5株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7全长基因的克隆及序列分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析
第29卷第1期2009年2月郑州牧业工程高等专科学校学报Jour nal of Zhengzho u Co lleg e of A nimal Husbandry Eng ineer ing V o l.29N o.1February 2009收稿日期:2006-12-15基金项目:河南省基础与前沿技术研究计划项目(072300430060),河南省重点科技攻关(072102130023),河南省高校科技创新人才支持计划作者简介:曹素芳(1973- ),女,四川武胜人,博士,副教授。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析曹素芳,王 岩,肖松云,唐桂芬(郑州牧业工程高等专科学校,河南郑州450011)摘要:采用RT -P CR 方法对疑似P RRS 阳性病料进行克隆和测序获得了O RF7基因片段。
序列分析结果表明获得的O RF7基因序列不存在缺失现象。
与美洲型代表毒株VR -2332的核苷酸序列的同源性为9113%,氨基酸同源性为9216%;与我国最早的PRR SV 分离株CH -la 相比,核苷酸同源性为9315%,氨基酸同源性为9216%;与我国高致病性P RRSV 毒株SD-Z Q 的核苷酸同源性最高为9811%,氨基酸只有两个不同,同源性为9813%;与本省的Hn-1/06毒株的核苷酸同源性为9713%,氨基酸同源性为9715%;与2004年分离的F J-2株与O RF7基因的核苷酸差异稍大为8514%,氨基酸同源性为8816%;与欧洲型分离株LV 株和N-34株ORF 7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为4111%和40%,氨基酸同源性为4711%和4716%。
表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。
关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;O RF7基因;变异中图分类号:S852165 文献标识码:A 文章编号:1008-3111(2009)01-0001-03Variation Analysis of Porcine Syndromeand Reproductive and Respiratory Virus ORF 7G eneCAO Su-fang,WANG Yan,XIAO So ng -yun,T ANG Gui-fen(Zhengzhou Co llege o f Animal Husbandry Eng ineering ,H enan Zheng zho u 450011,China)Abstract:T he O RF7genes of patho log ic materia l suspected PR RS w as amplified by R T -PCR 1T he product w as se -quenced after clo ning into pM D18-T v ecto r 1T he sequence was analysed by D NA M A N softw are and com par ed w ith those of V R-2332,CH -la,SD-ZQ ,H n-1/06,F J-2,L v and N -341it show ed that the nucleot ide sequence ho -molog y w ere 9113%,9315%,9811%,9713%,8514%,4111%and 40%respectiv ly 1And the deduced amino acide ho -molog y w ere 9216%,9315%,9813%,9715%,8816%,4711%and 4716%respectivly 1I t indicated that the iso late strain w as related to t he N or th Amer ican P RRSV genoty pe 1A mo ng them the nucleotide sequence and amino acide ho -molog y both wer e the hig hest comparing w ith highly pat ho genic po rcine r epr oductive and r espir ator y syndr ome vir us SD-ZQ strain 1Key words:Po rcine repro ductiv e and respirato ry syndr ome vires;O RF7gene;v ariat ion analy sis猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syn -drome,PRRS)的病原,主要引起母猪早产、流产等繁殖障碍,仔猪、育肥猪呼吸困难[1]。
河北猪繁殖与呼吸综合征病毒地方株HB-4(hs)株ORF5-7基因变异分析
2. 2 目的基因的克隆及酶切分析 克隆菌提质粒 pGM E/ M/ N 用 Eco R 和Hin d ! 进行双酶切鉴定, 通过琼脂糖凝胶电泳分别得到约 3 kb 的 pGM 空 载 体 和 目 的条 带, 结 果 与 预期 相 符 ( 图 2) 。 2 3 PRRSV HB 4( hs) 株 ORF5 7 基因序列的测定 将含 PRRSV HB 4( hs) 株重组质粒 pGM E/ M/ N 的阳性菌液进行测序, 获得 HB 4( hs) 株 ORF5 , ORF6, ORF7 编码框序列 , 分别长603, 525, 372 bp, 并推导出 相应的氨基酸序列。按顺序拼接, 获得 HB 4( hs) 株 ORF5 7 编码框序列, 全长 1 473 bp。测序结果已登录 在 Genbank 上, 登录号为: EU346383。 2. 4 核苷酸及氨基酸相似性的比较 运用 DNAstar 分析软件对 HB 4( hs) 株基因序列进 行分析, 并与 GenBank 上发表的 PRRSV 美洲型代株 VR 2332 株、 欧洲型代表株 LV 株及国内多株美洲型毒 株 ORF5 7 基因序列进行比较和变异分析( 表 1) 。
猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析
道。 ．福建省某种猪场 自２０ 年来 ，也不时出现少数母猪产死胎和木乃伊胎 ，１ ２月龄仔猪 出现 。 ０１ —
