甘蓝自交系背景选择标记的建立

园艺学报 2014，41（8）：1620–1630 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@ 甘蓝自交系背景选择标记的建立刘基生，苗雯雯，王冬梅，庄 木*，方智远，刘玉梅，杨丽梅，张扬勇，李占省（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）摘 要：为了快速、准确识别不同甘蓝自交系的遗传背景，提高回交育种效率，利用36对多态性EST-SSR引物对8个甘蓝变种的101份自交系进行扩增，应用NTSYSpc2.11a进行遗传背景分析表明，不同甘蓝变种种内平均遗传相似系数都大于0.55，变种间遗传相似系数为0.45 ~ 0.59，101份自交系在遗传相似系数0.62处基本可聚为8个类群。

在此基础上，选出23份具有代表性的自交系材料，增加筛选获得多态性稳定的50对EST-SSR引物，初步建立了一套包含86对引物的甘蓝背景选择标记，并应用于甘蓝自交亲和性的回交选择。

关键词：甘蓝；自交系；背景选择；EST-SSR中图分类号：S 635 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）08-1620-11 Establishment of Markers for Genetic Background Selection of Inbred Lines in CabbageLIU Ji-sheng，MIAO Wen-wen，WANG Dong-mei，ZHUANG Mu*，FANG Zhi-yuan，LIU Yu-mei，YANG Li-mei，ZHANG Yang-yong，and LI Zhan-sheng（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）Abstract：For the purpose of the rapid and accurate identification of genetic background of cabbage inbred lines and the improvement of backcross breeding efficiency，we performed PCR amplification of 36 primer pairs in 101 inbred lines from eight varieties in Brassica oleracea and analyzed their genetic background using software NTSYSpc2.11a. Results showed that all the average coefficients of intra- variety for the eight varieties are bigger than 0.55，and that of inter-variety vary from 0.45 to 0.59. The 101 B. oleracea accessions can be divided into eight groups with the coefficient of 0.62. Based on these results，23 out of 101 inbred lines were selected and 50 EST-SSR markers were added. At last，a set of 86 markers for genetic background selection was preliminarily obtained and used successfully for the backcross selection of cabbage self-compatibility.Key words：cabbage；inbred line；background selection；EST-SSR收稿日期：2014–04–18；修回日期：2014–07–03基金项目：国家重点基础研究发展计划（‘973’）项目（2012CB1139）；国家‘863’计划课题（2012AA100101，2012AA100202）；国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-25）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（1610032011011，014JB02-004）；农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室项目* 通信作者Author for correspondence（E-mail：zhuangmu@）8期刘基生等：甘蓝自交系背景选择标记的建立 1621植物回交育种是将某个优良性状（或基因）从供体材料导入受体，是改良受体品种（或品系）的重要途径。

传统的回交育种，仅仅根据植物学性状进行选择，回交后代的遗传背景要达到轮回亲本遗传背景的99%以上，一般需要5 ~ 6代连续回交选择，轮回亲本的背景恢复速率较慢。

利用分子标记辅助背景选择可在幼苗期即进行大量植株的筛选，提高回交育种效率（Semagn et al.，2006）。

例如，利用AFLP标记辅助玉米背景选择的研究表明，仅经过两代选择，BC2F1与轮回亲本的相似性就达到了94.8%，大大高于常规选择的85%（宋敏和张世煌，2007）。

近年来在大豆 （段红梅等，2003）、油菜（刘志文 等，2006）、大白菜（吴迪 等，2010）、小麦（许兰杰，2009；董冬，2011）、玉米（周洪昌 等，2011）等多种作物中应用分子标记技术辅助轮回亲本背景选择已有报道。

21世纪以前，甘蓝类蔬菜作物杂种优势利用主要采用自交不亲和系途径，甘蓝自交系多为自交不亲和系；但近年来，随着利用雄性不育系配制甘蓝杂交种上升为主要育种途径，迫切需要自交亲和系的选育（杨丽梅 等，2011；方智远 等，2012）。

对于已用于配制甘蓝杂交种的优良自交不亲和系，可通过先与自交亲和系杂交、再连续回交、自交的方法，获得既保持原来综合优良性状又兼具自交亲和性的改良自交系，而应用分子标记辅助选择可加速此选育进程。

