QC-OP-008_v1 在鸡胚上进行新城疫病毒、禽流感病毒(H9)的灭活检验
一株鸭源H9亚型禽流感病毒在鸡胚上传代及繁殖规律的研究
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９ ・— ４ － — —
江苏农业科学
２０ ０ ６年第 ４期
一
株鸭源 Ｈ 亚型禽流感病毒在鸡胚上传代 ９ 及繁殖规律 的研究
李 银 ， 刘宇卓 张敬峰 沈永林 ， ，
（． １ 南京农业大学动物医学院 ， 江苏南京 ２ ０ ９ ； ． １０ ５ ２ 江苏省农业科学 院兽医研究所 ， 江苏南京 ２ ０ １ ） １ ０４
（ ３ 、（ ５ 、０ Ｅ ０ 、５ Ｅ ５ 代次 的毒种稀释 至不 同浓 度 ， Ｅ ）５ Ｅ ）１（ ｌ） １（ ｌ ） 接种 １ ０日龄 、 １日龄 Ｓ Ｆ鸡胚及 非免 疫鸡 胚 ， １ Ｐ 对 收获毒液量及血凝价 （ ） 病 毒含量（ Ｌ ） ＨＡ 、 Ｅ Ｄ 。 进行 比较 。同时对接种 １ 稀 释的第 ３代毒种死亡鸡胚 各组织所 ０ 含 病毒 的 Ｈ Ａ进行测定 。结果显示 ， Ｊ １株经传代 其平 均死亡 时 间为 ５ ６ ， Ａ为 ９—１ ｌｇ ； ３ Ｅ 、 ｌ 、 Ｎ０ ３— ４ ｈ Ｈ １ ｏ２ Ｅ 、５ Ｅ ０ Ｅ ５毒种的 Ｅ Ｄ０ ｌ Ｌ５ 分别为 １ ／ ． ｌ１ ／ ． ｌ１ ／ ． ｌ１ ／ ． ｌ将 Ｅ ０ ０ １ｍ 、０ 。０ １ｍ 、０ ＂ ０ １ 、０ ０ １ｍ ； ３毒种稀释至 １’ １ １ ｍ ０ 、０ 、０倍 接种鸡胚 ， 对病毒 繁殖收获 量有一定的影响 ， 平均 死亡时 间延 长 ， １ “稀 释后接 种 １ 经 ０ １日龄 Ｓ Ｆ鸡胚 的病 毒繁 Ｐ 殖 效果 最好 ； 死亡 鸡胚 以尿 囊液 和尿 囊膜 所 含病 毒 的 Ｈ Ａ最 高 ， ９—１ ｇ ， 、 及其 他 组织 ＨＡ较低 ， 达 ０ｌ ２肝 肺 ｏ 为
１～５ ｌ ｇ 。 ｏ２
关键词 ： 流感 ； ９ 禽 Ｈ 亚型 ； 病毒
梅里亚家禽产品说明
家禽活疫苗产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明家禽灭活疫苗产品名称作用与用途使用说明产品名称使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明产品名称作用与用途使用说明部分进口家禽疫苗产品产品名称成份及性状产品名称使用说明产品名称成份及性状使用说明冻克灵(RISPENS)鸡马立克氏病活疫苗（CVI988株）预防鸡马立克氏病1日龄雏鸡出壳后，尽快颈皮下注射接种立克灵(MAR-BLEN)鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒活疫苗（FC126株）预防鸡马立克氏病1日龄雏鸡出壳后，尽快颈皮下注射接种新威灵（AVINEW）鸡新城疫活疫苗（VG/GA 株）预防鸡新城疫可用于1日龄首免和2周龄后健康鸡群的补强免疫，可用喷雾、滴眼、饮水法免疫接种新倍灵（NEW-BLEN）新城疫活疫苗（La Sota株）预防鸡新城疫用于4日龄以上的健康鸡群，通过滴眼、饮水法接种新支灵（NB-BLEN）新城疫、传支二联活疫苗（La Sota株+B48株）预防鸡新城疫和传染性支气管炎用于4日龄以上的健康鸡群，通过滴眼或饮水法接种威支灵(AVIENW+H120）鸡新城疫、传支二联活疫苗（VG/GA株+H120株）预防鸡新城疫和传染性支气管炎可用于1日龄首免和2周龄后健康鸡群的补强免疫，可用喷雾、滴眼、饮水法免疫接种威力克（VAXXITEK）鸡传染性法氏囊病病毒火鸡疱疹病毒载体活疫苗（vHVT-013-69株）预防鸡法氏囊病和马立克氏病用于18-19日龄鸡胚胚内注射或1日龄雏鸡颈皮下免疫接种鸡马立克氏病I、III型二价活疫苗（CVI988株+FC126株）预防鸡马立克氏病1日龄雏鸡出壳后，尽快颈皮下注射接种高力优ND 鸡新城疫灭活疫苗（Ulster 2C株）用于预防鸡新城疫雏鸡在1-7日龄接种一次、0.15ml/羽，颈背皮下注射；5周后接种，0.3ml/羽，皮下或肌肉注射。
流感病毒的鸡胚培养,收获及血凝效价测定实验报告
篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
病毒灵说明书
病毒灵是一种什么药？病毒灵的药品通用名为“盐酸吗啉胍”。
这是个非常老的药，早在上个世纪50年代后期，该药以流感为主要适应证申请上市，1960年在欧洲上市[1]；在我国大约是上个世纪70年代上市的[2]。
由于该药上市的时间较早，其上市前研究的科学性受到医生们的怀疑[1]。
病毒灵确有抗病毒作用，上市后的一些文献显示，它可以用于治疗流感、皮肤病毒感染、水痘、手足口病等，但由于抗病毒的作用较弱，疗效较差，慢慢地临床上就很少用它了，近10年来几乎没有用它治疗病毒感染的文献报道。
但也有些治疗感冒的复方药物中加了吗啉胍（如：治感佳片），或做成滴眼液治疗病毒性眼病。
儿童能不能服用病毒灵？从药品说明书中看，有儿童剂量，儿童可以服用。
病毒灵每片100mg，成人剂量是每次服用200mg，每日3～4次；儿童剂量按体重计算，一日10mg/kg，分3次服用。
如果是一位5岁的儿童，大约18 kg，每日的总量为180mg，每次应服60mg。
所以，曝光的几家幼儿园给所有儿童每次服一片(100mg)，就算每天只服了一次，但一次的剂量肯定是超量了。
但是，这种超量对儿童的影响有多大，目前是不知道的。
厂家为什么还生产病毒灵？既然医生早就不用病毒灵了，厂家为什么还生产呢？实际上病毒灵在农业生产中有很大的作用。
蜜蜂用了病毒灵，可以防治蜜蜂囊虫病；可以治疗猪的伪狂犬病和蓝耳病，治疗鸡瘟、鸡痘等。
