培养方法及胎牛血清浓度对人胎儿成纤维细胞体外生长的影响
《2024年人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良》范文
《人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良》篇一一、引言人早孕绒毛细胞滋养层细胞（hTERT）是研究早期胚胎发育、胎盘形成以及妊娠并发症等领域的重要研究对象。
然而，传统的hTERT细胞培养方法存在诸多不足，如培养周期长、细胞生长缓慢、污染风险高等问题。
为了解决这些问题，本文提出了一种改良的人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法，旨在提高培养效率、降低污染风险。
二、材料与方法1. 材料实验所需的主要材料包括：hTERT细胞、培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、抗生素等。
所有材料均需符合实验要求，且无污染、无杂质。
2. 方法（1）细胞复苏与传代采用快速冷冻法复苏hTERT细胞，以缩短复苏时间并降低污染风险。
在传代过程中，优化胰蛋白酶的浓度和作用时间，以提高细胞消化效率。
（2）培养基改良在原有培养基的基础上，添加适量的生长因子、细胞因子和微量元素，以满足hTERT细胞的生长需求，促进细胞快速生长。
（3）污染控制在操作过程中，严格遵守无菌操作规程，减少污染风险。
同时，定期对培养基、器皿等材料进行灭菌处理。
三、实验方法与步骤1. 细胞复苏将冷冻的hTERT细胞迅速放入37℃水浴中，轻轻摇动使其尽快融化。
将融化的细胞悬浮液转移到离心管中，加入适量培养基，离心后弃去上清液，重新悬浮细胞。
2. 细胞传代当细胞生长至80%~90%汇合度时，用胰蛋白酶消化细胞。
优化胰蛋白酶的浓度和作用时间，使细胞消化更为彻底。
将消化后的细胞重新悬浮于新鲜培养基中，进行传代。
3. 培养基改良在原有培养基中添加适量的生长因子、细胞因子和微量元素，使培养基更符合hTERT细胞的生长需求。
将改良后的培养基与原始培养基进行对比实验，观察细胞的生长情况和形态变化。
4. 污染控制在实验过程中，严格遵守无菌操作规程，减少污染风险。
定期对实验室环境进行消毒，对培养基、器皿等材料进行灭菌处理。
同时，定期检查细胞的生长状态，及时发现并处理污染问题。
四、结果与讨论1. 实验结果通过对比实验，发现改良后的培养方法在提高hTERT细胞的生长速度和产量方面具有显著优势。
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞细胞培养方法
原代星形胶质细胞（primary astrocytes）是从胶质细胞含量较高的组织（如大脑皮层）中分离得到的。
其细胞培养方法如下：
1. 将新鲜脑组织剖出，用积聚素/液体软膜法（trypsin/liquid membrane method）进行酶解，使得细胞可以分离开来。
2. 使用无菌生理盐水或DMEM/F12将细胞悬液进行洗涤，然后放置在含有足够营养物质的培养基中，如DMEM。
3. 放置的培养皿需放置在37摄氏度、5% CO2和95%空气的恒温箱内，以提供最适宜的环境和养分。
4. 在培养初期，需要添加适当比例的血清（如胎牛血清），以提供必要的生长因子以及细胞所需的其它营养物质。
但在细胞数目增长到一定规模后，可将血清浓度逐步降低，以避免胎牛血清对实验结果的影响。
5. 定期更换培养基，以保证细胞在最佳的生长状态。
6. 如需进行实验或操作，需要将细胞从培养皿中移入滴定皿或其它相应容器中，并按照操作所需加入相应的药物或物质。
注意事项：
1. 在操作过程中需要尽可能避免对细胞的机械损伤，比如抽吸和强烈摇动。
2. 在移入滴定皿或其它操作容器时，需要注意细胞的密度，以避免过于稀疏或过于密集。
3. 在更换培养基、加药等操作时，需要十分温和，以避免对细胞造成伤害或死亡。
牛胎儿皮肤成纤维细胞体外培养及其特性研究
胞 ， 究其 细胞特性 ， 研 为相关研 究奠 定试验 基础 。
１ 材 料 与 方 法
面 。在培 养箱 中放置 ４ｈ后 加 ４ｍＬ培 养基置 于培 养 箱 中继 续培养 。 ］ 方法 ２ 分 离单 细胞 培 养 法 ： 无菌 的组 织 块 ： 将 剪 碎 至糊 状 ，转入 离心 管 中加 ０２ ． ５％胰 白酶溶 液
