鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的快速PCR检测方法灵敏性的比较

近年来，鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病（ISKN）给鳜鱼养殖业造成了严重损失。

中山大学何建国等证实了鳜鱼的传染性脾肾坏死病病原为传染性脾肾坏死病毒（ISKNV），属于虹彩病毒。

ISKNV感染鳜鱼脾、肾、肝、鳃、心脏和消化道等组织器官，其中，脾和肾是其主要感染器官[1-2]。

一般被ISKNV感染的发病鱼常表现为游泳异常的症状，鳃丝失血发白，肝脏呈黄色或浅白色，有出血点；肾脏肿大充血；脾脏充血，部分伴有出血等现象。

由于水生动物病毒类疾病目前尚无特效治疗药物[3]，因此在生产环节中对病原的早期诊断和及早处理带毒动物体等生产资料对科学养殖指导工作有着重要的意义。

目前，中华人民共和国农业部发布实施了SC/T 7211-2011《传染性脾肾坏死病毒检测方法》行业标准，在生产中也已经广泛应用。

但行业标准中完成DNA提取和PCR检测的方法耗时较长。

该实验室在集成DNA快速提取技术、快速PCR技术基础上，建立了一种简便快速的PCR检测法，能在3h内完成组织DNA提取、PCR扩增、电泳、凝胶成像，得出检测结果，更大程度满足渔业生产需求，尤其适用于县级水产疫病防控实验室。

该方法该试验在鳜鱼传染性脾肾坏死病毒快速检测方面已有初步验证。

为进一步验证该快速检测方法的灵敏性，该实验室开展了快速检测方法的灵敏性比较的实验，现将试验过程及结果总结如下。

1材料与方法1.1仪器DK-8D型水浴锅（上海森信实验仪器有限公司生产）；MIKRO200R型台式高速冷冻离心机（德国Hettich公司生产）；S1000型PCR仪（美国B10-RAD 公司生产）；BG-Power600型电泳仪（北京万向旭通科技有限公司生产）；INFINITY-3026型凝胶成像系统（法国VILBER公司生产）。

1.2试剂Chelex-100%（sigma-aldrich公司生产）；pro-tease K、2KDNA Marker、灭菌双蒸水和2*EasyTay PCR SuperMix（均为北京全式金生物技术有限公司生产）、DNA提取试剂盒（Code No.9765，TaKaRa公司生产）。

1.3检测样品发病塘口采集的濒死发病鳜鱼（具有典型传染性脾肾坏死病症状且经过电镜和PCR双重确认感染ISKNV）3尾，取鱼的肾、脾组织2g加2mL PBS冰浴研磨。

用PBS分别稀释101~109倍。

分别取100μL 不同浓度的稀释液作为待检样品；阳性对照为研磨鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）的快速PCR检测方法灵敏性的比较朱春艳，王家军，薛中仪，刘张淮，张荧荧（宝应县水生动物疫病预防控制中心，江苏宝应225800）摘要：传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）是鳜鱼重大疫病病原，该病毒引发的鳜鱼传染性脾肾坏死病（Infection spleen and kidney necrosis）能导致养殖生产巨大经济损失。

为满足水产疫病预防与诊断需求，该文将一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法与试剂盒提取DNA法和传染性脾肾坏死病毒检测方法（SC/T7211-2011）中PCR方法进行比较，旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法。

关键词：传染性脾肾坏死病毒；鳜鱼；DNA快速提取；PCR快速检测；灵敏性比较中图分类号：S852文献标志码：A文章编号：1004-2091(2019)07-0019-04资助项目：江苏省水产病害测报项目（项目编号）,江苏省挂县强渔富民项目（项目编号）作者简介：朱春艳（1990—），女，助理工程师，在读在职研究生，研究方向：水产养殖与病害防控.E-mail：zhuchunyan_good@ 通信作者：王家军（1975—），男，研究员级高级工程师.E-mail：bywjiajun@水产养殖40卷原液；阴性对照为从未受ISKNV感染的鳜鱼，且电镜和PCR双重检测确认ISKNV阴性的鱼肾脏组织研磨液。

1.4样品DNA提取1.4.1Chelex-100法[6]各取100μL待检样品、阳性对照、阴性阴性对照分别置于1.5mL离心管内，加入200μL5%Chelex-100悬浊液和20μL蛋白酶K，混匀10s，56℃水浴20min，混匀10s，99℃水浴8 min，4℃环境下12000rpm离心4min，上清液即为DNA溶液，需耗时约40min。

1.4.2试剂盒法各取100μL待检样品、阳性对照、阴性阴性对照置于1.5mL离心管内，加入180μL Buffer GL、20μL Proteinase K和10μL RNase A（10mg/mL），于56℃水浴2h至组织完全裂解（难裂解的适当延长裂解时间，裂解之后先12000rpm离心2min，去除杂质之后再进行后续操作）。

向裂解液中加入200μL Buffer GB和200μL100%乙醇，充分吸打混匀。

将Spin Column安置于Collection Tube上，溶液移至Spin Column中，12000rpm离心2min，弃滤液。

将500μL的Buffer WA加入至Spin Column 中12000rpm离心1min，弃滤液。

将700μL的Buffer WB加入至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液。

重复加Buffer WB1次，弃滤液。

将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm 离心2min。

将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入50~200μL Elution Buffer（水浴至65℃），室温静置5min。