病毒灵还可以防治一些番茄、水稻、辣椒等植物的病毒感染。
但已经不用于人类的疾病治疗了。
病毒灵的副作用大不大？尽管药品说明书中说，该药可引起出汗、食欲不振及低血糖等反应，但从国内外文献来看，病毒灵的副作用很小。
检索pubmed医学文献数据库和reactions药物不良反应数据库，没有检索到严重的不良反应文献报道。
检索我国cnki医学期刊数据库，仅有5篇相关的不良反应报道。
但是，1例引起惊厥和1例导致扭转性痉挛的神经系统反应都发生在儿童。
使人放心的是，目前报道的这些不良反应都发生在服药期间，没有检索到对身体产生长期影响的不良反应。
禽流感(H9亚型)油乳剂灭活苗的研制
１ 疫 苗 安 全 性检 验 ． ５
动物实 验 。取 ６只 ４ ６ 龄鸡 ， 颈部皮下 接种 ～周 在 ０ ． ２毫升 制备 的油乳 剂灭 活 苗 ， 观察 ２ 天 ， 查 接种 １ 检 疫 苗 和鸡 的局 部及全 身反应 。
灭活 效果 检 查 。取 １ ０日龄 Ｓ Ｆ鸡 ６只 ， 只注 Ｐ 每
一
（ 石蜡 油 ） 吐 温 一 ０ 乳 化 剂 ， 要 为 聚 氧 已 稀失 和 ８（ 主
水 山梨醇脂 肪 酸脂 ） 。按 常规 方法 乳化 ， 成油 包水 制
型油乳 剂灭 活 疫苗 ， ４ ８Ｃ 置 ～ ￣保存 。
不 同接毒 量 对鸡 胚血 凝 活 性 的影 响 。为 了测 定 不 同接 毒量 对鸡 胚 繁殖病 毒 的影 响 ， 择 １ 、０３ 选 ０ １ － 、 ２ １ 一 １ 一 １ ｘ ０ 、０ 、 ０ ５个 滴度 。每胚接 种 ０２毫升 ， ． 收取接 毒 后 ４ ～ ６小时 死胚 的尿囊 液 ，测 定 红 细胞 凝集 效 ８９ 价 。另外 ， 以种 毒 １ ４ 释 液 ， 每 胚 ０１ 升 和 ０２ ０稀 按 ．毫 ． 毫升 ， 接 种 ５ 各 ０枚 鸡胚 ， 取 接 毒 后 ４ ～ ６小 时 死 收 ８９ 胚 的尿囊 液 ， 以红 细胞凝 集试验 测定 血凝 效价 。 接 毒孵 育 后 死 胚 和 活胚 的血 凝 价测 定 。 以 １ － ０３ 稀 释 的种 毒 ， 每胚 接 种 ０２毫 升 ， ． 收集 接 毒 后 ４ ６ ８ ９
一
１ 材 料 与 方 法
１ 制 备 用 种 毒 ． １
由哈兽研 提供 Ｈ ９亚型 低病 毒株 ， 毒 栋 的红 细 该
胞凝 集 试 验滴 度 为 １ ３ ０ １ ８ ， Ｉ ∞为 １－ ：２ ～ ０ Ｅ Ｄ ２ ０ 属 于 ８
禽流感H9亚型流行现状及控制策略
禽流感灭活疫苗（H9亚型，SD696株） 鸡新城疫、禽流感二联灭活疫苗（La Sota 株+N28株+SD696株）（即新双流） 禽流感(H5N2+H9N2)二价灭活疫苗(N28株 ＋SD696株)
维科生物
1、来源：ss株1994年分离
全
称
为
：
A/Chicken/Guangdong/SS/94 (H9N2)
(1)中度致病力：主要由MP AIV H9亚型在伴随有其 它病原的感染时引起的，死亡率变化范围较大 (5%~97%)，高致死率主要出现在肉仔鸡、青年 鸡、产蛋鸡或严重应激的鸡，蛋鸡易发生在产蛋 高峰，产蛋下降明显。产蛋下降的幅度与免疫情 况有关，没有注射疫苗的鸡群，产蛋下降30%， 甚至更高；注射过疫苗的鸡群，产蛋下降 10~30%。损伤主要发生在呼吸道、生殖道、肾 或胰腺，可能同时并发有细菌感染，细菌分泌的 蛋白酶裂解了MP AIV H9亚型的HA蛋白。
90%
75%
30%
15%
低致病性流感H9N2 +大肠杆菌3 大肠杆菌3
低致病性流感H9N2 +大肠杆菌4 大肠杆菌4
100%
73%
30%
20%
95%
50%
50%
25%
要特别注意的是： HA----------HA1+HA2
类胰蛋白酶 大肠杆菌 葡萄球菌
加强饲养管理
建立科学的饲养管理体系，包括科学的饲养管理 方式，根据禽的品种和日龄，选择合适的饲喂方 式，饲喂适宜的全价饲料，给予适宜的饲喂量， 避免营养不足，增强机体的抵抗力。禽群日常的 管理，如饲喂、清粪、清扫、消毒、转群、免疫 注射等操作要尽量减少对禽群的刺激，避免应激 的发生及诱发疾病。在整个饲养过程中，要注意 禽舍的通风换气和禽群的饲养密度。
新城疫的诊断和防控措施
随着养殖规模 的不 断 ， 群鸡养殖数量直线上升。 使得鸡新 城疫 的爆发更加 的频 繁 ， 感染情况越来 越严 重。 给养鸡 业造成 了严重危 害。为 了防治鸡新城疫 的流行 ，实现养殖业健康 发 展， 本文将从鸡新城疫 的病学原理 、 临床特征和有效 的防治 方 面进行行之有效 的介绍 ， 让更 多了人了解该病毒 。
感染 的可能性 。 ３ ． ２ 通过禽流感阳性血清和红细胞悬液的血凝抑制实验 ， 没有 出现血凝抑制反应现象， 说 明该病毒不是禽流感病毒 。 ３ ＿ ３ 通 过对新 城疫病毒 的检测 ， 采取血凝抑制 血清学对 新城疫病毒进行鉴定 ， 结果呈现 阳性。 说明该鸡被新城疫病毒 感染 ， 确定了鸡新城疫 的爆 发。在确定感染病毒后 ， 我们要进 行针对性 的防治措施。 。 ，
染， 没有死亡 。 ２ ． ２ 禽流感检测 ２ ． ２ ． １ 把脾研磨和生理盐水配 置成乳 剂 ， 制作 出抗原 ， 标 准 阳性血清为抗体 ， 和鸡 红细胞悬液进行血凝抑制实验 ， 没有 任何反应生成。 ’ ２ ． ２ ． ２ 分别 采集病鸡 的血液 ，采用琼脂 扩散法测试禽流 感 抗体 ， 检测结果为 阴性 。 ２ ． ３ 鸡新城疫检测 ２ ． ３ ． １ 采集 鸡呼吸分泌物或者是组织器 官 ，放入灭菌 的 生理盐 水中 ， 用研磨器提取 ２ ０ ％的悬液 ， 然后 用抗 生素杀灭组 织 液中的其他病菌 ， 收集纯净 的病菌 。 ２ ． ３ ． ２ 分离培养 ，然后将 收集好 的病 菌接种到无抗体 的 鸡 胚 中 进行 孵 化 ， 对胚胎进行观察记录 。 ２ ． ３ ＿ ３ 将 收集 到的鸡胚尿液进行血凝实验 ， 检测是否有血 凝活性 ，对于有血凝性份分离物应该使用标准 的新城疫 病毒 ， 采取血凝抑制血清学对新城疫病毒进行鉴定 ， 结果呈现阳性。
