19
细胞水平研究局限性
脱离了整体复杂的环境条件，其 生存环境和细胞之间的相互关系 都发生了改变，细胞生物学特性 也发生相应变化；
1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。
细胞毒性的检测方法
化学物质对细胞的毒性作用，可以表现为 细胞一系列的形态、功能以及代谢上的变 化，在损伤严重的情况下，会导致细胞的 死亡。
细胞凋亡(apoptosis)和细胞坏死 (necrosis)是两种主要的细胞死亡方式， 它们的性质和生物学意义有本质上的不同。
14
细胞功能
分子运输 DNA复制 增殖 蛋白质合成 细胞代谢 细胞信号传导
15
细胞生物学研究技术
• 显微镜观察 • 细胞培养 • 分子生物学 • 免疫组织化学 • 生物化学
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细胞毒理学
定义：应用细胞生物学技术研究外 来有害因素作用所导致的细胞结构 上和功能上的损伤效应以及毒作用 机制的一门毒理学分支学科。
有核膜和核仁 有 复杂 微管和微丝 有丝分裂 不同时间和地点
动 物 细 胞 模 式 图
细胞膜（Cell Membranes） 细胞质（Cytoplasm） 细胞核（Nucleus）
细胞膜结构及功能
• 保护细胞 — 结构、形状 • 物质交换 — 转运物质 • 信息传递 — 如神经信号传导 • 能量交换 — 如化学能
29
免疫细胞化学方法
免疫细胞化学方法
免疫细胞化学方法是将免疫学基本原理与细胞化学技
术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。
具体方法如下：
1. 直接法：用标记抗体与抗体中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原。
2. 间接法：先用未标记的具有特异性的第一抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗体，然后再结合以标记物。
通过这样的放大作用，使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为广泛。
免疫细胞化学步骤及说明
1. 细胞爬片制备盖玻片在75%酒精浸泡24h以上，超净台内酒精灯上烤干。
六孔板内分别滴入一滴培养液，盖上盖玻片。
分别加入等量细胞，常规培养至细胞70%左右融合。
关于盖玻片的准备，有很多种说法，但我的做法比较简单，这样做不会脱片，也不影响观察。
2. 细胞固定6孔板置冰上冷却，吸尽培养液。
4℃PBS，洗5min×3次。
吸去残留PBS，空气干燥，细胞面微潮湿时，加入预冷95%酒精固定液，浸没细胞面，更换预冷95%酒精2次，第三次在-20℃静置20min。
这一步用4%多聚甲醛可能更省时省事。
3. SP法免疫组化染色步骤(1)细胞爬片蒸馏水洗5min×1次，PBS浸泡5min。
固定之后的细胞一般不会脱落，可以放在摇床上洗。
(2)滴加3%H2O2去离子水，室温孵育30min。
PBS洗5min×3次。
(3)滴加0.3%Triton X-100（全液用蒸馏水稀释）通透30min。
PBS洗5min×3次。
细胞通透很重要，因为蛋白在胞内，我第一次做时没有通透，结果什么都没有。
(4)BSA封闭，室温10min。
倾去，勿洗。
(5)滴加一抗(a-actin l:300)，4℃过夜。
PBS洗5min×3次。
抗体的浓度是自己摸索出来的，还有听说4℃过夜是比较合适的做法。
(6)滴加二抗(聚合HRP标记抗小鼠IgG)，室温30min。
PBS洗5min×3次。
(7)按1mL蒸馏水+A、B、C（DAB试剂盒，要按顺序滴加）各一滴，混匀，镜下显色观察，注意避光。
蒸馏水充分冲洗。
(8)苏木素染2min。
自来水充分冲洗。
(9)依次在75%→85%→95%→100%浓度酒精中浸泡2min脱水。