收 稿 １ ：０ ８ ０ — ８ ３期 ２ ０ － ４ ０
中 。再在 各瓶 补 加培 养 液 至 ４ｍ ，置 ３ ５％ Ｌ ７ｃ Ｃ、 Ｃ 饱 和湿度 的 Ｃ Ｏ、 Ｏ 培养箱 中继续 培养 。
１ ． 细 胞计 数及 生长 曲线 的绘 制 ：传至 ４代 的 ．４ ２
接 近汇合 牛胎 儿皮 肤成 纤维 细胞 ３瓶 ，分 别消 化 收取 细胞 。将 所得 细胞 转入 ５ ０ｍＬ离 心管 混匀 并 进行 细胞计 数 ， 释悬液调 整细胞 浓度 为 ４７ ｘ ０ 稀 ． ｌ４ ５ 个／ ， 种 于 ２ ｍＬ 接 ４孔 培养 板 中 ， ３ ５％Ｃ 于 ７ｃ ｃ、 Ｏ、 饱 和湿度 的 Ｃ ！ 养 箱 中培 养 ：每 次消化 收集 并 Ｏ培 计数 ３个孔 的细胞 数 ， 计算 记录平 均值
哺 乳 动物 乃 至人 的各 种 细胞 系和 细胞 株 的建 立 ，
摘要： 该试 验研 究 了牛胎 儿皮肤 成纤 维细胞
的分 离、 养 、 培 纯化 方 法及 其 生 长特征 。牛
胎 儿 皮 肤 细 胞 贴 壁 传 代 ２ ４次 ， 可 成 功 获 ～ 得 均 一稳 定 的 成 纤维 细胞 群 体 。取 传 至 ４ 代 的 牛 胎 儿 皮 肤 成 纤 维 细 胞 进 行 细 胞 计 数 ， 绘 制其 生长 曲线。 并
干细胞培养与增殖技术的方法总结
干细胞培养与增殖技术的方法总结干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的特殊细胞，它们可以分化成各种类型的细胞，并且可以进行长期的自我更新。
在医学和生物科学领域，干细胞研究具有广泛的应用潜力，可以用于组织再生、疾病治疗和药物筛选等。
干细胞培养与增殖技术是研究干细胞的重要手段之一，本文将对干细胞培养和增殖的常用方法进行总结。
1. 体外培养方法体外培养是最常用的干细胞培养和增殖方法之一，它可以在控制的实验室环境中培养和扩增干细胞。
体外培养方法的关键是提供合适的培养基和生长因子，以模拟体内条件，促进干细胞的增殖和分化。
（1）基础培养基：常用的基础培养基包括DMEM（Dulbecco's modified Eagle's medium）和RPMI-1640（Roswell Park Memorial Institute-1640），它们含有必需的营养物质，提供细胞生长所需的能量和基础物质。
（2）补充物和生长因子：补充物和生长因子是体外培养中的重要组分，可以促进干细胞的增殖和分化。
常用的补充物包括胎牛血清、人源血清或人工合成的化学物质，如血清替代物和蛋白质因子。
常用的生长因子包括胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。
（3）培养条件的优化：培养温度、CO2浓度和氧气浓度等培养条件的优化对于干细胞的增殖和存活至关重要。
例如，培养的温度通常为37摄氏度，CO2浓度为5％，氧气浓度可以根据不同类型的干细胞进行调节。
2. 无血清培养方法体外培养的传统方法通常使用胎牛血清作为培养基的重要组分，但血清来源和质量的不稳定性限制了其在临床应用中的发展。
无血清培养方法的出现解决了这个问题，可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化潜能。
（1）人源血清：与胎牛血清相比，人源血清能更好地满足临床应用的要求，能够减少动物源血清带来的潜在问题。
人源血清可以通过血浆分离、血小板富集等方法获得，但其使用成本高昂，并且仍然存在一定的批次不稳定性。
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法
一种鸡胚胎成纤维细胞体外三维培养和分离的方法1. 从鸡胚体内收集成纤维细胞：使用灭菌的工具和培养介质，从鸡胚体内收集成纤维细胞。
2. 细胞培养基的制备：制备适宜的细胞培养基，比如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium），其中包含适当的营养物质和补充物。
3. 细胞培养底物处理：在培养器中涂覆适宜的细胞培养底物，比如胶原蛋白、明胶或聚二甲基丙烯酸甲酯（PDMA）等。