新城疫病毒检测方法的研究进展
新城疫病毒检测方法的研究进展作者：杨丽丽邹冬辉来源：《吉林农业》2015年第10期摘要：新城疫是由新城疫病毒（NDV）引发禽类的烈性、急性、高度接触性疾病，禽类感染NDV后的死亡率可达 100%，国际兽疫局（OIE）将其列为动物A 类疫病。
因此，对新城疫病毒进行简便、快速、准确的检测具有重要意义。
本文从病毒分离及鉴定、免疫血清学检测、分子生物学检测、量子点技术、荧光微球检测技术方面阐述了NDV检测技术进展，以期为临床和科研工作者提供一定的参考。
关键词：新城疫病毒；检测；进展中图分类号： S852.65 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/ki.jlny.2015.19.049NDV 在全球范围内分布广泛，上百种禽类对 NDV 可以实验室感染或自然感染，同时还有大量的其他种类动物疑似被感染[1]。
在1926 年新城疫首次在印度尼西亚的 Java[2]和英国的新城[3]暴发。
90年代后，该病在亚洲多个国家发生，给禽类养殖业带来了巨大损失。
因此，世界各国十分重视该病的发生和流行，NDV快速而准确的检测具有重要意义。
目前用于检测NDV的技术手段种类繁多，现主要介绍以下几种：1病毒的分离鉴定该方法诊断疫病确切，同时可定性感染的毒株。
通过将病毒接种SPF鸡胚的方法进行分离，应用血液凝集试验和血液凝集抑制试验对病毒进行鉴定。
该试验方法的准确性和敏感性高，重复性好，特异性强，但其存在高成本、长时间等不足之处，所以不适合该病的快速诊断。
2血清学技术2.1酶联免疫吸附试验（ELISA）酶联免疫吸附试验是通过物理方法将抗原或抗体吸附在固相载体上，然后测定免疫酶。
该方法是目前研究最多最广泛的一门技术方法，其优点主要是程序自动化，可快速获取结果，花费少。
卢建红[4] 、吴长新[5]、陈昌海[6]、吴红专[7]、蒋凤英[8]等建立了多种ELISA方法对新城疫病毒的检测。
研究结果显示了该项技术高度的特异性和敏感性、安全、便捷、快速。
禽流感病毒RT-PCR试验方法
二水乙二铵四乙酸二钠
18.61 g
灭菌双蒸水
80 mL
氢氧化钠
调 pH 至 8.0
灭菌双蒸水 A.5.2 TAE 电泳缓冲液(50×)配制
加至 100 mL
羟基甲基氨基甲烷(Tris)
242 g
冰乙酸
57.1 mL
0.5mol/L 乙二铵四乙酸二钠溶液(Ph8.0)
100 mL
灭菌双蒸水 用时用灭菌双蒸水稀释使用 A.6 溴化乙锭（EB）溶液
蜡(约 20μL)。循环参数为 95℃5 min，94℃ 45 sec，52℃ 45 sec，72℃ 45 sec，循环 30 次，
72℃延伸 6 min 结束。设立阳性对照和阴性对照。
5.5 电泳
5.5.1 制备 1.0%琼脂糖凝胶板，见附录 A.4。
5.5.2 取 5 μL PCR 产物与 0.5µL 加样缓冲液混合，加入琼脂糖凝胶板的加样孔中。
附录 A （规范性附录） 相关试剂的配制 A.1 变性液 4M 异硫氰酸胍 25mM 柠檬酸钠.2H2O， 0.5%（m/V） 十二烷基肌酸钠 0.1M β-巯基乙醇 具体配制：将 250g 异硫氰酸胍、0.75M（ PH7.0）柠檬酸钠 17.6ml 和 26.4ml 10%（m/V） 十二烷基肌酸钠溶 293ml 水中。65℃条件下搅拌、混匀，直至完全溶解。室温条件下保存， 每次临用前按每 50ml 变性液加入 14.4 mol/L 的β-巯基乙醇 0.36ml 的剂量加入。变性液可 在室温下避光保存数月。
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款，凡是注日期的引用文件，其 随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标 准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最 新版本适用于本标准。
一例蛋鸡J亚群禽白血病的诊断
一例蛋鸡J亚群禽白血病的诊断作者：周戈储涛来源：《中国动物保健》2023年第11期摘要：2020年9月12日，安康岚皋某鸡场12月龄蛋鸡出现食欲不振、精神沉郁、贫血、极度消瘦、产蛋率下降等症状。
观察畜主带过来的饲料样品，未发现有霉变的情况，求诊之前没有使用過药物，由此排除了中毒等原因造成蛋鸡出现此症状的可能性；观察临床症状并结合实验室病理剖检结果初步怀疑蛋鸡死亡是由于细菌感染或病毒感染所引起的。
为了找出蛋鸡死亡的确切原因，实验室运用细菌分离技术以及分子生物学诊断方法进行病原鉴定，最后确诊为J亚群禽白血病病毒感染。
关键词：蛋鸡；病原鉴定；ALV-J禽白血病病毒（Avian Leukosis Viruses，ALV）是一类主要引起禽类各种造血细胞肿瘤性增生为特征的反转录病毒群[1]。
该病病毒群根据病毒囊膜糖蛋白的抗原差异性、病毒干扰实验、宿主范围和基因组的分子生物学等特征，总共分为10个亚群，被命名为A亚群至J亚群。
其中A、B、C、D亚群为外源性病毒，能够诱发肿瘤性新生物；E、F、G、H、I亚群为内源性病毒，没有致瘤性；J亚群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus，ALV-J）具有其他亚群的所有特性，同时也表现出自身独特性，其传播性和致病性均比其它亚群强。
近几年国内出现的禽白血病感染病例主要以J亚群病毒感染为主[2]。
