DNA甲基化检测技术应用与技术比较

DNA甲基化检测技术应用与技术比较

DNA甲基化作为表观遗传学研究的重要范畴，已经越来越受到研究者的关注。近些年来，随着DNA甲基化与组蛋白甲基化的联合作用机制、RNA干扰机制及去

甲基化机制的发现，使得DNA甲基化研究受到广泛关注，从医学领域扩展到动植物研究当中，同时在研究方法上也取得了很大的突破。现在用于DNA甲基化检测

的方法大概有十多种，从应用上来分，大致可以分成两类：全基因组甲基化分析及特异位点甲基化检测。下面，我们就这两大类检测技术进行分析比较，以便于在实际的科研工作中进行选择。

一、全基因组甲基化检测技术

1. 基于芯片平台的全基因组甲基化筛选

芯片平台作为目前比较成熟的筛选工具，已经在很多领域有了相应的应用。多家芯片公司在DNA甲基化这块儿有了相应的产品提供，其中应用最为广泛的就

Agilent平台和Illumina平台，相应的产品包括Agilent

Human CpG Island Microarray

Kit，Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450K

BeadChip。另外Roche NimbleGen和Affymetrix也有相应的芯片推出，但是NimbleGen的芯片今年下半年已经停产。

不同的芯片平台，各自的实验过程也是不一样的。安捷伦前期采用的甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术。将基因组DNA分成两份，一份用来做

MeDIP，另一份作为对照。两个样品都标记荧光(富集的样品用Cy5标记，对照用Cy3标记)，然后与芯片杂交。芯片上每个探针的Cy5/Cy3强度比

例显示出该区域的甲基化程度。

安捷伦公司芯片平台因其强大的eArray探针设计平台，可以进行芯片的定制。在甲基化领域同样适用。

Agilent平台因为MeDIP技术本身的特点，都不能到达单碱基的分辨率，而Illumina的Infinium和GoldenGate检测技

术却做

得到。Illumina的Infinium甲基化检测技术来源与前期的SNP检测，采用的是单碱基延伸的原理。分析利用两个位点特异的探针检测这些序列差

异的位点，一个探针是为甲基化位点(M磁珠类型)设计的，而另一个是为未甲基化位点(U磁珠类型)设计的。探针的单碱基延伸掺入了一个标记的ddNTP，

它随后被荧光试剂染色。通过计算甲基化与未甲基化位点的荧光信号比例，可确定检测位点的甲基化水平。Illumina公司早期推出的Infinium

HumanMethylation27

BeadChip芯片覆盖27,578个CpG位点。这款芯片在医学领域有广泛的应用，除了和肿瘤相关的甲基化筛选之外，也能用于其他疾病相关甲基化检

测。因此对这款产品，研究者给予了很高的评价，目前此产品已停产，取而代之的是Infinium HumanMethylation450 BeadChip芯片。它以单碱基分辨率覆盖了基因组中超过45万个甲基化位点，实现了基因区域和CpG岛的全面覆盖。此外，还包括CpG岛之外的CpG

位点，在人类干细胞中鉴定出的非CpG甲基化位点，以及肿瘤和正常组织中差异表达的甲基化位点等等。它的高覆盖度、高通量以及低价格，让它成为进行全基因

甲基化筛选的有力武器。

相比之下，VeraCode

GoldenGate甲基化分析技术更适合中通量的筛选及验证研究，它以以矩阵微珠芯片(Sentrix Array

Matrix(SAM)）形式分析48至384个用户指定的CpG位点。首先，将亚硫酸氢盐处理的基因组DNA

与分析oligo混合，oligo与未甲基化位点的U互补，或者与甲基化位点的C互补。杂交之后，引物延伸，并连接上位点特异的oligo来产生通用

PCR的模板。最后，用标记的PCR引物生成可检测的产物。据Illumina的产品专家介绍，其产品的最大优势在于单个CpG位点的分辨率。其它分析将

甲基化定位在一段区域，而通过Illumina分析，你能精确测定某个CpG位点的甲基化水平。

2. 基于高通量测序平台的甲基化图谱分析

随着二代测序技术的告诉发展，测序成本大幅度下降，使得真正实现全基因组甲基化分析的研究成为可能。随着人类甲基化图谱绘制成功，已经陆续有多个物种的甲

基化图谱构建完成。研究者将传统的DNA甲基化检测方法，如亚硫酸氢盐转化与高通量测序相结合，可以实现单碱基精度的甲基化图谱的构建。此外将成熟的

MeDIP技术与二代测序相结合，可以快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织、甚至疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。因此

该技术也特别适用于大样本量的疾病表观研究。

第三代测序技术的出现，更是让甲基化的直接测定成为可能。一年前，美国Pacific Biosciences公司利用独有的单分子实时(SMRT)测序技术，直接测定了DNA的甲基化。这项成果发表在《Nature Methods》杂志上。

二、特异位点甲基化检测技术应用比较

1.甲基化特异性PCR（MS-PCR）

DNA在亚硫酸氢盐作用后，DNA

CpG若无甲基化，则序列中的C改变为U，若有甲基化则保持不变，因此从理论上讲，用不同的引物做PCR，即可检

测出这种差异，从而确定基因有无CpG岛

甲基化。因此根据目的基因修饰前后的改变，就可以相应设计M和U引物，有时我们需要设计两轮引物。

这种方法灵敏度高，无需特殊仪器，因此经济实用，是目前应用最为广泛的检测方法。不过也存在一定的局限性，预先需要知道待测片段的DNA序列，引物的设计非常重要。另外，亚硫酸氢盐处理也十分关键，若处理不完全则可能导致假阳性的出现。

2. 亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)

这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，设计引物进行PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行克隆测序，将

序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但因为涉及到

测序，其结果准确但要求克隆时所挑克隆较多，操作繁琐，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依赖于挑选克隆的数目，因此这种方法只能算得上是一种半定