4. 细胞预处理：将收集到的鸡胚胎成纤维细胞在预处理培养基中预处理一段时间，以提高细胞的存活率和增殖速度。
5. 细胞接种：将经过预处理的细胞接种至培养器中的培养底物上，使细胞附着并形成单层或多层细胞。
6. 体外三维培养的创建：将培养器中的细胞培养至一定程度，使细胞形成三维结构，如球状或纺锤状。
7. 细胞增殖和细胞养护：提供适宜的培养条件，包括合适的培养基、温度、湿度和氧气含量，以促进细胞增殖和维持细胞的健康状态。
8. 培养基的更换：定期更换培养基，以排除废弃物和维持细胞的正常功能。
9. 细胞监测和分析：使用显微镜和其他细胞学技术，定期监测和分析培养器中的细胞状态、数量和生长速度。
10. 细胞传代：当细胞达到一定密度时，可以进行细胞传代，将细胞分离、稀释并重新接种，以维持细胞的健康状态和继续培养。
11. 细胞分离：使用适当的消化酶（如胰蛋白酶）或细胞分离缓冲液，将三维细胞结构分离为单个细胞。
12. 细胞计数：使用细胞计数仪或显微镜，对分离的细胞进行计数，以确定细胞的数量。
13. 细胞检测：采用细胞培养板或微孔板等细胞培养容器，将分离的细胞均匀地分配在不同孔或区域上，以进行后续的细胞检测和分析。
14. 细胞培养条件的优化：在细胞分离过程中，根据不同实验目的，优化培养条件，如培养基的配方、温度、湿度和氧气含量等。
15. 细胞培养的存活率和生长速度的分析：通过计算存活细胞的比例和细胞增殖速率，评估细胞培养的效果。
人成纤维细胞的体外分离、纯化培养及细胞鉴定
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中国老年学杂志 2012 年 3 月第 32 卷
化学染色，细胞质中有棕色颗粒。成纤维细胞的标志物 Vimen- tin 为阳性，证明提取细胞为成纤维细胞。见 细胞培养第 2 天； c： 细胞培养第 12 天细胞生长呈鱼群状； d： 细胞培养第 14 天，细胞生长呈漩涡状
5 Keisuke T，Jin H，Taranova O，et al. Generation of insulin-secreting isletlike clusters from human skin fibroblasts〔J〕. Science，2008； 283 （ 46 ） ： 31601-7.
2结果 2. 1 成纤维细胞分离、纯化及培养 通过酶消化法及贴壁筛 选法，成功分离出人成纤维细胞。 2. 2 形态学观察 倒置显微镜观察细胞形态，接种第 2 天可 见细胞散在生长，分布不均的单个贴壁细胞呈梭形，成纤维细 胞样。待细胞培养 10 ～ 14 d 时，细胞生长已达 80% ～ 90% ，呈 鱼群样或漩涡状排列。见图 1。 2. 3 细胞 HE 染色 成纤维细胞的形态呈梭形，也可见大多 角形和扁平星形等。核仁明显，核呈椭圆形，可见 1 ～ 2 个核 仁，胞体较大，胞质弱嗜碱性，染色质疏松着色浅。当细胞汇流 时，呈鱼群样或漩涡状排列，细胞在 15 代内形态保持不变，经 HE 染色可以更清楚地观察到这些表现。见图 2。 2. 4 细胞免疫组化结果 对第 6 代成纤维细胞进行免疫细胞
人 成 纤 维 细 胞 的 体 外 分 离 、纯 化 培 养 及 细 胞 鉴 定
王玲玲1 马 峰2 张玉成 杜珍武 张桂珍 （ 吉林大学中日联谊医院中心研究室，吉林 长春 130033）
〔摘 要〕 目的 对人皮肤成纤维细胞进行分离、纯化、培养及细胞鉴定，探讨一种高效的分离及纯化方法，为细胞移植提供种子细胞。方法 使用酶消化法原代提取人成纤维细胞，快速贴壁法纯化细胞，对细胞进行形态学观察、HE 染色，免疫细胞化学鉴定细胞标志物 Vimentin。结果 利 用倒置显微镜及 HE 染色，可见细胞为散在分布的梭形贴壁细胞，当细胞汇流时，呈鱼群样或漩涡状排列，且细胞在 15 代内形态保持不变。结论 成 功地发现快速提取成人成纤维细胞的方法，为成人自体细胞移植的研究奠定了基础。
牛血清在细胞培养中的作用
一、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。
1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5.起酸碱度缓冲液作用。