禽白血病的传播方式有两种，即水平传播、垂直传播[3]。
水平传播的途径是直接接触。
除了直接接触传染外；间接方式也可以导致传染。
垂直传播的途径是从带有禽白血病的种鸡场引种，从而孵化出的鸡苗带毒。
发病蛋鸡主要表现为食欲不振、贫血、极度消瘦、产蛋率下降等症状；剖检后可发现极度消瘦，龙骨发育不全，全身性贫血，增生型的特征性肉眼病变是肝、脾、肾呈弥漫性肿大；而且鸡胚也发生病变。
该病可以抑制机体免疫系统的表达，能引起鸡多种具有传染性的良性和恶性肿瘤，其高死亡率和淘汰率给养鸡业造成了巨大的经济损失。
禽流感综合防控
没 的 地 方 投 放 毒 鼠 药 消 灭 老 鼠。 定 前 只有禽流感重组鸡痘病 毒载体活 期 清 扫 鸡 粪 ，清 出 的 鸡 粪 在 发 酵 池 疫 苗 （ 亚 型 ） 新 城 疫 、 禽 流 感 Ｈ５ 和
内堆积发酵 。
做好 引种 和育 雏工 作 。引进 的鸡 苗 或 种 蛋 应 来 自无 禽 流 感 国家 或 地 区 的 健 康 鸡 群 。购 入 的禽 类 需 经 过 兽 医 检 疫 部 门 的 检 疫 合 格 ，并 经 隔 离 观 察 ２ ，再 经 补 免 、 消毒 和 驱 １ ｄ 虫 后 ，确 认 无 传 染 病 时 方 可 并 群 饲
的 Ｈ５ 亚型禽流感病毒株引起的禽流 疫 苗 （Ｌ Ｈ５株 ） 该 疫 苗免 疫 后 町 ｒ－ 。
感 ， 在全 国范 围 内用于 各种 禽类 。 可
２ ．重 组 禽 流 感 病 毒 灭 活 疲 苗 同时 产 生 细 胞 免 疫 、 体 液 免 疫 和 黏
流感病毒 突破重重防线进入养禽场 ，
可 采 用 滴 鼻 、 点 眼 、肌 注 、 费雾 或
膜 免 疫 ， 有 新 城 疫 活 毒 的 生 长特 具 性 。 由于 只是 禽 流 感 病 毒 ＨＡ基 因 的 片 段 插 入 到 了新 城 疫 病 毒 之 中 ， 因此 该病 毒 不 会 出 现 与 自然 界 中 禽 流 感病 毒发 生 重组 而 变强 的现 象 。
该 疫苗 免疫 后产 生免 疫保 护时 较 灭 活疫 苗快 ， 且 用 ｆ肉鸡 免 疫 ， 而
苗 ，对于防控禽 流感具有十分 重要 ＮＡ 基 因 来 源 于 Ｇ ／ Ｄ ９ 株 ， Ｓ Ｇ ／６ 内
意义。
部 基 因来源 于 Ｐ Ｒ８株 。
（ 一）目前应用的禽流感疫苗种
鸡新城疫的实验室诊断及鉴别
鸡新城疫的实验室诊断及鉴别鸡新城疫又被称为亚洲鸡瘟，其病原为新城疫病毒，该病传染性很强，具有很高的发病率以及死亡率。
鸡只患病后，常常出现无法正常呼吸、严重下痢以及神经症状，对其进行剖检，可以看到病鸡消化道内存在呈弥漫性的溃疡或者点状出血。
当前，主要结合临床症状以及病理变化对该病进行初步诊断，要想对该病进行确诊，还需依靠实验室诊断工作。
1 实验室诊断1.1病毒分离病鸡表现出相关临床症状以后，其绝大多数器官以及分泌物中已经存在大量的病毒。
病鸡脑、肺、脾以及呼吸道分泌物均可作为病毒分离的材料。
如果死鸡已经发生了腐败，应当从骨髓分离病毒。
在实际诊断过程中，最好采用接种孵化9-10天的鸡胚来分离病毒。
在无菌条件下提取病料，采用生理盐水将病料稀释10倍或者20倍制为悬浮液，采用离心机离心后取上清液，加入300-500IU/ml的青霉素或者100-300μg/ml的链霉素，接着在0-4℃的环境中放置4h或者在37℃的环境中放置1h。
提取0.1ml上述清液并将其接种于鸡胚尿囊腔中。
如果病毒为强毒株，仅仅2-3天即可将鸡胚杀死；如果病毒为弱毒株，通常需要4-6天来杀死鸡胚。
每天需要对鸡胚进行检查，在此过程中一旦发现死亡，需要立即收集尿囊液以开展细菌检查、血凝试验以及血凝抑制试验。
为了加快诊断的速度，也可以在鸡胚死亡之前，采用注射器将尿液吸出以开展检查工作，接着将鸡胚放入温箱进行孵化，通常接种36h后即可检测出血凝素。
1.2 血凝抑制试验如果抗鸡新城疫血清能够对可疑病毒对红细胞所产生的凝集作用进行有效抑制，即可将该病毒判定为鸡新城疫病毒[1]。
另外，可以通过鸡新城疫病毒判断病愈鸡血清内是否存在能够对红细胞凝集进行抑制的抗体，从而诊断出病鸡是否感染了新城疫。
如果可疑病鸡其血清能够对新城疫病毒对血红细胞的凝集作用进行有效抑制，即可确定该鸡曾经患有新城疫。
通常情况下，对于急性病鸡，在其死亡之前血液中往往不存在抗体，如果病程能够达到5-6天，病鸡血液中级存在血凝抑制抗体；如果病程超过了10天，其抗体效价甚至可以达到1：1280。
蛋鸡产蛋期感染低致病性禽流感H9诊断和治疗措施
中国动物保健2020.081低致病性禽流感（H9N2）流行现状1.1病毒毒力逐渐增强自2007年以来，低致病性禽流感H9N2流行毒株的毒力呈现逐渐增强的蛋鸡产蛋期感染低致病性禽流感H9诊断和治疗措施孙海龙，魏四风，程祥琴，罗冠群（洛阳惠中生物技术有限公司 河南洛阳 471000）年来中科基因诊断中心有限公司及国内大专院校和检测公司对家禽疫病进行连续监测结果显示：目前影响家禽的主要传染病为病毒性疾病，占总监测结果的85%左右。
其中禽流感、传染性支气管炎病、传染性喉气管炎病、新城疫和腺病毒成为重点的传染病。
低致病性禽流感H9N2流行范围最广泛，带来的经济损失最大。
因此对低致病性禽流感H9N2的预防已成为家禽养殖业的重点关注问题。
蛋期；低致病性禽流感；诊断；治疗趋势。
2007年以前用流行毒株接种SPF 鸡胚，鸡胚在72h 内100%存活，2008年72h 鸡胚存活率50%，2011年72h 鸡胚存活率只有11%，2012年以后，72h 鸡胚存活率只有0%，表明分离的流行毒株的毒力在逐渐增强。
1.2混合感染在增加H9N2亚型禽流感病毒可引起严重的免疫抑制，从而导致其他病原体的感染。
目前出现与一种或多种病毒及细菌的混合感染，如与新城疫、传染性支气管炎及大肠杆菌等，引起高死亡率。