呼吸障碍 ，显示出 Ｐ Ｒ 症状．２０ ＲＳ ０３年底至 ２０ ０４年初 ，该猪场爆 发较严重疑似 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ疾病 ，经本研 究室利用 Ｒ —Ｃ ＴＰ Ｒ技术确诊为 Ｐ Ｒ ｌ ，初步推定病毒属于美洲型 ，但病毒基因序列 不清楚．本研究 Ｒ Ｓ８ Ｌ 】
［ 摘要 ］根据猪 繁殖 和呼吸综合征病 毒 （ Ｒ Ｖ） 已发表 的核苷酸 序列 ，设计 了 １ 特异 性 引物 Ｐ ／ Ｐ ＲＳ 对 １ Ｐ ，用 Ｒ ．Ｃ ２ ＴＰ Ｒ扩 增了 Ｐ Ｒ Ｖ福建 毒株 Ｆ． Ｆ ＿ ＲＳ Ｊ１和 Ｊ ２的全长核 衣壳 蛋白基 因 （ Ｒ大肠杆 菌 Ｄ １ Ｂ，提取 阳性重组质 粒进行 序列测定 与分析．结果 表明 ：Ｆ． Ｈ０ Ｊ１和 Ｆ． Ｊ２毒 株 Ｏ Ｆ 因均为 ３２ｂ ，编码 １３个氨基酸 ，与美洲 型参 考毒株 Ｖ ．３２及欧洲 型参考 毒株 Ｌ Ｒ ７基 ７ ｐ ２ Ｒ２３ Ｖ的核 苷酸 同源性分别为 ９． ６％ ，９ ．５％和 ６ ．ｏ％ ， ０６ ５１ ４３ １４ ６ ．５％ ，其推导 的氨基 酸同源性分别为 ９ ．３％ ，９ ．２％ ５９ ５１ 和 ５ ． ９％ ，５ ． ３％．研 究表明 ，福建流行 的 Ｆ． 和 Ｆ－ 属 于美洲 型 Ｐ Ｒ Ｖ毒株． ６４ ５７ Ｊ１ Ｊ２ ＲＳ ［ 关键词 ］Ｐ Ｒ Ｖ；福建 毒株 ；Ｏ Ｆ ；序列分析 ＲＳ Ｒ７ ［ 中图 分类号］ Ｓ８２ ６ ；Ｑ ７ ５ ． ５ ８ ［ 文献标识码］ Ａ
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第 ｌ卷 １
第 ３期
集 美大学学报 （ 自然科 学版 ）
Ｊｕｎ ｌ ｆ ｉ ｉ ｎｖｒｉ （ ａ ｒ ｃ ｎ ｅ ｏｒａ ｏ ｍｅ Ｕ ｉｅｓｙ Ｎ ｔ ａ Ｓｉ ｃ） Ｊ ｔ ｕｌ ｅ
猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析
猪繁殖和呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆与序列分析吴国平;刘冰心;郭川;曹敏杰;苏文金【期刊名称】《集美大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2006(011)003【摘要】根据猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)已发表的核苷酸序列,设计了1对特异性引物P1/P2,用RT-PCR扩增了PRRSV福建毒株FJ-1和FJ-2的全长核衣壳蛋白基因(ORF7),将扩增产物连接到pUCm-T载体并转化大肠杆菌DH10B,提取阳性重组质粒进行序列测定与分析.结果表明:FJ-1和FJ-2毒株ORF7基因均为372 bp,编码123个氨基酸,与美洲型参考毒株VR-2332及欧洲型参考毒株LV的核苷酸同源性分别为95.16 %,94.35 %和61.40 %,60.65 %,其推导的氨基酸同源性分别为95.93 %,95.12 %和56.49 %,55.73 %. 研究表明,福建流行的FJ-1和FJ-2属于美洲型PRRSV毒株.【总页数】6页(P217-222)【作者】吴国平;刘冰心;郭川;曹敏杰;苏文金【作者单位】集美大学水产学院、水产生物技术研究所,福建,厦门,361021;厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021【正文语种】中文【中图分类】S852.65;Q78【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达[J], 梁望旺;徐涤平;熊忠良;刘泽文;杨克礼;伍锐;邓均华;段正赢;余爱冬;唐文娟2.杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析 [J], 李冰;卢赫;冯方周;丁壮3.11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析 [J], Li J;吴艳4.猪繁殖与呼吸综合征病毒北京分离株的ORF7克隆与序列分析 [J], 高云;杨汉春5.猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析 [J], 樊振华; 刘文俊; 武守艳; 吴忻; 孟帆; 焦福林; 薛翼鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株GP5蛋白ORF5基因的克隆与序列分析吴晓薇;刘晓慧;杨谦;熊蕊;郭凤柳;郭霄峰;阳佑天;陈茹【摘要】为揭示广东地区猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可能的流行规律,本研究采用RT-PCR的方法扩增5株来自广东地区猪场临床样品的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respirato-ry syndrome virus,PRRSV)分离株的GP5蛋白ORF5基因,将其克隆、测序后与国内外部分毒株相应基因进行核苷酸序列比较.结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株与美洲型参考株(VR-2332)的核苷酸序列同源性分别为88.8％、99.5％、88.7％、88.7％和83.5％.系统进化树分析结果表明,PRRSV-2011-GD2、PRRSV-2011-GD3、PRRSV-2013-GD1、PRRSV-2013-GD2和PRRSV-2013-GD3株均属于美洲型.以上结果为更好地了解PRRSV的分子流行病学特征和抗原变异规律提供依据,同时为研制基因工程疫苗奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)011【总页数】4页(P40-43)【关键词】猪繁殖与呼吸综合征;GP5蛋白;序列分析【作者】吴晓薇;刘晓慧;杨谦;熊蕊;郭凤柳;郭霄峰;阳佑天;陈茹【作者单位】广东出入境检验检疫局,广东广州510642;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;华南农业大学,广东广州 510640;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;保定出入境检验检疫局,河北保定071051;华南农业大学,广东广州510640;华南农业大学,广东广州 510640;广东出入境检验检疫局,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S854.4+3猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV)以引起母猪繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状为临床特征的接触性传染病(田志平等，2012)，是影响全球养猪业最重要的疾病之一。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5／6和ORF6／7重叠区的分离(人工)改造病毒的构建及鉴定