6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
二、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
1.蛋白质是牛血清中主要成份。
除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。
与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。
三、牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。
异种动物血清对体外培养人肿瘤细胞生长的影响
异种动物血清对体外培养人肿瘤细胞生长的影响赵秀梅;冯文茹;胡人杰【摘要】目的观察不同种属来源和浓度的动物血清对体外培养的肿瘤细胞(A549、MCF-7、BGC-823)生长的影响.探讨血清药理实验中血清供体动物的选择及血清添加量的问题.方法设置5种血清(牛、人、兔、大鼠、小鼠)及血清量(10%、20%、40%、60%、80%)的培养体系,用MTT法检测细胞增殖情况.结果不同种属来源的动物血清对肿瘤细胞生长的影响作用各不相同.从总的趋势来看,牛血清更适宜人肿瘤细胞生长,小鼠血清适应性最差.且随着加入量的增加,大多数血清会对肿瘤细胞的生长产生负效应.结论在肿瘤血清药理学试验中,为排除血清本身带给试验的干扰,应测定正常动物血清对肿瘤细胞增殖的影响,且血清添加量以小于20%为宜.【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2010(020)006【总页数】4页(P35-38)【关键词】血清;细胞;MTT【作者】赵秀梅;冯文茹;胡人杰【作者单位】天津市医药科学研究所,天津,300020;天津市医药科学研究所,天津,300020;天津市医药科学研究所,天津,300020【正文语种】中文【中图分类】R965血清是细胞培养中最常用的添加成分，它是一种复杂的混合物，其中含有很多细胞生长所必需的营养成分和细胞因子。
它不仅可以影响细胞的分化，而且对细胞的增殖也具有重要的意义。
近年来随着血清药理学工作的广泛开展，除牛血清之外其他种属动物来源的血清也开始出现在细胞培养体系中。
这就提出了一个问题，不同种属的动物血清对于细胞的生长是否有不同的影响。
有研究发现，Beagle犬血清与胎牛血清对体外培养人肺癌细胞QG－56的生长无显著性差异［1］。
也有研究表明，在细胞培养体系中，不同种属动物血清对细胞生长的影响似与其种属亲缘有关，亲缘越接近的血清越适于该细胞生长［2］。
我们结合当前开展的肿瘤血清药理学试验工作，观察了不同种属来源的动物血清对体外培养的人肿瘤细胞生长的影响，以期为今后的研究工作提供实验依据。
细胞原代培养实验报告
细胞原代培养实验报告引言原代培养是一种将从组织或器官中分离得到的细胞进行体外培养的方法。
它具有重要的科研和临床应用价值。
本实验报告将详细介绍细胞原代培养的步骤、影响因素以及常见问题的解决办法，以及对细胞培养实验的观察结果和分析。
材料与方法1. 实验所用细胞系我们选择了小鼠胚胎纤维细胞（MEF）作为实验所用细胞系。
MEF细胞具有较强的增殖能力和较长的寿命，非常适合原代培养实验。
2. 原代细胞培养基的配制与消毒配制原代细胞培养基的主要成分有： - DMEM培养基 - 胎牛血清（FBS） - 青霉素/链霉素（Penicillin-Streptomycin）配制原始培养基时要进行严格的消毒操作，以防止细菌和真菌的污染。
3. 细胞分离与传代分离过程1.取出小鼠胚胎。
2.将小鼠胚胎置于无菌PBS中，去除头部和内脏。
3.将净化后的胚胎置于细胞培养基中。
4.用无菌耐热胶管切成碎片，使其均匀分散。
5.加入细胞培养基中的胞外消化液。
6.重复离心和去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
7.加入预暖的细胞培养基，充分悬浮细胞。
8.继续离心、去除上清液操作，直到胞外消化液变清为止。
传代过程1.收集上述分离得到的细胞悬液。
2.用血细胞计数板计数细胞数目。
3.计算倍增比例，将细胞悬液按比例加入新鲜的细胞培养基中。