1.3传统经典疫苗毒株保护有差异洛阳中科基因检测诊断中心有限公司对近三年来分离的近200个禽流感H9N2流行毒株进行分子生物学分析及核苷酸同源性分析，结果显示：流行毒株的核苷酸同源性在90.5%～100.0%，同源性较高。
但与早期的经典疫苗毒株的核苷酸同源性只有87.1%～93.9%。
这些结果或许也从另一方面解释了为何目前免疫鸡群中AIV 检出率较高的原因。
1.4发病无明显的季节性禽流感一般在秋冬季和春季高发，但近年来发病呈现无季节性的规律（图1）。
北京某知名公司对蛋鸡连续监测结果显示，禽流感H9在商品蛋鸡的流行趋势呈现一年四季均可发生。
禽流感病毒和新城疫病毒的检测方案
禽流感病毒和新城疫病毒的检测方案实验目的对实验室送检样品进行禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）的检测及鉴定。
实验原理（1）AIV和NDV均能凝集鸡红细胞，可先使用血清学实验进行初步鉴定，即用已知标准抗体即可检测未知的病毒抗原.（2）通过分子生物学实验技术（RT-PCR）做进一步的检测鉴定，AIV 和NDV均为单股副链RNA病毒，故提取得到的病毒核酸需先进行反转录再PCR扩增。
（一）样品处理及病毒分离1.1 实验试剂100,000 IU的双抗（青霉素和链霉素）。
1.2 试验设备及材料设备：低温离心机，冰箱，孵化培养箱，超净台，照蛋器。
材料：移液枪，灭菌吸管，9～11日龄非免疫鸡胚（最好使用SPF鸡胚），1 mL注射器，石蜡，铅笔，打孔器，酒精灯，酒精棉，镊子。
1.3 操作步骤（1）样品的处理：向样品中加入双抗使终浓度为10000 IU～20000 IU，4℃冰箱作用至少2 h，4℃ 8000～10000 rpm离心15 min。
（2）接胚：取上清液接种9～11日龄非免疫鸡胚，采用尿囊腔接种，0.2～0.3mL/胚，每个样品接种2～3枚鸡胚。
弃去24h内死亡的鸡胚，48 h内死亡的鸡胚及时置于4℃冰箱至少4 h，于超净台内收胚测血凝（若同一份样品的两个鸡胚均无血凝，可将两个鸡胚尿囊液收为1管）。
（3）将第一次收取的鸡胚尿囊液同样的方法继续接胚，直至第三代，若均无血凝，则结果可判为禽流感和新城疫感染阴性；若有血凝，则继续做HI试验，可初步鉴定为禽流感或者新城疫感染。
1.4 注意事项：接胚及收胚过程中避免污染。
（二）血凝抑制试验（HI）2.1 试验设备及材料器材：离心机、记号笔、酒精灯、100P量程的移液枪、200uL枪头、排枪、排枪枪头、96孔V形血凝反应板。
试剂：pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）、1%鸡红细胞悬液、新城疫病毒抗原。
2.2 操作步骤（1）取96孔V形微量反应板，用排枪1至12孔每孔加0.025 mL PBS；（3）吸取0.025 mL 病毒悬液加入第一孔中，吹打8次至10次充分混匀；（3）从第一孔中取0.025 mL 混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入到第3孔，依次进行系列倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取0.025 mL弃之，设第12孔为PBS对照；（4）每孔加入0.025 mL的1%的鸡红细胞悬液；（5）震荡混匀反应混合液，室温下静置15 min后观察结果，PBS对照孔的红细胞成明显的纽扣状沉到孔底时判定结果。
禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定
禽流感病毒(H9亚型)流行毒株的分离及初步鉴定李凤艳【摘要】对2013～2015年从各省养鸡场采集的口腔及泄殖腔拭子进行病毒分离,用血凝及血凝抑制试验初步鉴定出含H9亚型禽流感病毒的样品,对其进行纯化得到4株H9亚型禽流感病毒,用针对H9亚型禽流感病毒HA基因的特异性引物对分离株进行RT-PCR扩增,分别获得特异性目的片段后进行测序分析,结果显示4个分离株经鉴定均为H9亚型禽流感病毒.对4个分离株的生物学特性进行研究,发现4株H9亚型禽流感病毒分离株均符合低致病禽流感病毒的特点.【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2017(000)008【总页数】6页(P11-16)【关键词】H9亚型禽流感病毒;分离鉴定;生物学特性【作者】李凤艳【作者单位】辽宁益康生物股份有限公司,辽宁辽阳111000【正文语种】中文【中图分类】S858.28禽流行性感冒，简称禽流感（Avian lnflucnza，AI），是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）、流感病毒属、A型流感病毒所引起的一种禽类传染病，OIE根据对家禽所造成的疾病程度，禽流感被分为高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（lowlypathogenic avian influenza virus， LPAIV）。
H9亚型AIV属于LPAIV，是家禽中最常见的病毒之一。
H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[1]。
此后H9亚型的禽流感病毒也从许国国家的家禽和水禽中分离到[2]。
H9N2亚型AIV在我国广泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势[3]。
多数携带该病毒的野禽、水禽、家禽并不表现出临床症状或仅表现轻微临床症状，一旦出现临床症状多表现为呼吸系统症状、蛋鸡产蛋下降、肉鸡生长迟缓等，是影响我国养禽业发展的重要病原。