封片之前常规有二甲苯透明的，但我滴加了二甲苯之后，片子变得很脏，不知什么原因。
后来就不加了，直接脱水后封片，现在看来片子还不错啊。
而且二甲苯太呛人了。
(10)中性树胶封片。
免疫细胞化学技术
免疫细胞化学技术免疫细胞化学，与免疫组织化学（Immunohistochemistry）相同，它是组织化学的分支，它是用标志的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的散布进行组织和细胞原位检测技术。
免疫组化，是应用免疫学基根源理——抗原抗体反响，即抗原与抗体特异性联合的原理，经过化学反响使标志抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确立组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。
抗原和抗体的要求·拥有特异性高和亲和力强的抗体是实验成功的首要条件。
–抗衡体的要求：纯度高、比活性强；·高度特异性抗体的获取，取决于抗原的纯度。
–抗衡原的要求：纯度高，免疫原性强，稳固无变化。
抗原(antigen,Ag)·抗原的观点：凡是在机体内惹起体液免疫和(或)细胞免疫反响的物质，称为抗原。
抗原拥有两个方面的特征：–免疫原性：惹起机体产生抗体和(或)致敏淋细胞的特征；–免疫反响性：抗原能与相应的抗体及致敏淋巴细胞发生特异的联合或反响的特征。
·依据抗原能否显示免疫原性分为：–完整抗原：分子量较大，一般在10kDa以上，并拥有较复杂的化学构成。
·免疫原性最强的是蛋白质抗原，多糖次之；脂类和核酸必要和蛋白质及多糖形成复合物才拥有优秀的免疫原性。
–半抗原：又称为不完整抗原，分子量较小。
比如：某些短肽、多糖、类脂和药物等。
·半抗原必要与载体联合，才能获取免疫原性。
载体·往常是拥有高度免疫原性的大分子物质，拥有将免疫原性传达给耦联的半抗原能力。
–常用的载体有钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA) 、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。
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酶
抗原
一抗
二抗
酶标二抗
抗酶抗体
酶—抗酶抗体复合物
酶标记的三种形式：信号的放大
抗酶抗体 复合物 抗酶抗体 二抗 一抗 二抗 一抗 一抗 二抗
酶标抗体法
抗酶抗体法
复合物法
常用的标记酶：
1.辣根过氧化物酶
2.碱性磷酸酶
外源的酶，与细胞内的内源酶应该有明显区别.
显示辣根过氧化物酶（HRP)
底物为DAB(二氨基联苯胺)，经一系列氧化聚合反应后形成聚合物， 在光镜下呈棕黄色; DAB经锇酸固定后能生成具有锇黑,电镜下呈现高电子密度.
免疫细胞化学反应原理
组织抗原
＋
标记的抗原抗体复合物 标记抗体
免疫反应
显色反应
两种方法： 直接法和间接法
直接法 直接标记第一抗体
间接法 标记第二抗体或复合物
直接法与间接法
直接法 组织抗原直接与标记的特异抗体（一抗）反应 间接法 组织抗原与未标记的特异抗体（一抗）反应 一抗再作为抗原与标记的第二抗体反应 ★不必对一抗作标记 ★ 标记物多 ★ 避免标记造成对抗体与抗原结合的影响
AP
BCIP
NBT
蓝紫色色素
１.辣根过氧化物酶 （hoseradish peroxidase, HRP）
（1）过氧化物酶标记抗体法
（2）过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物法 （Peroxidase-Antiperoxidase,PAP） +组织抗原 *二抗 +第一抗体 +PAP复合物
*一抗 PAP
“桥梁” 一抗
蛋白1
DAPI
EGFP/shR三） 免疫胶体金技术