摘
要 ：为 了研 究重 叠序 列在 病毒 繁 殖周 期 中所起 的 作 用 以及 更 好 地操 作 感 染性 克 隆 ，将猪 繁 殖与 呼 吸 综合
征 病 毒 （Ｒ Ｓ ） 染性 克 隆 Ｏ Ｆ间（ Ｒ ５ ＰＲ Ｖ感 Ｒ Ｏ Ｆ／ ６和 Ｏ Ｆ／） 叠 区域 分 离并插 入 酶切 位 点 ，成 功 构 建 两 个 突 变 的 全 长 Ｒ６ 重 ７ 质 粒 ，随 后进 行 了病 毒 拯 救 和 复制 分 析 。结 果 表 明 ：（） 个 全 长 质 粒 均 能 够进 行 病毒 拯 救 ，并 产 生 明 显 细 胞病 Ｉ两 变 ；（） 变病 毒 具遗 传 稳 定 性 ；（） 毒 空斑 形 态及 生 长 曲线 与 亲本 毒 株 近似 。表 明 Ｐ Ｒ Ｖ Ｏ Ｆ间重 叠碱 基 的 安 ２突 ３病 Ｒ Ｓ Ｒ 排 方式 对 病毒 的 感 染性 是 非 必 需 的 ，获 得 的 两株 突 变病毒 为进 一 步研 制 Ｐ Ｒ Ｖ基 因标 识 疫 苗 、研 究 Ｐ Ｒ Ｖ 各 编 Ｒ Ｓ ＲＳ
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第３ ０卷 第 ２期
２０ 年 ２ 月 ０８
中 国 预
防
兽
医 学 报
Ｖ ｏ ．０． Ｏ． １３ Ｎ ２ Ｆｅ ２０ ｂ． ０８
Ｃｈ ｎ ｓ ｏ ｍａ ｆＰ ｅ ｅ ｔ ｅ Ｖｅｅ ｎ ｒ ｄｃｎ ｉｅ ｅ Ｊ ｕ ｌｏ ｒ ｖ ｎ ｉ ｔｒ ａｙ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｖ ｉ
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起怀孕母猪发热、厌食、早产、晚期流产、死胎、弱仔和木乃伊胎等繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统症状和高病死率的接触性传染病。
该病于1987年首次在北美发现[1]，1991年欧洲发生本病,并在荷兰首次分离到PRRSV，命名为Lelystad病毒(LV) [2]；美国于1992年分离PRRSV，命名为VR-2332[3-4]；郭宝清等[5]于1996年首次从我国疑似PRRS病猪中分离到PRRSV，从而证实了该病毒在我国的存在。
本病可经水平和垂直两种方式传播，其流行已给养猪业造成了巨大的经济损失。
PRRSV是一种有囊膜的正股单链RNA病毒，与马动脉炎病毒（EAV）、鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）和猴出血热病毒（SHFV）同属于最近分类的动脉炎病毒科(Arteriviridae)[6]。
PRRSV病毒基因组长约15kb，含8个开放阅读框架(ORFs)，LeCall等［7］研究表明，8个开放阅读框架中ORF7高度保守，即使是在体内传代也很少引起ORF7的核苷酸序列变异。
此外，ORF7编码的核衣壳蛋白（N蛋白）具有良好的免疫原性及反应原性[8-9]，机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白。
因此，N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。
本实验以ORF7基因为研究对象，应用分子克隆技术对ORF7基因进行扩增、构建原核表达载体、序列分析，为今后进一步深入研究该片段奠定基础。
1材料1.1病毒、细胞及载体PRRSV毒株（北京分离株）、猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因原核表达载体的构建及序列分析张永富1,2,3，马国文1，刘月焕2，刘永宏2,4，李明刚3，张秋雨3，刘锋3(1.内蒙古民族大学动物科技学院内蒙古通辽028000；2.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100089；3.北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司,北京100043；4.内蒙古农业大学动物科学与医学学院,呼和浩特010018)摘要：根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因序列，设计合成一对引物，应用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7基因（N基因）。
猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究的开题报告
猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究的开题报
告
1、项目背景
猪繁殖与呼吸综合征是一种由家猪繁殖呼吸道综合征病毒（PRRSV）引起的高传染性疾病，其症状包括呼吸困难、流涕、发热、疲劳等。
该疾病对猪的健康和养殖业
产生了重大影响，致使猪的生长速度减慢，肉质和产量受到影响，经济损失极大。
目前，传统的疫苗已经无法完全预防和控制PRRSV的感染，因此发展新型基因工程疫苗是解决这一问题的关键。
2、研究目的
本项目旨在研究猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗的制备、评估和应用，为预防和控制该疾病提供新的解决方案。
3、研究内容
（1）PRRSV毒株的筛选：根据不同地区PRRSV毒株的差异，筛选出适合我国地域的PRRSV毒株。
（2）疫苗构建：使用基因工程技术，将PRRSV毒株的变异抗原基因序列克隆至适宜的表达载体中，并经过多次酵母重组和转染，产生新型基因工程疫苗。
（3）疫苗评估：通过实验室和动物检测评估新型基因工程疫苗的免疫效果和安
全性。
（4）疫苗应用：在临床应用中进行疫苗免疫实验，并根据实验结果对其疗效和
投入效益进行分析。
4、预期成果
通过本项目的研究，将得到猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗的制备技术，为解决这一疾病给我国农业发展带来的困境提供技术支持。
此外，新型基因工程
疫苗的开发还将为家畜养殖业的信息化、智能化和产业升级提供新的理论和实践支持。
猪繁殖与呼吸综合征病毒全基因组分子遗传特征分析
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果降低
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果持续时间 缩短
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果产生耐药 性
病毒基因组变异 可能导致疫苗免 疫效果产生副作 用
基因组测序技术：二代测序、三代测序 等
基因组组装：利用生物信息学方法进行 基因组组装
基因变异分析：通过比对基因组序列， 分析基因变异
