CHIP实验操作

ChIP实验操作指南

国家瓜果改良中心荔枝分中心

采用Bowler等（2005）的方法，具体如下：

1收获2.0g花生根、茎、也、种子于一个50ml离心管中。

2加40 ml超纯水于离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2次。

3去掉尽可能多的水，再加入37ml 1% 甲醛，与15-25 ℃，真空放置15 min。

4 加入2.

5 ml 2 M甘氨酸是离心管中的甘氨酸的终浓度为0.125 M，再真空放置5 min。

5 加40ml超纯水与离心管中，轻柔颠倒离心管洗材料2-3次。

6去掉尽可能多的水，液氮速冻后-80℃保存或直接利用。

第一天

1 准备核酸提取液Extraction buffer 1、2、3，并4 ℃预冷。

2 液氮淹没样品，样品尽量磨碎，注意不用潮解样品。

3 预冷的50 ml离心管中加入预冷的30 ml核酸提取液1 ，再将样品粉末加入离心管中，轻柔颠倒混匀后放在冰上5 min.

4 再拿一个50 ml离心管于冰上预冷，用两层滤膜将样品过滤入该离心管，如果滤液中仍有残渣，重复步骤4。

5 4 ℃， 3000g 离心10min。

6 小心弃上清，加入1 ml 4 ℃预冷核酸提取液2重悬浮沉淀，移入进口（或严格灭菌）的1.5ml 离心管，4 ℃，12000g离心溶液10Min.

7 小心弃上清，加入300μl 4 ℃预冷核酸提取液3重悬浮沉淀,可以轻柔颠倒助匀，但要避免起泡。（核酸提取液3很粘稠，但还是要尽量重悬浮好沉淀）。

8 在一新4 ℃预冷离心管中加300μl 4 ℃预冷核酸提取液3，再将步骤7的溶液小心加入上层，4 ℃，16000g离心溶液1h（准备步骤9，制一块1%琼脂糖凝胶，用80μl CHIP 洗液洗磁珠）。

9 准备核酸裂解液 Nuclei lysis Buffer。

10 小心弃上清，加入300μl预冷核酸裂解液，于冰上用（剪过尖端）枪头吹打溶液混匀或轻柔颠倒助匀，但要注意避免起泡。并取出1-2μl混匀也来作为对照看超声波破碎后的对照。

11 超声波破损染色质5次，每次15s，中间间隔1 min 避免溶液过热，避免损失过多及起泡。跑电泳（1%琼脂糖凝胶）检测超生效果（应该在200-1000bp之间）。可以把破碎后的染色质-80 ℃保存或直接进入下一步。

12 超声波破碎后溶液4 ℃，12000g离心5 min，上清液移至1个5ml离心管中，并移出10μl来，于-20℃保存作为“Input DNA对照”。

13 先验证这时候的超声波破碎后溶液体积少于300μl，再补加CHIP洗液至总体积3 ml。

14 平均分为3管，每管加入洗好的磁珠40μl，用4 ℃震荡器轻柔震荡1h，这时也可只分为2管（其中一个为负对照），一管保存起来备用。在洗好100μl磁珠。

15 上一步溶液4 ℃，12000g离心30s，上清液移至另外一个新1.5ml 离心管，在其中的一管中加入5μl抗体（另一个为不加抗体的负对照），4 ℃震荡器轻柔震荡5h以上或过夜。

第二天

16 加洗好的50μl磁珠到每管中，4 ℃震荡器轻柔震荡孵育1h以上。

17 把低盐洗液、高盐洗液、LiCl洗液、TE洗液置于冰上。

18 配新鲜洗液（Elution Buffer）:20% SDS 1ml，NaHCO3 0.168 g 加水至总体积为20ml。

19 4℃，小于3800 g离心溶液30 s,收集磁珠，弃上清（上清保留做 total DNA control）。

20 依次用低盐洗液、高盐洗液、LiCl洗液、TE洗液洗10min， 4 ℃，小于3800 g离心溶液30 s收集磁珠，最后弃掉尽可能多的TE溶液。

21 加入250 μl Elution Buffer 到每管中，轻柔颠倒助匀后在65 ℃孵育15 min，没3 min 轻柔颠倒离心管1次助匀，15-25 ℃，3800 g离心溶液2 min，小心将上清液移入一个新离心管中，再加入250μl洗液（Elution Buffer）到每管，重复这一步骤，把上清混在同一离心管中。

22 加20 μl 5M NaCl到每管中阻断交联，65℃孵育6 h以上或孵育过夜（孵育后跑1%琼脂糖凝胶看DNA）；在“Input DNA对照”中加入500μl Elution Buffer和20μl 5M NaCl 也进行同样孵育。

第三天

23 在3管溶液中加入：0.5 M EDTA 10μl,1 M Tris-HCl (pH 6.5)20 μl, 10mg/ml Proteinase K 2μl（可不加蛋白酶），45 ℃孵育1 h 。

24 用1：1的酚/氯仿提取DNA，再用含有0.3M NaAc(pH 5.2)HE 2μl糖还原（10mg/ml）的乙醇沉淀DNA后，用70%乙醇洗DNA后，加入16μl纯水溶解DNA。

25 取出2μl DNA来可以稀释10倍，用1-2μl作为模板做PCR (定量PCR)

附录：

Extraction buffer 1：

2M Sucrose 14ml,

1M Tris-HCl (pH 8) 0.7ml,

1M MgCl 0.7ml,

14.3 M β-ME 24.5μl，

0.2 M PMSF 35μl,

PI（25×储存液） 2.8 ml。

Extraction buffer 2:

2M Sucrose 1.25ml

1M Tris-HCl (pH 8) 100μl

1M MgCl 100μl

20% Trion X-1001 0.5 ml

4.3 M β-ME 3.5μl

0.2 M PMSF 5μl

PI（25×储存液） 0.4 ml

Water To 10 ml

Extraction buffer 3:

2M Sucrose 8.5ml

1M Tris-HCl (pH 8) 100μl

1M MgCl 20μl

20% Trion X-1001 75μl

14.3 M β-ME 3.5μl

0.2 M PMSF 5μl

PI（25×储存液） 0.4 ml

Water To 10 ml

Nuclei lysis Buffer:

1M Tris-HCl (pH 8) 0.5 ml

0.5M EDTA 200μl

20% SDS 0.5 ml

PI（25×储存液） 0.4 ml

Water To 10 ml

ChIP dilution buffer:

20% Trion X-1001 1.1 ml

0.5M EDTA 48μl

1M Tris-HCl (pH 8) 334μl

5M NaCl 668μl

Water To 20 ml

注：本方法由生命科学院庄楚雄课题组提供