4.转移至新的细胞培养瓶中，继续培养。
4. 影响细胞培养的因素4.1 培养基的质量培养基中的成分质量直接影响到细胞的生长和增殖能力。
优质的培养基会提供细胞所需的营养物质和生长因子。
4.2 培养条件的控制细胞的生长需要适宜的培养条件，如适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度。
同时，细胞培养过程中需要定期更换培养基，以保持培养环境的稳定性。
4.3 质量检测与细胞鉴定在细胞培养的过程中，定期进行培养基的质量检测和细胞的鉴定非常重要。
常用的质量检测方法包括菌落计数法和PCR方法。
结果与讨论1. 细胞形态观察在细胞原代培养的过程中，我们进行了细胞形态的观察。
胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响
论著 文章编号:100025404(2003)0120004203胎牛血清对人胚胎神经干细胞分化的影响李 巍,李成仁,蔡文琴,姚忠祥 (第三军医大学基础医学部组织学与胚胎学教研室,重庆400038) 提 要:目的 探索胎牛血清对人神经干细胞(NSCs)的影响。
方法 采用细胞培养、免疫组化、流式细胞仪检测的方法,观察了不同浓度胎牛血清对人NSC分化的影响。
结果 胎牛血清促进人NSC分化为神经系统的主要的3种细胞(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞),且培养基中胎牛血清浓度为15%时,人NSC分化为星形胶质细胞的数量占80%～90%。
结论 胎牛血清影响人NSC分化为神经元和神经胶质细胞的比例,并与胎牛血清的浓度有一定的关系。
关键词:神经干细胞;胎牛血清;人 中图法分类号:R392.7;R329.28;R322.8 文献标识码:AE ffects of fetal bovine serum on differentiation of human fetal neural stem cells in vitro LI Wei,LI Cheng2ren,C AI Wen2qin,Y AO Zhong2xiang(Department of Histology and Embry ology,Third M ilitary Medical University, Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o observe the effects of fetal bovine serum(F BS)on differentiation of human neural stem cells(NSCs).Methods The effects of F BS with different concentrations on differentiation of human fetal NSCs were observed by cell culture,immunocytochemistry and flow cytometry.Re sults Human fetal NSCs could be induced to differentiate mainly three types of nerve system cells(neuron,astrocyte and olig odentrocyte).There were 80%～90%astrocytes of differentiated cells from human fetal NSCs with the concentration of15%F BS induced.Conclusion C oncentration2dependent F BS in culture medium may have effect on the ratio of neurons to glial cells differentiated from human NSCs in vitro. K ey w ords:neural stem cell;fetal bovine serum;human 随着神经干细胞的分离、培养成功,探索神经干细胞的增殖、分化机制,成为人们关注的焦点。