以电镜下都可见 的胶体金作为抗体或 蛋白Ａ的标记物，间 接显示组织细胞中特 异分子的技术。
金标抗体或金标A蛋白（二抗）
一抗+抗原
胶体金颗粒大小一般在5--60nm
通常在电镜下观察
免疫胶体金技术优点：
1、亚细胞定位（超微结构定位） 2、采用不同大小的金颗粒(通常 5-20nm)，标记不同抗体或A蛋白， 达到双重甚至多重标记，定位多 种抗原的目的
X蛋白定位于核仁
（四） 亲和细胞化学技术
亲和物质 具有多价能力的物质，与另一种亲和 物质有高度亲和力，又能与抗体、蛋白质及各 种标记物(荧光素、酶、胶体金等)结合 最常用的亲和物质系统： 1、生物素（biotin）- 亲和素（avidin） 结合能力强，结合不可逆 2、葡萄球菌A蛋白-免疫球蛋白IgG 通常在光镜下观察
（应用荧光染料时都需要知道2个波长： excitation wave length, emission wave length)
荧光素
如:１.异硫氰酸荧光素( FITC)
ex:490nm, es:520-530 绿色
２.四乙基罗达明
ex:570nm, es:595nm 明亮的橙色
３.四甲基异硫氰酸罗达明
生物素
亲和素
生物素化酶
生物素化抗体
亲和素—生物素 —酶复合物
标记链球菌亲和素-生物素 技术 Labeled streptoavidin biotin （LSAB)
③→
癌旁组织
②→
肝癌组织
①→
Hsp90在肝细胞中的表达(LSAB法)
亲和素－生物素 - 酶复合物技术（ABC） 亲和素-生物素-HRP
1.保持细胞、组织的固有形态和结构； 2.防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质； 3.细胞内蛋白质凝固; 4.保持组织或细胞化学成分的某些属性,如抗原性或核酸杂交 活性。 方法：固定剂
Ⅰ类：醛类，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。 Ⅱ类：氧化剂类，四氧化锇（奥酸），高锰酸钾，重铬酸钾等。 Ⅲ类：蛋白变性类，甲醇，乙醇，醋酸等。 Ⅳ类：其他，氯化汞，苦味酸等。
SPA能与人及多种哺乳动物血清中IgG呈
◆
非特异性结合又能与标记物结合
经标记的SPA可代替相应标记的二抗
总结： 1. 免疫荧光技术
标记物 使抗体或抗原 抗体复合物在 各种显微镜下 可见的物质
细胞化学技术
在保持细胞结构完整的条件下，借助细胞 中的化学反应在原位确定化学成分的分布及这
些成分的分布在细胞活动中的动态变化的技术，
用以阐明细胞化学成分、结构和功能的关系。
包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放
射自显影技术和原位杂交等。
特点1.原位：怎样做到组织/细胞的原位？
固定（Fixation)
细胞化学技术
细胞化学技术 cytochemistry 组 织 化 cytochemistry 学技术–组化技术 histochemistry
第二部分
什么是细胞化学？ 检测和分析细胞的化学组成？
细胞打碎，化学成分释放。 不是细胞化学技术
什么是细胞化学？
在原位检测和分析细胞的化学组成,保持原有结构和位置
2类抗体
多克隆抗体— 抗血清，是用提纯的抗原免疫动物后从动 物血清制备得到的。 特点：可自行制备；灵敏度高；特异性？ 单克隆抗体— 由单个产生特异抗体的Ｂ淋巴细胞扩增 的细胞克隆产生的抗体。 特点：特异性高 兼顾灵敏度，特异性
三、免疫反应的特异性
免疫反应的特异性表现在：
抗原作为一类结构复杂的大分子能刺激机体
该技术可用来检测几乎所有大分子的定位。
2.也可用在其他细胞化学技术的显示反应中。
第一节 免疫细胞化学原理
一、抗原 二、抗体
三、免疫反应的特异性
四、免疫细胞化学反应
五、标记物及其在光镜和电镜下可见性
一、抗原
凡能刺激机体产生抗体并能与 抗体特异结合的物质称为抗原。