抗病毒药物的研发和应用，还可以为猪繁殖 与呼吸综合征病毒的预防和治疗提供新的手 段和方法，提高猪场的生产效益。
汇报人：
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的定义和
作用
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的分类和
特点
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记的检测方
法和技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒 基因组遗传标记在疾病诊
断和研究中的应用
抗原性变异的定义：病毒 表面抗原发生变异，导致
免疫系统无法识别
抗原性变异的原因：病毒 基因突变、重组、插入、
基因功能预测：利用生物信息学方法预 测基因功能
基因组进化分析：通过比较不同物种 的基因组，分析基因组的进化关系
基因组数据可视化：利用生物信息学软 件，可视化基因组数据
基因测序：通过DNA测序技术，确定基因序列 基因分型：通过基因分型技术，确定基因型 基因突变检测：通过基因突变检测技术，确定基因突变 基因表达分析：通过基因表达分析技术，确定基因表达情况
病毒免疫逃逸：抗原变 异、免疫抑制等
病毒与宿主相互作用： 病毒感染、免疫应答、 免疫调节等
病毒基因组变 异：的能
力
变异与致病力 的关系：变异 可能导致致病 力的增强或减
弱
研究意义：为 疫苗研发和疾 病防控提供依
猪繁殖与呼吸综合征病毒S-1株ORF5和ORF7基因的克隆及变异分析
ＺＨＡ ＮＧ ｕｎ－ｉ ｇ Ｃｈ ｌｎ ，ＺＨＡＮ Ｇ ａ ｈｕ ，ＺＡＮＧ － ｉ Ｗ ｎ－ ａ Ｋｅ ｗｅ ，Ｗ ＡＮＧ ｎｇ Ｙｉ ，
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上海农业学报
２ ０ ，４ ２ ： ０ ５ ０ ８ ２ （ ） ４ —４
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文 章 编 号 ：０ ０３ ２ （０ ８ ０ ．００ １ ０．９ ４ ２ ０ ） ２４ ．６
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析曹素芳;王岩;肖松云;唐桂芬【期刊名称】《郑州牧业工程高等专科学校学报》【年(卷),期】2009(029)001【摘要】采用RT-PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了ORF7基因片段.序列分析结果表明获得的ORF7基因序列不存在缺失现象.与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91.3%,氨基酸同源性为92.6%;与我国最早的PRRSV分离株CH-la相比,核苷酸同源性为93.5%,氨基酸同源性为92.6%;与我国高致病性PRRSV毒株SD-ZQ的核苷酸同源性最高为98.1%,氨基酸只有两个不同,同源性为98.3%;与本省的Hn-1/06毒株的核苷酸同源性为97.3%,氨基酸同源性为97.5%;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85.4%,氨基酸同源性为88.6%;与欧洲型分离株LV株和N-34株ORF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41.1%和40%,氨基酸同源性为47.1%和47.6%.表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异.【总页数】4页(P1-3,14)【作者】曹素芳;王岩;肖松云;唐桂芬【作者单位】郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011;郑州牧业工程高等专科学校,河南,郑州,450011【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.北疆地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因克隆与遗传演化分析 [J], 吴鹏;张勋;梁田;陈新凯;肖媛媛;盛金良2.猪MBL-C及DUSP1基因变异对猪繁殖与呼吸综合征病毒抗性影响的初步分析[J], 袁焰平;任钰为;江一波;贾启涛;徐亚杰;肖犟;方瑞;李其安;赵俊龙3.杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析 [J], 李冰;卢赫;冯方周;丁壮4.11株猪繁殖与呼吸综合征病毒中国分离株NSP2、ORF5、ORF7基因的序列分析 [J], Li J;吴艳5.猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF7基因序列分析 [J], 樊振华; 刘文俊; 武守艳; 吴忻; 孟帆; 焦福林; 薛翼鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析及通用实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用
猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株遗传进化分析及通用实时荧光RT-PCR检测方法的建立和应用猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus, PRRSV)引起的一种危害全球养猪业的病毒性传染病。
目前,在我国猪群中经典毒株、高致病性毒株和类NADC30毒株等美洲型PRRSV以及欧洲型PRRSV同时存在,导致国内PRRS流行状况十分复杂。
为掌握我国PRRSV的流行状况及其遗传变异特点,本研究对2008-2015年间在国内分离的61株PRRSV毒株进行全基因测序和序列比对,并对主要易变区Nsp2、GP5、GP3蛋白进行分析。
全基因分析结果显示,61个毒株中有5个欧洲型PRRSV和56个美洲型PRRSV。
56个美洲型PRRSV中有2个类NADC30 PRRSV和54个高致病性PRRSV。
54个高致病性PRRSV分离株之间的同源性为95.2%-99.9%,与高致病性PRRSV代表毒株JXA1的同源性为97.2%～99.3%。
2个类NADC30分离株之间的同源性为99.9%,与类NADC30 PRRSV代表毒株NADC30的同源性为95.4%。
5个欧洲型分离株之间的同源性为84.4%～99.7%,与欧洲代表毒株LV的同源性为87.2%-90.9%。
重要蛋白基因分析结果显示,PRRSV在不断变异中,以非结构蛋白Nsp2和结构蛋白GP5的变异最快。
61个分离株在非结构蛋白Nsp2部位均发生了 1-150aa 不等的缺失。
大部分分离株在重要结构蛋白GP5发生氨基酸突变,尤其是糖基化位点的位置和数量发生了不同程度的变化。