不同浓度的重组人碱性成纤维细胞生长因子对离体人表皮细胞增殖的影响
１ Ｂ ｓ ｅｔｒ ＤＡ， ｌｋｅ ａ ｋ ｔｅ Ｂａｉｉ Ｌ， ａｍａ Ｒ ｅ ａ． Ｕｓ ｏ ｈ ｌｃ ｌ Ｄｅ ｒ ｎ Ｊ，ｔ １ ｅ ｆ ｔｅ ｏ ａ
ｌｍｐ ｎ ｄ ａｓｙ ｏ ｔ ｓｉ ｔ ｎ ｆ ｒｌｔ ｅ ｃ ｎａ ｔａｌｒ ｙ ｈ ｏ ｅ ｓａ ｆｒ ｈｅ ｅ ｔ ｍａｉ ｏ ｅａｉ ｏ ｔｃ ｌ — ｏ ｖ ｅ ｇ ｎｅｐ ｔｎ ｙ Ｃｏ ｔｃ ｒ ｔｔ ， ０ ０， ２ ３ ４ ３ ８ ｅ ｉ ｏｅ ｃ ． ｎ ａ ｔ Ｄｅ ｍａｉｓ ２ ０ ４ ： ４ — ４ ． ｉ ２ Ｌ ｖ ｌｓ Ｅ， ａ ｉｓＧＳ， ｒｅｉｋ ＧＦ，ｔａ． Ｆ ｒｈ ｒｅ ａｕ ｔｏ ｏ ｅｅ ｓＳ Ｌ ｋｅ Ｇｅｂ ｒ ｅ ｅ １ ｕｔｅ ｖ ｌａｉｎ ｏ ｏ ａ ｙ ｈ ｎ ｄ ｓａ ｎ ｔｅ ｆ ａ ｈ ｓ ｆａ ｎｅｎ ｔ ｎ ｌ ｆｌｃ ｌｌｍｐ ｏ ｅａ ｓｙ ｉ ｈ ｎ ｌｐ ａｅ ｏ ｎ ｉｔｒ ａｉ ａ ｉ ｏ
建。 完成再上皮化的关键 。 在临床实践中应用创面外用药物
的时 候，不同浓度的药物对创 面修复细胞 的影响完全不 同。
如何通过调控创面上外用药物 的浓度 ， 以达到根据创面实际 抑制或促进某种创面修复 细胞 的增殖与表达 ， 是我们的重要
课题 。 ｔ Ｆ Ｆ是一种 多效能的细胞生长因子 ．它广泛作用于 ． Ｇ １ 卜ｂ 中胚层和神经外胚层来源 的组织和细胞 ， 是创伤愈合和上皮 形成的重要调节物【 ｈｂ Ｇ 是利用 Ｄ Ａ重组技术 ， ２ —Ｆ Ｆ ］ 。ｒ Ｎ 用生物
体 的琥珀酸脱氢酶还原பைடு நூலகம்难溶 的蓝 紫色结 晶物 ， 而死细胞无
此功 能 ． 这种结 晶物可被 Ｄ Ｏ溶 解 ， 酶联 免疫测试仪 在 ＭＳ 用 ４ ０Ｆ ９ Ｂ处测定其 以值 ． Ｉ 可间接地反应活细胞 的数量 ， 在一定 细胞数范周内 ． Ｔ结晶物形成 的量与活细胞数成 正比。据 ＭＴ 此可 以用于细胞数 目的测 定 ， 但在实验中应注意每孔的接种 细胞 数和培养时间 ， 以保 证培养终 止时细胞不致过满 ， 这样
不同血清浓度对大鼠软骨细胞增殖、形态和基因表达的影响
不同血清浓度对大鼠软骨细胞增殖、形态和基因表达的影响刘丽芳;薛艳;郑昱新;曹月龙;丁道芳【摘要】目的观察不同血清浓度对大鼠软骨细胞体外培养的形态、增殖和基因表达的调控作用.方法取出生24h SD大鼠关节处软骨,0.1％浓度的Ⅱ型胶原酶多次消化后获得软骨细胞.软骨细胞培养于含5％胎牛血清(fetal bovineserum,FBS),10％ FBS和20％ FBS的DMEM低糖培养基中,分别为5FBS组,10FBS组和20FBS组.24h后镜下观察细胞形态变化,CCK8方法检测24、48和72h软骨细胞增殖.Western blot法检测软骨指标Ⅱ型胶原A1(COL2A1)和MMP13(matrix metalloproteinases13)表达,定量PCR检测软骨特异性基因Sox9、A-can、ADAMTS5、MMP9和MMP3的表达及代谢相关基因Nme2和PnP表达.结果 5FBS组的软骨细胞呈由鹅卵石样排列,10FBS组和20FBS组细胞呈现长梭形改变,且血清浓度越大,形态改变越明显.和5FBS组比较,10FBS组和20FBS组细胞增殖明显,呈血清浓度依赖性增加.10FBS组和20FBS组的MMP13表达显著上调,Ⅱ型胶原表达显著下调.PCR结果表明,和5FSB组比较,10FBS组和20FBS组的A-can和Sox9表达下降,MMP9、MMP3和ADAMTS5表达上调,且基因表达变化和血清浓度改变呈正相关.同时随着血清浓度增加,Nme2和PnP表达显著上调.结论血清浓度的增高促进软骨细胞代谢,引起软骨细胞退变.【期刊名称】《医学研究杂志》【年(卷),期】2018(047)009【总页数】6页(P53-57,33)【关键词】血清浓度;软骨细胞;细胞增殖;形态改变;营养状态【作者】刘丽芳;薛艳;郑昱新;曹月龙;丁道芳【作者单位】200240 上海交通大学;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所;201203 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心;201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所【正文语种】中文【中图分类】R332关节炎在我国的总发生率约为13%，其中以骨关节炎(osteoarthritis，OA)为最常见，发生随年龄增加而上升。