因此，关注H9N2亚型AIV的研究具有普遍的公共卫生意义。
禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立
禽流感（avian influenza ，AI ）是由正粘病毒科、流感病毒属A 型流感病毒引起的禽类（家禽或野禽，以及部分哺乳动物）传染病[1]。
禽流感病毒血清亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业的一大毁灭性疫病。
尤其是高致病性禽流感，是OIE 规定的法定报告A 类动物疫病[2]。
禽流感病毒在流行的过程中不断变异，跨越宿主屏障，H5N1亚型禽流感病毒和H7N9亚型禽流感病毒屡次暴发疫情，给养禽业和人类的生命安全带来巨大的威胁。
H9亚型禽流感病毒并未被规定为高致病性禽流感，往往被人们所忽视，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业产生持续危害。
此外，有研究显示H9N2亚型禽流感病毒在全世界范围内广泛传播的同时也以重配的方式产生新型禽流感病毒[3,4]。
目前国内外检测禽流感病毒最常用和经典的方法是鸡胚病毒分离，并且是国际贸易中指定的检测方法，但该方法技术要求高、耗费时间长，在疫情暴发时不利于病原的快速诊断和疫情控制。
以分子生物学技术为基础的荧光PCR 方法已成为病原核酸检测的主要方法，目前市场的禽流感病毒检测手段多以单重RT-PCR 为主，不能区分具体亚型，但在平时疫情检测和实施扑灭措施时对这些病毒亚型进行快速检测和定型非常重要。
本研究基于Taq-Man-MGB 荧光RT-PCR 技术建立一种禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR 检测方法，能够在一次反应中对样本中的病毒进行快速定型，满足准确、快速的检测需求。
1材料与方法1.1质粒样品携带禽流感病毒H5亚型、H7亚型、H9亚型HA2靶基因序列片段重组质粒pUC57-AIV-H579，浓度为104copies/μL 。
1.2禽流感病毒核酸样品禽流感病毒H5亚型核酸样品15份、禽流感病毒H7亚型核酸样品15份、禽流感病毒H9亚型核酸样品15份，禽流感病毒阴性核酸样本30份，由扬州大学禽流感病毒专业实验室分离、鉴定、保存和提供。
病毒的鸡胚培养法
• （一）实验目的
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• （二）实验原理
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• （三）实验器材
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• （四）实验方法
• 2021/3/29 星期一
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（一）实验目的
• 1.了解鸡胚培养有哪几种常用的接种方法。 • 2.掌握鸡胚尿囊腔接种培养鸡新城疫病毒的
操作技术。
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（二）实验原理
• 实验室培养病毒常使用动物接种和鸡胚培 养两种方法，而鸡胚培养更为常见。一般 而言，禽病毒病大部分可经鸡胚分离病毒， 其他动物病如犬瘟热也可经鸡胚分离病毒。
2021/3/29 星期一
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鸡胚的模式结构
1.卵壳 2.绒毛尿囊膜 3.尿囊腔
4.羊水腔 5.卵黄囊 6.鸡胚胎 7.卵白
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• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
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（五）实验作业
• 1.用鸡胚培养病毒，在选用鸡胚时应注意什 么问题？
• 2.绒毛尿囊腔内接种在培养和收毒过程中应 注意哪些问题？
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绒毛尿囊腔内接种 ★★
绒毛尿囊膜接种
羊膜腔接种
卵黄囊内接种
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绒毛尿囊膜接种
• 取10-12日龄的鸡胚，照 蛋选择血管较少的部位做 一记号，用磨蛋器磨一于 纵轴平行的裂痕，小心挑 开蛋壳，将白色的壳膜用 针尖小心挑破，不要伤及 血管丰富而透明的绒毛尿 囊膜，在气室顶端钻一小 孔，用滴管贴近小孔，轻 轻一吸，绒毛尿囊膜便下 陷成一小凹。
三种不同灭活方法对新城疫病毒血凝和RT－PCR试验结果的影响
三种不同灭活方法对新城疫病毒血凝和RT－PCR试验结果的影响陈羽琪;南文龙;秦立得;巩明霞;张悦勇;陈义平【摘要】为研究热灭活、甲醛、β－丙内酯（BPL）三种不同灭活方法对新城疫病毒（NDV）血凝和RT －PCR 试验结果的影响，将收获的 NDV 鸡胚尿囊液分别用浓度为0．1％～0．5％的甲醛37℃灭活24 h 或4℃灭活48 h、浓度为0．02％～0．2％的BPL 37℃灭活9 h、60℃热灭活30～90 min，并于灭活前后进行血凝试验和 RT －PCR 检测。
结果表明，用0．02％的 BPL 37℃灭活9 h 或0．1％的甲醛4℃灭活48 h，不影响 NDV 的血凝价；采用热灭活30 min 或0．02％的BPL 37℃灭活9 h，不影响 NDV 核酸检测。