欧洲型分离株GP3高变区含有多个缺失及突变。
我们还发现了 4株新的PRRSV基因缺失毒株,这些毒株核苷酸或氨基酸的缺失位置及数量在中国尚未见相关报道。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析
猪 繁 殖 与 呼 吸 综 合 征 病 毒 （ ｏ ｃ ｅｒｐ ｏ ｕ— Ｐ ｒｉ ｅ ｒｄ ｃ ｎ
ｔ ｅ ｎ ｅｐｒｔｒ ｙ ｄｏ ｉｕ ， Ｒ Ｖ） 于 动 ｉ ｄｒｓｉ ｏｙｓｎ ｒ ｍ ｖｒ ｓ Ｐ ＲＳ 属 ｖａ ａ
法 主要 有免疫 过氧 化物 酶技 术 、 荧光标 记抗 体法 、 原
ＤＱ９ ８ ８ 、ＡＦ４ ４ ４ ８０ ０ ９ ０ ２、ＡＹ３ ６ ２ 、ＤＱ４ ９ １ 和 ６５ ５ ８ ３ １
Ｌ Ｙ ＯＬ Ｅ Ｅ Ｐ Ｙ ＮＶ（ Ｖ） 用 Ｄ ｔｒ中 的 Ｅ ｉ ｅ Ｌ ， ＮＡ Ｓａ ｄｔ ｑ Ｓ
位 杂交等 。这些检 测方 法仍 多应 用 Ｐ Ｒ Ｖ 保守 的 Ｒ Ｓ
脉 炎病毒 科 、 脉 炎 病 毒 属 ， 动 主要 引起 怀 孕 母 猪 流 核衣壳 蛋 白（ Ｎ蛋 白） 的单 克 隆抗 体作 为一抗 。本文
ＲＲ Ｖ的全 基 因和 ＯＲ ７ 因序列 进行 基 因进 Ｆ 基 产、 死胎 、 乃伊胎 、 木 早产 、 产弱仔 等 繁 殖 障碍和仔 猪 对 Ｐ Ｓ 呼 吸 困难 、 死 亡 率 及 育 肥 猪 呼 吸 道 症 状 。Ｐ Ｒ 高 Ｒ Ｓ 生 以来 ， 给世 界养猪 业造成 了巨大 的经 济损 失 ， 已成 为全球规模 化猪场 的主要 疫病 之一 。
维普资讯
动 物 医学 进 展 。０ ７ ２ （ １ ：６３ ２ ０ ，８ １ ） ２ —０
Ｐｒ ｇ ｅ ｓ ｉ ｅ ｅ ｉ ｒ ｅ ｉ ｉ ｏ ｒ ｓ ｎ Ｖ ｔ ｒｎａ ｙ Ｍ ｄ ｃｎｅ
猪 繁 殖 与 呼 吸综 合 征 病 毒 ＯＲＦ ７基 因 的遗传 变异 分 析
摘
要 ： Ｇｅ Ｂ ｎ 从 ｎ ａ ｋ中随机 选取 ２ ５株 猪繁 殖 与呼吸综合 征病 毒 （ Ｒ Ｓ 的全 基 因序 列进行 同源性 分 Ｐ Ｒ Ｖ）
猪繁殖与呼吸综合征病毒主要流行毒株检测方法的建立
关键 词 ： 猪 繁 殖 与呼吸 综合 征病 毒 ； ＯＲ Ｆ ５ 基 因； Ｎｓ ｐ ２基 因； 反 转 录一 聚 合酶链 反 应
中 图分 类 号 ： ￥ ８ ５ ２ ． ６ ５ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ６ － ０ ０ ０ １ — ０ ５
续 ３ ０个 氨 基 酸 的 缺 失 （ ４ ８ １位 和 ５ ３ ３ — ５ ６ １位 氨 基 酸） ＿ ７ ］ 。之后 的分 子流 行病 学研 究显 示 ， ＨＰ — Ｐ ＲＲ Ｓ Ｖ
逐 步成 为 田间 流行 的优 势 毒 株【 ５ ］ 。２ ０ １ ３年 以来 ， 一 种新的 Ｐ Ｒ ＲＳ Ｖ 变 异 毒 株 在 田间 被 检 测 到 ， 代 表 性
ＨＰ — Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 的 Ｎｓ ｐ ２编码 区具 有 特 征 性 的不 连 猪繁 殖与 呼 吸综合 征 （ Ｐ ｏ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｅ ｐ ｒ ｏ ｄ ｕ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ａ ｎ ｄ 示， ｒ ｅ ｓ ｐ ｉ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｓ ｙ ｎ ｄ ｒ ｏ ｍｅ ， Ｐ Ｒ ＲＳ ） 是 由猪 繁 殖 与 呼 吸 综
郭振 华 ， 陈鑫 鑫 ， 郭 军庆 ， 乔 松 林
（ 河南省农业科学 院动物免疫学重点实验室 ， 河南郑 州 ４ ５ ０ ０ ０ ２ ）
摘 要 ： 旨在 建 立针 对猪繁 殖 与 呼吸综 合征 病毒 田 间主要 流行 毒 株 的鉴 别诊 断 方 法 。通 过 比对 当前 田
间主要 流行 毒株 的基 因序 列 ， 分别 设 计 了针 对 ＯＲ Ｆ ５基 因 的通 用 引物 和针 对 Ｎｓ ｐ ２基对 引物针 对 不 同的毒 株 均 可 以扩增 出特 异性 的 目的条 带 ， 通 用 引物 可 以用 来检 测 田间主 要 的流行 毒株 ， 鉴别 引物 可 以 区分 当前 田间主要 流行 的 不 同毒株 。所 建 立的检 测方 法 具 有 良好 的 特 异性 和 敏感性， 可 以方便 地应 用 于猪繁 殖 与呼吸 综合 征病 毒 的分 子流行 病 学监控 和 快速检 测诊 断 ， 具有 良好 的应 用
猪繁殖和猪呼吸综合征病毒病原学特点分析
猪繁殖和猪呼吸综合征的病毒病原学特点分析1、引起无症状、持续感染或严重甚至致死的疾病。
2、在巨噬细胞中复制、造成免疫抑制：猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)感染猪后，主要是破坏肺泡巨噬细胞(PAMs)，和肺血管巨噬细胞(PIMs)，诱导旁观细胞以及外周单核细胞和肺泡巨噬细胞凋亡，同时引起血液的细胞总数和淋巴细胞数显著变化，造成免疫抑制。
PRRSV感染引起猪免疫功能的下降，特别是感染早期对免疫功能的抑制十分明显，有实验表明，对猪瘟弱毒苗的免疫效果有影响，其猪瘟抗体水平明显低于对照组;由于感染猪只的免疫功能受到影响，易继发其他病原体，造成继发感染或混合感染。
如圆环病毒2型、副猪嗜血血杆菌、放线杆菌、支原体等病原混合感染，给生产造成较大的损失与药费支出。
3、基因组表现出非常的易变性：很多生物学和遗传学证据表明，PRRSV有不同的毒株或分离株。
各分离株的毒力、抗原性差异较大，所引起呼吸道症状、繁殖障碍的能力和病变有较大的的差异。
这种经常变异导致机体被动免疫和获得性免疫对PRRSV的识别能力均降低，从而逃避免疫系统的识别及中和抗菌素体或细胞毒性T细胞的杀伤作用。
4、持续感染和隐性感染带毒：猪PRRSV的持续感染是该病在流行病学上的一个重要特征。
PRRSV存在于感染猪的血清﹑淋巴结﹑脾﹑肺等组织，可以存在很长时间，并不断向环境排毒。
5、PRRSV具有抗体依赖性感染增强现象(ADE现象)：当病毒和抗体产生抗原抗体复合物后，借助抗体(AB)的FC片段与靶细胞的FC受体结合，从而促进病毒进入细胞。
且PRRSV在猪群中长期持续感染。
当中和抗体滴度很高时，机体可阻止病毒的再次入侵。
当中和抗体水平较低时，病毒增殖进一步加强，进一步感染周围的易感猪只。
ADE 现象对防制PRRS工作带来一定的困难。
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析张永富;布日额;李明刚;张婷;刘永宏;马明;张秋雨;韩春华;林健;刘月焕;韦海涛;祝俊杰;赵景义;李栋梁;马国文【期刊名称】《农业科学与技术（英文版）》【年(卷),期】2009(010)002【摘要】[目的]本研究的目的是实现猪生殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7基因在遗传工程细菌中的有效表达，并在纯化后分析重组蛋白的免疫活性。