人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
人成纤维细胞的原代培养方法及步骤
材料准备
成纤维细胞
人成纤维细胞完全培养基
实验步骤
水浴锅37℃预热。
完全培养基温浴到37℃。
在15mL离心管中加入5mL以上完全培养基备用。
从-80℃冰箱中取出细胞，放入37℃水浴锅中，快速晃动，使冻存液迅速融化。
注意融化过程必须晃动冻存管，保证冻存液融化迅速、均匀；且晃动时应避免水没过管盖造成污染；管内冻存液融化至只剩一个约2mm直径的冰晶时，即停止水浴。
继续晃动冻存管，至冰晶融化。
用75%医用酒精擦拭冻存管外表面。
在超净台中打开冻存管，用巴氏吸管或移液枪吸取细胞冻存悬液，转移至先前准备的离心管中。
用1mL完全培养基洗涤冻存管1次，收集残留细胞，减少损失。
细胞悬液以250×g，离心4min。
离心后去除上清。
加入2mL完全培养基，轻柔吹打细胞沉淀，充分吹散、混匀。
将细胞接种到1个T25培养瓶或底面积相当的培养容器中。
加入足量完全培养基，1个T25培养瓶中培养基总量不少于5 mL。
摇匀细胞，放入37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中。
注意接种2h内不可移动、观察细胞。
这会严重影响细胞贴壁，造成状态不佳、细胞聚团、贴壁不均匀等情况。
复苏次日，观察细胞状态，并更换新鲜的完全培养基或传代。
之后，每2天更换一次完全培养基，直到细胞生长至90%汇合，即需传代。
通常用人成纤维细胞传代比例为1:3，72h内生长至可传代汇合度。
请根据细胞实际生长情况调整传代比例。
不同来源胶原蛋白对人真皮成纤维细胞生长的影响
·26·药品评价 Drug Evaluation 2021,18（01）1.2 实验试剂DMEM 高糖培养基（GE 有限公司）；胰蛋白酶（Solarbio 有限公司）；青霉素、链霉素（…Solarbio 有限公司）；胎牛血清（Invitrogen 有限公司）；四氮甲唑蓝（…MTT，北京索莱宝科技有限公司）；SDS、异丁醇、盐酸均试剂均为AR 级（国药试剂）；人真皮成纤维细胞株（HDF-a 细胞，中科院上海细胞库，…Lot.…No…13056）。
1.3 实验仪器3111细胞培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）；成纤维细胞（Fibroblasts）是皮肤真皮层构成中最常见的细胞，其作为一种修复细胞可以合成及分泌胶原、细胞外基质和生长因子，在创伤修复、愈合、收缩中起着极其重要的作用［1-3］。
皮肤损伤创面的临床治疗方法选择，一直是研究的热点内容。
根据以往文献报道，胶原蛋白在皮肤烧伤的修复、治疗和护理中能发挥重要的作用，其能有效地改善伤口烧伤的程度,并起到预防感染的效果［4-6］。
本研究运用体外培养人真皮肤成纤维细胞，观察不同来源的胶原蛋白对成纤维细胞生长干预的影响，对各胶原蛋白生物活性进行考察，为进一步研究胶原蛋白提供了基础［7-10］。
1 材料与方法1.1 实验材料不同厂家来源胶原蛋白粉、弹性蛋白、复合弹性蛋白、玫瑰花粉、鲑鱼蛋白粉共12种，具体编号见表1。
不同来源胶原蛋白对人真皮成纤维细胞生长的影响罗德威1，欧阳辉1，黄光春21.江西中医药大学，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西……南昌…330045；2.南昌傲凡良品科技有限公司，江西......南昌 (331799)［摘要］目的：探讨不同来源胶原蛋白对体外培养人真皮成纤维细胞（HDF-a 细胞）生长的影响。
方法：用不同浓度、不同来源胶原蛋白的培养基培养HDF-a 细胞，考察样品对体外HDF-a 细胞生长的影响。