细胞中具有抗原性的化学成分有： 蛋白质 多肽 脂蛋白 多糖 脂多糖 糖蛋白 核蛋白
免疫荧光技术优点：
1.双重或多重标记，同时比较不同分子的位 置及量的关系。 2.双重或多重标记，同时染色细胞器和感兴 趣分子，可显示分子的亚细胞定位信息。 3.根据荧光素的强度，进行半定量分析
蛋白1
DAPI
shRNA-蛋白B 载体与EGFP融合
merge
（二） 免疫酶技术
是将酶作为标记物使组织细胞中形 成的抗原抗体复合物得到标记，再通过 酶细胞化学反应产生显微镜下可见的显 色物质，间接显示抗原物质的定位. 普通光学显微镜即可观察
既适用于光镜，又适用于电镜。
HRP H2 O2 H2 O nDAB DAB 氧化聚合物 (棕黄色) 锇酸 锇黑（高电子密度）
显示碱性磷酸酶(AP)
a.底物：萘酚衍生物， 捕捉底物：固红或固蓝 产物：红或蓝色偶氮色素 AP 底物 红或蓝偶氮色素 固红或固蓝
b.底物：吲哚酚酯， 捕捉底物：四唑盐， 产物：蓝紫色
２.碱性磷酸酶（Alkaline phosphotase, AKP） 两种方法：
(1)碱性磷酸酶标记抗体 (2)碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物法（APAAP） （Alkaline phosphotase－Antialkaline phosphotase）
免疫酶技术优点：
1.反应后标本材料可长期保存 2.观察定位信息时，可观察感兴趣分子在细 胞整体中的相对定位，颜色对比清晰 3.同时观察阳性信号和阴性信号。 3.能用于电镜观察 4.可用于原位杂交技术的探测。
产生对其特异的抗体并与抗体发生反应
抗体针对某种抗原分子而产生，特异地识
别该抗原并与其结合
四、免疫细胞化学反应
把组织细胞中的特异分子作为抗原,
用在显微镜下可见的标记物标记特异抗体 (或者标记抗原抗体复合物)结合，使免疫化 学反应具有可见性, 间接地显示抗原,达到 在细胞或细胞器水平定位特异分子的目的。
Recombinant protein
RFP-tag Protein1. Protein2. GFP-tag
带标签的重组蛋白 subcellular localization co-localization
GFP-B23
mRFP-H2B
GFP-SENP3
RFP-B23
By Yang Kai, unpublished data
细胞化学技术主要包括：
酶细胞化学技术 免疫细胞化学技术 放射自显影 原位杂交技术等
免疫细胞化学技术 Immunocytochemistry
免疫组织化学（免疫组化) immunohistochemistry 是利用免疫化学反应来定位组 织细胞中特异大分子的一类技术。
应用范围：
1.组织细胞中的特异分子均可作为抗原,因而
同种型抗原性的抗原决定簇， （“抗原性”活性） （如:来源于兔的抗体，可被抗 兔抗体识别和结合）
“一抗、二抗”
识别一抗的种属特异性，并能够因此结 合一抗,称为二抗 (抗种属抗体)。
二抗(secondary antibody)
一抗(primary antibody) 识别特异抗原
抗原(antigen)
4. 免疫胶体金技术
（一） 免疫荧光技术
免疫荧光技术将 荧光素作为标记物 使组织细胞中形成的抗原抗体复合物在荧光显 微镜下可见，从而显示抗原物质的定位
荧光素： 在激发光（荧光显微镜提供）的照射下，能发 出较激发光波长更长的可见光（发射光），在显微 镜下可见，并随照射停止而消失。 荧光显微镜： 荧光显微镜的光源提供各种激发光，使受检标 本内的荧光物质发出发射光.
③ 复合物
②二抗
生物素化 结果判断： 灵敏度：高 特异性：好
①一抗
抑癌基因产物P16 位于垂体腺瘤细胞核
阳性程度有差异
++： % +： -： % %
2. 葡萄球菌A蛋白与IgG系统
葡萄球菌A蛋 (Staphylocal protein A, SPA)
◆
是金黄色葡萄球菌细胞壁含有的一种蛋白 简称为A蛋白或蛋白A