[方法]将构建的重组表达载体PET-ORF7转化到大肠杆菌ColiB121（DE3）中，并在最佳状态下通过IPTG诱导。
在分析SDS-PAGE和Western印迹之后，在变性条件下通过Ni-NTA HIS·结合培养树脂色谱柱纯化表达产物并通过梯度透析缩装。
随后，通过蛋白质印迹和间接ELISA检测所称位重组蛋白的免疫活性。
[结果]成功成功在大肠杆菌中表达的重组质粒pET-ORF7，融合蛋白是包含体的形式。
通过SDS-PAGE检测，根据期望，表达蛋白的分子量近似33kd。
BANDSCAN软件的分析表明，表达的融合蛋白为BL21（DE3）总细菌蛋白的约50％。
Western印迹和间接ELISA检测表明，肾上腺素可以特别是与PRRSV阳性血清反应，表明其良好的免疫活性。
[结论]该研究为制备PRRSV单克隆抗体和诊断试剂盒奠定了基础。
【总页数】7页(P62-67,72)【作者】张永富;布日额;李明刚;张婷;刘永宏;马明;张秋雨;韩春华;林健;刘月焕;韦海涛;祝俊杰;赵景义;李栋梁;马国文【作者单位】内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽,028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽,028000;北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司,北京,100043;内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽,028000;内蒙古农业大学动物科学与医学学院,内蒙古呼和浩特,010018;中国农业大学动物医学院,北京,100094;北京庄笛浩禾生物医学科技有限公司,北京,100043;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京,100097;北京市畜牧兽医总站,北京,100107;北京市畜牧兽医总站,北京,100107;北京市畜牧兽医总站,北京,100107;北京市畜牧兽医总站,北京,100107;内蒙古民族大学动物科技学院,内蒙古通辽,028000【正文语种】中文【中图分类】S8因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达
猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因的克隆及高效表达许立华;芦银华;胡志华;苏鑫铭;苏春霞;陈溥言【期刊名称】《中国病毒学》【年(卷),期】2003(018)003【摘要】本试验参照GenBank公布的Porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)VR2332株的核苷酸序列,设计并合成了一对引物,应用RT-PCR方法扩增出了PRRSV的核衣壳蛋白基因(N基因).在对N基因及pET32a 载体双酶切后进行连接,构建了高效原核表达载体pETN.将pETN重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌后,对培养条件及诱导表达条件(IPTG最佳浓度、作用时间)等影响表达的因素进行优化,实现了PRRSV核衣壳蛋白基因的高效表达.【总页数】4页(P279-282)【作者】许立华;芦银华;胡志华;苏鑫铭;苏春霞;陈溥言【作者单位】南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;宁夏大学农学院动物科学系,宁夏,银川,750105;南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095;西北农林科技大学,陕西,杨凌,712100;南京农业大学农业部畜禽疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏,南京,210095【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆、高效表达与鉴定 [J], 张秀云;吴斌;肇慧君;贾赟;刘霞;张瑞2.猪源新城疫病毒HN基因的克隆及序列分析 [J], 郑腾;程龙飞;张俊明3.鸡支气管炎病毒N基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达 [J], 周建杰;马文富;项勋;段纲;代飞燕;常华4.猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪圆环病毒2型共感染猪组织中猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原的分布 [J], 李燕华;郭鑫;杨汉春;盖新娜;陈艳红;查振林5.猪流感病毒与繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、圆环病毒、伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌混合感染的情况调查 [J], 覃绍敏;梁安莉;王仰杰;向晖;黄红梅;陈凤莲;马玲;吴健敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析
猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析马朝志;肖少波;宁娟;江云波;方六荣;陈焕春【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2007(28)6【摘要】根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.【总页数】4页(P1-4)【作者】马朝志;肖少波;宁娟;江云波;方六荣;陈焕春【作者单位】华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室农业微生物学国家重点实验室,湖北武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6;Q785【相关文献】1.猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株结构蛋白基因的克隆及结构特征分析 [J], 马友记;柳纪省;张利2.猪繁殖与呼吸综合征病毒FJ07A株的分离及其结构蛋白基因的序列分析 [J], 王隆柏;庄向生;魏宏;车勇良;陈如敬;吴学敏;周伦江3.猪繁殖与呼吸综合征病毒SCMS株MN蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 袁孟伟;颜其贵;郭万柱4.猪流感病毒H1N1亚型天津分离株核蛋白、基质蛋白、非结构蛋白基因克隆与序列分析 [J], 孙英峰;鄢明华;路超;李秀丽;张莉;韩伟;任卫科;田向学5.猪生殖-呼吸道综合征病毒CH-1a株结构蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 童光志;仇华吉;周彦君;郭宝清;张绍杰;王柳;蔡雪晖;刘宝全因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