本研究中利用EST-SSR引物对8个甘蓝变种的101份自交系进行遗传背景分析，并据此选出具有代表性的自交系材料，利用选定的材料筛选更多的引物，初步建立一套能够用于甘蓝辅助回交育种的分子标记，并将得到的分子标记应用于自交亲和性的回交辅助选择，为加快甘蓝轮回亲本的背景恢复提供依据。

1 材料与方法1.1 材料采用属于8个甘蓝变种的101份自交系（均自交5代以上）为遗传背景分析的试验材料。

为了将自交系‘87-534’的自交亲和性导入自交不亲和系‘96-100’，构建了541个植株组成的（96-100 × 87-534）× 96-100的回交一代群体（BC1），其中含有前景标记（SRK5）的290个植株用作背景标记辅助选择的试验材料。

2012年秋季播种，定植于露地，2013年春将所有选定的植株定植于中国农业科学院蔬菜花卉研究所试验温室。

在2012年秋季苗期采集幼叶于–80 ℃贮存备用。

1.2多态性EST-SSR引物的筛选与背景标记的确定利用改良的CTAB法提取供试材料叶片的基因组DNA，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测其浓度及纯度。

将检测合格的DNA贮存于–20 ℃冰箱备用。

首先选取200对甘蓝EST-SSR引物（陈琛等，2010），对101份自交系材料进行扩增，筛选出多态性引物用于计算种内、种间遗传相似系数及聚类分析。

然后根据遗传背景分析结果，每个变种按自交系数的1/5选出至少1份代表性材料，当选出的变种代表性材料在两个以上时，尽量选择遗传距离较远，并且成熟期、球形、叶色、抗逆性、原始来源地有差异的自交系。

利用选定的代表性材料，增加筛选300对EST-SSR引物（陈琛等，2010）以获得更多的多态性引物。

入选的多态性引物要求其产生的至少1个等位变异在25% ~ 75%的材料中存在（或缺失）。

获得的符合多态性要求的所有引物组成一套可用作辅助甘蓝自交系背景选择的分子标记。

根据多态性引物的扩增结果，选取在甘蓝自交系‘96-100’和‘87-534’间具有多态性且尽量分布于甘蓝基因组全部9条染色体上的引物，用作背景选择标记辅助甘蓝自交亲和性的回交选育。

1622 园艺学报41卷PCR反应采用20 µL扩增体系：dNTPs（2.5 mmol · L-1）1.6 µL，10 × TransTaq HiFi Buffer（含Mg2+）2 µL，上游和下游引物各5 pmol，TransTaq TM HiFi DNA Polymerase（5 U · µL-1）0.2 µL，50 ng DNA模板，所用试剂均购于北京博迈德科技发展有限公司。

反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，合适的温度退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸7 min，16 ℃保存。

每对引物的退火温度根据引物合成报告单确定。

PCR产物采用8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，恒压160 V。

利用快速银染法进行染色（梁宏伟等，2008）。

1.3数据统计针对引物产生的每个等位变异，不同材料在该等位变异处，有带记为‘1’，无带记为‘0’，缺失记为‘999’。

最终整理得到一个由0/1构成的数据矩阵。

根据条带的统计结果计算引物多态性信息量（PIC），PIC = 1–∑（P i）2，其中P i为群体中含有第i个等位位点的频率。

PIC≥ 0.5，为高度多态性信息引物，0.25 ≤ PIC <0.5，为中度多态性信息引物，PIC <0.25，为低度多态性信息引物（Botstein et al.，1980）。

利用NTSYSpc2.11a软件，计算变种内及变种间的遗传相似系数，采用非加权类平均法（UPGMA）进行聚类分析。

2 结果与分析2.1甘蓝变种材料的遗传背景分析利用200对EST-SSR引物扩增101份自交系，共得到36对多态性好的引物，以NTSYSpc2.11a 软件计算8个变种的种内遗传相似系数，结果（表1）显示：球茎甘蓝变种内的平均遗传相似系数最大（为0.82），表明其遗传背景较窄；野生甘蓝变种内的平均遗传相似系数最小（为0.55），表明它们之间遗传背景相差较大；除球茎甘蓝外的7个变种的不同自交系间遗传相似系数的变化幅度都较大（最小遗传相似系数 ≤ 0.50，最大遗传相似系数 ≥ 0.76），说明这些变种内自交系的遗传背景具有较大的差异性。