12000rpm离心2min洗脱DNA。

洗脱液即为DNA 溶液。

耗时约3h。

1.5PCR反应1.5.1快速PCR法参考文献[4]设计和合成引物：ISKNV-FOR（5’-GCATGTATGCTGTTTAGACA-3’）和ISKNV-REV（5’-AGCATCAAGCAGGCGATCTG-3’），扩增真鲷虹彩病毒（RSBV）核苷酸还原酶小亚单位（RNRS）基因187bp片段。

总反应体系25μL，其中包含：模板DNA1μL，2×EasyTay PCR SuperMix12.5μL，正反引物各1μL，灭菌双蒸水9.5μL。

PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性3s、56℃退火15s、72℃延伸10s，35次循环；72℃延伸10min；4℃保温。

需耗时约1h。

1.5.2标准PCR法[5]参考传染性脾肾坏死病毒检测方法（SC/T7211-2011）合成引物：ISKNV-F2（5’-CGTGAGACCGTGCGTAGT-3’）和ISKNV-R2（5’-AGGGTGACGGTCGATATG-3’），扩增ISKNV主衣壳蛋白（MCP）基因562bp片段。

总反应体系50μL，其中包含：模板DNA2.5μL，2×*EasyTay PCR SuperMix25μL，正反引物各1μL，灭菌双蒸水20.5μL。

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s、61℃退火45s、72℃延伸1min，30次循环；72℃延伸7min；4℃保温。

需耗时约1h40min。

1.6电泳与凝胶成像检测取6μL反应液在1%琼脂糖凝胶上电泳，110V，电泳25min。

取电泳后的凝胶置于凝胶成像系统，根据UV254nm下观察187bp的DNA条带和562的DNA条带的有无判断检测结果。

2结果用Chelex-100法提取模板快速PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释103倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释104倍PCR扩增结果则为阴性（图1）。

用Chelex-100法提取模板标准PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释102倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释103倍PCR扩增结果则为阴性（图2）。

用试剂盒法提取模板快速PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释107倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释108倍PCR扩增结果则为阴性（图3）。

用试剂盒法提取模板标准PCR法扩增结果显示当病毒组织原液稀释105倍PCR扩增结果仍为阳性，模板稀释106倍PCR扩增结果则为阴性（图4）。

3讨论经比较，相同试验条件下快速PCR法与标准PCR法相比不仅减少了扩增时间，且扩增效果较好。

注：0：发病鳜鱼组织研磨液；1~10：组织研磨液的10-1~ 10-10；-：阴性对照；+：阳性对照；M：2000bp DNA Marker。

图1Chelex-100法提DNA，快速PCR法扩增结果20第7期A comparison of sensitivity of rapid PCR detection forinfectious spleen and kidney necrosis virus(ISKNV)for Siniperca ChuatsiZhu Chunyan,Wang Jiajun,Xue Zhongyi,Liu Zhanghuai,Zhang Yingying(Baoying Center For Control And Prevention of Aquatic Animal Infectious Disease in Jiangsu province,Baoying 225800,China)文中灵敏性试验结果显示Chelex-100法的提取效率没有商品试剂盒的提取效率高，可能因为Chelex-100法制得的DNA 粗提液溶解液较多约320μL ；而试剂盒法制得的DNA 粗提液溶解液仅为80μL ，即使DNA 含量相同，在作为模版扩增时吸取相同体积的DNA 提取液，Chelex-100法的DNA 含量较少，故检测灵敏性相较于试剂盒法较低。

如何提高Chelex-100法DNA 提取效率，有待进一步探索。

Chelex-100法虽然目标DNA 提取效率没有商品试剂盒法高，但是该法具有简单快速、清洁无毒、检材用量少等特点[6-8]，在实际运用中也存在一定的优势。

在发病塘口（当病毒含量达到一定含量）快速诊断时Chelex-100法更加快速便捷且检出效果较好。

但在鳜鱼苗种快速检疫中，建议使用试剂盒法提取DNA 结合快速PCR 法检测，以防漏检。

参考文献：[1]何建国，翁少萍，黄志坚，等.鳜量暴发性传染病病毒病原研究[J].中山大学学报（自然科学报），1998（1）：25-31.[2]曾慷.鳜鱼传染性脾肾坏死病毒病的研究[D].广州：中山大学，2001.[3]张德顺，方丽君，丁文岭，等.PCR 检测鳜虹彩病毒在生产中的应用探索[J].科学养鱼，2015（12）：58-59.[4]邓敏，何建国，左涛等.鳜鱼传染性脾肾坏死病毒（ISKNV ）PCR 检测方法的建立及虹彩病毒新证据[J].病毒学报，2000，16（4）：365-369.[5]SC/T 7211-2011.传染性脾肾坏死病毒检测方法[S].北京：中国农业出版社，2011.[6]周月琴，朱伟，刘志萍，等.用Chelex-100快速提取微量血痕中的DNA[J].复旦学报（医学版），2003，30（4）：379-380.[7]步嵘，王耀平，叶元康.以Chelex-100为介质抽提DNA[J].中华病理学杂志，1999，28（5）：379-380.[8]Walsh PS,Metzger DA,Higuchi R.Chelex 100as a Medi -um for simple extraction of DNA for PCR -Based typing from forensic material[J].Biotechniques,1991,10（4）:506-513.[9]刘开会，李宗亮，常彩琴.实用法医DNA 检测[M].西安：西安出版社，2000：73-98.（收稿日期：2019-01-29）注：0：发病鳜鱼组织研磨液；1-10：组织研磨液的10-1-10-10；-：阴性对照；+：阳性对照；M ：2000bp DNA Marker 。