结果：12批不同来源胶原蛋白中，4批样品能抑制HDF-a 细胞生长，其他8批样品则能促进HDF-a 细胞的生长。
双碟制备的实验报告
一、实验目的1. 学习并掌握双碟制备的原理和方法。
2. 了解双碟在细胞培养过程中的应用。
3. 掌握细胞培养的基本操作。
二、实验原理双碟制备是一种细胞培养方法，其原理是将细胞接种于两个培养皿中，通过比较两个培养皿中细胞的生长情况，观察不同条件对细胞生长的影响。
该方法常用于细胞毒性实验、药物筛选等研究。
三、实验材料1. 细胞：小鼠成纤维细胞。
2. 培养基：DMEM培养基（含10%胎牛血清）。
3. 培养皿：直径为60mm的培养皿。
4. 移液器：200μl、1000μl。
5. 吸管：10ml、1ml。
6. 生理盐水。
7. 灭菌棉签。
8. 消毒剂。
9. 酒精灯。
10. 恒温培养箱。
四、实验步骤1. 准备工作（1）将培养皿用消毒剂消毒，然后用灭菌棉签擦拭干净。
（2）将生理盐水加入培养皿中，浸泡5分钟，然后用酒精灯烤干。
（3）将DMEM培养基加温至37℃，待用。
2. 细胞接种（1）将小鼠成纤维细胞从培养箱中取出，用移液器将细胞悬液转移至培养皿中，使细胞均匀分布。
（2）将培养皿放入恒温培养箱中，37℃、5%CO2培养24小时。
3. 制备双碟（1）将细胞悬液分别转移至两个培养皿中，每个培养皿中接种等量的细胞。
（2）将一个培养皿作为对照组，另一个培养皿作为实验组，实验组加入一定浓度的药物。
4. 细胞培养（1）将两个培养皿放入恒温培养箱中，继续培养24小时。
（2）观察细胞生长情况，记录细胞数量、形态等。
5. 数据分析（1）计算两个培养皿中细胞的生长指数，即实验组与对照组细胞数量的比值。
（2）比较实验组与对照组的生长指数，分析药物对细胞生长的影响。
五、实验结果1. 对照组细胞生长良好，细胞数量和形态正常。
2. 实验组细胞生长受到抑制，细胞数量明显少于对照组，形态异常。
六、实验讨论1. 双碟制备方法在细胞培养实验中具有简便、直观、灵敏等优点。
2. 本实验结果表明，药物对细胞生长具有抑制作用，为后续研究药物作用机制提供了依据。
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信 阳 师 范 学 院学 报 ： 自然 科 学 版 第２ ６卷 第 ４期 ２ ０ １ ３年 １ ０月
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｘｉ ｎ ｙ ａ ｎ ｇ Ｎｏ ｒ ｍａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ
Ｎ ａ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｅ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｖｏ １ ． ２ ６ Ｎｏ ． ４ ０ｃ ｔ ． ２ ０１ ３
胞计 数． 结果表 明 ， 早期 由组织块培养法原代培 养获取的细胞形 态要 比单细胞培养 法原代培养获取的 细胞稍好
些， 且在 细胞 传代后极 少 出现无法贴壁 的死 细胞 ． Ｆ Ｂ Ｓ对 ｈ Ｆ Ｆ ｓ 生 长影响 比较 明显． 在 实际应用 中， 在体 积分数
８ ％Ｆ Ｂ Ｓ下 ， 采用组织块培养 法进行人 胎儿成纤 维细胞体 外培 养 ， 效果 良好． 关键词 ： 人胎 儿成纤维细胞 ； 单细胞培 养法； 组织块培 养法； 胎牛血清
（ 内蒙古科技大学 数 理与生物工程学 院 ， 内蒙古 包头 ０组织块培 养法从 原代培 养人胎 儿成 纤维细胞 ， 并在 不 同体 积 分数胎 牛血 清
（ Ｆ Ｂ Ｓ ） （ ０ ％、 ４ ％、 ８ ％、 １ ０ ％、 １ ２ ％） 的奈件 下观 察人胎儿成 纤维 细胞培 养的状 况并采 用 台盼蓝 染 色法进 行 活细
ＤＯＩ ： １ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ３ － ０ ９ ７ ２ ． ２ ０ １ ３ ． ０ ４ ． ０ １ ４
培 养 方 法 及 胎 牛 血 清 浓 度 对 人 胎 儿 成 纤 维 细 胞 体 外 生 长 的影 响
程 腾 ， 李佳 佳 ， 贺 小英 ， 刘 娟 ， 马利兵