辽宁省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株ORF_(5-7)基因遗传变异分析
中国动物检疫２００７年第２４卷第３期猪繁殖与呼吸综合征（ＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎ－ｄｒｏｍｅ；ＰＲＲＳ）属套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属的成员，该病毒在生物学特性、结构和遗传性上与马动脉炎病毒（ＥＡＶ）、小鼠乳酸脱氢酶病毒（ＬＤＶ）及猴出血热病毒（ＳＨＦＶ）密切相关［１，２，３，４，７］主要引起妊娠母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道疾病及免疫抑制和持续性感染。
１９８７年美国首先报道了该病的发生，随后加拿大、德国、荷兰等国家及地区也相继爆发了该病［５］。
１９９０年底在荷兰的Ｌｅｌｙｓｔａｄ首次分离到病原，并命名为Ｌｅｌｙｓｔａｄｖｉｒｕｓ，简称ＬＶ［６］。
１９９２年美国也分离到病毒，命名为ＡＴＣＣＶＲ－２３３２毒株。
１９９６年郭宝清在国内首次报道分离到ＰＲＲＳＶ，证实我国大陆也存在此病［７］。
猪繁殖与呼吸综合病毒（ＰＲＲＳＶ）基因组全长约１５Ｋｂ，单股正链ＲＮＡ，含有８个开放阅读框（ＯＲＦ）：ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、ＯＲＦ７，是病毒的主要结构蛋白，其中，ＯＲＦ５变异最大，可诱导机体产生中和抗体，ＯＲＦ６和ＯＲＦ７相对保守。
ＯＲＦ５６７国内研究相对较少。
通过对辽宁省站送检病料的分离测序，分析分离株核苷酸和氨基酸的同源性，进而分析该地区猪繁殖与呼吸综合征发病原因，流行趋势，为今后该地区预防和控制ＰＲＲＳＶ提供理论数据。
１材料与方法１．１病料由辽宁动物防疫站按照国家流行病学中心的要求采集病料并送检。
１．２主要试剂ＴｒｉｚｏｌＬＳＲｅａｇｅｎｔ为美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司产品；反转录酶（ＡＭＶ）、ＲＮＡ酶抑制剂（ＨＰＲＩ）、ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、ｒＴａｑ酶、ｄＮＴＰ、ｐＭＤ１８－Ｔ载体克隆试剂盒、ＢａｍＨⅠ及ＨｉｎｄⅢ限制性内切酶均为Ｔａｋａｒａ公司产品；ＵＮＩＱ－１０柱式ＤＮＡ胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；ＤＨ５$大肠杆菌由中国动物卫生与流行病学中心保存。
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#论著# 5株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7全长基因的克隆及序列分析*贾怀杰1,2,景志忠1,2**,房永祥2,王晓霞2,陈国华2,李克斌1,2,窦永喜2,瞿惠玲1,2,3,杨孝朴1**(1.甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;2.中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部兽医公共卫生重点实验室,甘肃兰州730046;3.甘肃省兽医局,甘肃兰州730030)=摘要>目的通过测定5株猪繁殖与呼吸综合征病毒(P RRSV)O RF7基因序列,结合G enBank登录的国内外P RRSV分离株核苷酸序列,分析P RRSV核衣壳蛋白(N蛋白)的遗传变异情况。
方法根据GenBank公布的PRRSV A T CCVR-2332株全基因组核苷酸序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出3株PRR SV甘肃流行株(命名为GSZY、GSBY、GSZY株)、1株陕西流行株(命名为Shanx i株)和1株PRRSV江西分离株(命名为Jingx i株)的ORF7全长基因,克隆到pGEM-T Easy载体,然后分别测定插入的核苷酸序列。
应用DN A Star序列分析软件对所测O RF7基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与不同来源的13个P RRSV毒株进行同源性比较。
结果5株PRR SV ORF7基因与以A T CC VR-2332为代表的早期引发PR RS的美洲型毒株的核苷酸序列间的同源性为91.9%~94.3%,与国内其他PRR SV分离株的同源性为98.7%~99.7%,与欧洲型代表株L V的同源性为57.7%~58.2%。
结论美洲型PRRSV N蛋白氨基酸发生了变异,但国内毒株相对保守。
=关键词>PRRSV;地方毒株;O RF7;基因克隆;变异分析=中图分类号>S852.65=文献标识码>A=文章编号>1673-5234(2009)08-0561-06[J our nal of Pathogen B iology.2009A ug;4(8):561-566.]C loning and phylogenetic analysis of the ORF7full length gene of four strains of Porcine reproductive and respiration syndromeJIA H ua-i jie1,2,JING Zh-i zhong1,2,FANG Yong-x iang2,WANG Xiao-xia2,CH EN Guo-hua2,LI Ke-bin1,2,DOU Yong-x i2,QU H u-i ling1,2,3,YAN G Xiao-pu1(1.V eter inary College of Gansu A gr icultur al U-niv er sity,L anz hou730070,China;2.S tate K ey L abor ator y of V eter inar y E tiolo gical Biology,L anz hou Veter inar y Res ear ch I nstitute,CA A S,K ey L abor ato ry of Veter inar y Public H ealth of M inistr y of A gr icultur e,L anz hou730046, China;3.V eter inar y Bureau of Gansu Pr ovince,L anz hou730030,China)=Abstract>Objective T he objectiv e of this study was t o analyze the g enetic var iation of the nucleocapsid protein(N pr o-tein)in Po rcine Reproductive and Respir ator y Sy ndro me V irus(PR RSV)in China by clo ning and sequencing the O RF7 gene of5PPR SV strains and comparing it t o other PR RSV epidemic str ains in GenBank.Methods O ne pa ir of primer s was desig ned accor ding to the published full genome sequence of the A T CC V R-2332stra in in G enBank;the OR F7full length g ene o f three G ansu epidemic strains(named GSZY,G SBY,and GSL Z st rains),one Shanx i epidemic str ain (named the Shanx i stra in),and one Jiang xi epidemic str ain(named the Jiang xi strain)w ere amplified by RT-PCR.T he PCR product s w ere cloned into a pGEM-T Easy v ect or,and recombinant v ecto rs w ere co nstr ucted and then sequenced.M ultiple sequences of O RF7g ene nucleotides and amino acids w ere co mpar ed with those o f13P RRSV str ains and ana-lyzed using D NA Sta r so ftwar e.Results Results indicated that the O RF7g ene shar ed91.9%-94.3%homo log y of nu-cleo tides w it h an A merican virus(AT CC V R-2332str ain),w hich caused the v ariat ion of PRR S in the ear ly stag es,while shar ed98.7%-99.7%homolog y w ith other epidemic strains in China,and57.7%-58.2%homo log y w ith a Euro peanst rain(L V strain).Conclusion Results show ed t hat ther e is var iatio n in the N protein(amino)acid(sequence)of the Amer ican str ain but that it is relatively conserv ed among st rains in China.=Key words>PR RSV;epidemic str ain;O RF7;g ene cloning;variatio n analy sis猪繁殖与呼吸障碍综合征(porcine repro ductive and respiration syndr ome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine repr oductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种高度传染性疾病,1987年首先暴发于美国[1],1991年Wensvo ot***=基金项目>国家自然科学基金项目(No.30871884);国家支撑计划项目(No.2006BAD31B03);甘肃省支撑计划项目(No. 0804NKCA076)。
=通讯作者>景志忠E-m ail:zh izhongj@杨孝朴E-m ail:yangxpu@=作者简介>贾怀杰(1980-),男,甘肃临夏人,硕士研究生,主要从事病原与宿主分子生物学与免疫学研究。
等[2]报道在荷兰分离培养获得PRRSV,并定名为Lely sted病毒(LV)。
随后德国、美国、英国也分离到该病毒。
1996年郭宝清等[3]首次从国内疑似PRRS 病例中分离到PRRSV,从而证实了本病在我国的存在。
目前该病已遍及北美洲及欧洲,在全球范围内传播,亚太地区也呈蔓延之势,日本、韩国、菲律宾及我国台湾地区等均有疫情报道。
PRRS给世界养猪业造成巨大损失,严重阻碍了养猪业的发展。
国际兽医局(OIE)已将其列为B类传染病,我国也将其列为二类传染病。
PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属,是正链单股RNA病毒,基因组长约15kb,包括8个开放读码框(ORFs)。
病毒的主要结构蛋白包括:25ku GP5囊膜糖蛋白(或称E蛋白)、18~19ku M膜蛋白及15ku的核衣壳N蛋白。
这3种结构蛋白分别由ORF5、ORF6和ORF7编码[4,5]。
ORF7编码的核衣壳N蛋白具有很强的免疫原性,感染猪的免疫应答首先是针对N蛋白,已证明在PRRSV不同分离株的N 蛋白上至少有1个共同的抗原表位[6,7],但目前尚未发现N蛋白与诱导机体的免疫保护反应的关系。
我中国目前已分离到多株PRRSV,并对其生物学特性、血清学特点及分子生物学等作了初步研究。
本试验通过对PRRSV地方流行毒株(甘肃、江西和陕西毒株)的ORF7基因进行克隆和测序,并与GenBank发表的部分PRRSV ORF7基因序列及其所编码的蛋白进行变异分析,探讨国内近年暴发PRRS 的可能原因,预测不同地方流行PRRSV毒株的类型,为科学预防该病提供参考依据。
材料与方法1病料及菌株PRRSV Jiangx i株由家畜疫病病原生物学国家重点实验室分离,-70e保存。
PRRS病料(猪的脾、肾、淋巴结、血液等)取自甘肃张掖、白银、兰州和陕西杨凌等地5个猪场共15份,-70e保存备用。
2试剂和宿主菌Trizo l提取试剂盒购自Invitr ogen公司;Impro-ÒT M Rev er se Tr anscription System、pGEM-T Easy 载体购自Pr omega公司;PCR试剂盒(包括TaqDNA 聚合酶、dNTP Mix-ture、10@Taq Buffer)、限制性内切酶EcoRÑ、DL2000DNA marker购自大连TaKaRa 公司;氨苄青霉素(Amp)购自A mresco公司;DMEM 为Gibco公司产品;DNA胶回收和质粒提取试剂盒购自博大泰恒公司。