本研究可为相关病原检测以及诊断制品制备过程中灭活方法的选择提供参考。
%In order to investigate the influence of different inactivation methods on Newcastle disease virus (NDV)hemagglutinin (HA)test and RT -PCR assay,viral suspensions were inactivated by 0.1% ~0.5%formaldehyde for 37 ℃24 h and 4 ℃ 48 h,0.02% ~0.2%β-propiolactone (BPL)for 37 ℃ 9 h and 60 ℃water bath for 30 ~90 min,respectively.Then the suspensions were detected by HA test and RT -PCR assay. The results showed that the optimal inactivation conditions for HA were 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h or 0.1%formaldehyde at 4 ℃ for 48 h;for RT -PCR were 60 ℃ water bath for 30 min or 0.02% BPL at 37 ℃ for 9 h. This study provided suggestions for the selection of appropriate inactivation methods,which were used in detecting related pathogens and preparing diagnostic reagents.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2016(050)009【总页数】4页(P11-14)【关键词】新城疫病毒;灭活;血凝;RT-PCR【作者】陈羽琪;南文龙;秦立得;巩明霞;张悦勇;陈义平【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛 266032;西交利物浦大学生物科学系，江苏苏州 215123;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛 266032;中国动物卫生与流行病学中心诊断试剂研究室，山东青岛 266032【正文语种】中文【中图分类】S852.65在动物疫病检测时，为确保生物安全，常需对临床样品或分离培养的病原微生物进行灭活处理。
新支流法规程标准[整理版]
![新支流法规程标准[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/bae8217f7f21af45b307e87101f69e314332fa97.png)
0000鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）、传染性法氏囊病四联灭活疫苗（La Sota株+M41株+YBF003株+S-VP2蛋白）00 0制造及检验试行规程(草案)00本品系用鸡新城疫病毒La Sota株、传染性支气管炎病毒M41株、H9亚型禽流感病毒YBF003株分别接种易感鸡胚培养、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活；鸡传染性法氏囊病毒系用表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）经过发酵培养、诱导表达、菌体破碎、离心去除菌体碎片、提纯、灭活残留细菌；将四种抗原按适当比例混合后加入优质油佐剂，混合乳化制成。
用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感和传染性法氏囊病。
0001 毒种001.1 毒种来源制造本品用的鸡新城疫病毒La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株）、鸡传染性支气管炎病毒M41株、传染性法氏囊病病毒BC6-85株（CVCC AV7株）均购于中国兽医药品监察所，由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保管和供应；鸡传染性法氏囊病生产用菌种为表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌，菌株名称为 E.coli BL21/pET28a-VP2（简称S-VP2蛋白）、A型禽流感病毒（H9亚型）A/Chicken/shandong/11/05（H9N2）株（简称YBF003株），由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保存和供应。
001.2 毒（菌）种标准0001.2.1 鸡新城疫病毒La Sota株应符合下列标准0001.2.1.1 对鸡脑内致病指数（ICPI）应为0.1～0.4。
0001.2.1.2 对鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT/MLD）应为103～119小时。
0001.2.1.3 对鸡胚的毒力将毒种用灭菌生理盐水作100倍稀释，尿囊腔内接种10日龄SPF鸡胚10个，每胚0.1ml，置36～37℃继续孵育，鸡胚应于接种后24～120小时死亡7个，胎儿须有明显充血、出血病痕。
肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定
肉鸽H9亚型禽流感的诊断与病毒分离及鉴定罗青平;汪辉;张蓉蓉;温国元;王红琳;邵华斌【摘要】通过分子PCR检测,初步证明在湖北一发病肉鸽群感染H9亚型禽流感病毒.病原分离后,盲传3代,其血凝效价达到109～10H,经生物学特性进行测定,其鸡胚半数致死量为1075,9日龄鸡胚平均致死时间为54.3 h,1日龄雏鸡脑内接种致病指数为1.8,6周龄小鸡静脉接种致病指数为2.0,证明该H9亚型禽流感为毒力较强.将该病毒回归非免疫肉鸽,能产生典型的H9亚型禽流感症状,采集其肺、喉头、泄殖腔等病变组织进行病毒分离,均可分离到H9亚型AIV.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】3页(P2170-2172)【关键词】肉鸽;H9亚型禽流感病毒;分离【作者】罗青平;汪辉;张蓉蓉;温国元;王红琳;邵华斌【作者单位】湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064;湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/湖北省动物胚胎及分子育种重点实验室,430064【正文语种】中文【中图分类】S836H9亚型禽流感（Avian influenza，AI）是持续危害中国及世界养禽业发展的重要禽类传染病之一。
禽类感染H9亚型禽流感病毒后，常表现为呼吸道疾病、产蛋量降低、急性死亡等多种形式［1］。
虽然对禽的致病率低，但可引起生产性能下降，造成免疫抑制，因而在普遍存在复合感染的情况下，对养禽业造成的经济损失也很大。
同时H9N2亚型禽流感病毒还可感染人，提供内部序列与H5N1亚型禽流感病毒重组；并且具有人流感病毒的受体结合位点［2］，因此研究H9N2亚型AI的病原及防控对养禽业持续健康发展具有重要意义。
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1. 历史记录:2. 需要发放的部门:质量部（QA），质检部（QC）摘要目录1. 目的32. 原理33. 材料34. 方法4 4.1.第一代灭活检验44.1.1. 准备样品44.1.2. 准备蛋胚44.1.3. 蛋胚接种44.1.3.1. 阴性对照54.1.3.2. 样品54.1.3.3. 阳性对照54.1.4. 鸡胚孵化54.1.5. 收获第一代蛋胚尿囊液54.1.6. 读结果6 4.2.第二代灭活实验74.2.1. 准备蛋胚74.2.2. 蛋胚接种84.2.3. 蛋胚孵化84.2.4. 读结果85. 结果8 5.1.如果满足下面条件该检验有效：85.2.如果满足下面条件该检验结果合格：86. 相关文件87. 附件81.目的描述在SPF鸡胚上检验样品中新城疫病毒、禽流感病毒（H9）是否被灭活彻底的方法。
2.原理将活的新城疫/禽流感病毒（H9）接种到鸡胚尿囊液里后，能使尿囊液里产生血凝素。
如果接种后不能使囊液里产生血凝素，那么证明被检病毒已被完全灭活。
3.材料-9 - 11日龄SPF鸡胚-样品-标准新城疫活病毒-标准禽流感活病毒（H9）-超净工作台-37.5 ℃ ± 0.5 ℃孵箱，相对湿度60% - 70%- 5 ℃ ± 3 ℃冰箱--30 ℃ ± 3 ℃冷柜-闹钟-照蛋器-蛋钻-碘酊棉球-振荡器-灯-鸡蛋盘-吸管泵-100 µl - 1000 µl 微量移液器-20 µl - 200 µl 微量移液器-试管架-无菌剪刀-玻璃平板-1000 µl滴头盒-200 µl滴头盒-0.9%生理盐水，含有1%的抗生素- 2.5%青链霉素抗生素溶液-2% 红细胞悬液-10 ml无菌吸管- 1.0 ml无菌注射器-15 ml无菌试管-1000 µl无菌滴头-200 µl滴头-蜡块-记号笔-标签纸-记录表格4.方法在两代中的任何一代，接种样品的鸡胚的死亡率都不能超过10%，如果超过了10%，需要重新进行检验。
4.1.第一代灭活检验接种的顺序是：●生理盐水●样品●标准新城疫/禽流感H9活病毒4.1.1.准备样品-样品保存在5 ℃ ± 3 ℃冰箱。
-取出样品放入超净工作台中并按5.0 ml样品加入5.5 μl抗生素的比例加入抗生素。
-标记样品：“已加抗生素”。
-在振荡器上充分混匀样品和抗生素。
样品已可以使用。
-样品准备好以后，若不立即进行检验，把样品储藏在5 ℃ ± 3 ℃冰箱里直到进行检验。
4.1.2.准备蛋胚-照9 ~ 11日龄的SPF鸡胚并用记号笔标记上接种部位（在气室的下缘且无大的血管处）。
-按如下数量为每次检验选择SPF鸡胚：每一样品：10个SPF鸡胚阳性对照：5个SPF鸡胚阴性对照：5个SPF鸡胚-给每组SPF 鸡胚标记如下信息：样品名称样品批号代次接种物-例如，要进行批号为02070180的禽流感H9活性成分的第一代灭活检验：在10个用于接种样品的SPF鸡胚上标记：“H9-02070180，第一代”在5个用于阳性对照的SPF鸡胚上标记：“H9-02070180，阳性对照，第一代”在5个用于阴性对照的5个SPF 鸡胚上标记：“H9-02070180，阴性对照，第一代”-将标记好的SPF鸡胚放到鸡蛋盘上。
-给鸡蛋盘标记上如下信息：活性成分的名称批号代次开始日期结束日期-对接种部位用碘酊棉球消毒。
4.1.3.蛋胚接种-把样品、生理盐水和新城疫/禽流感标准活病毒放入超净工作台中。
-在标记的接种部位用蛋钻打一个孔，在气室的顶部打上另一个孔。
-把摆放有SPF鸡胚的蛋盘放入超净工作台中。
4.1.3.1.阴性对照-用1.0 ml的注射器在5个用于阴性对照的SPF鸡胚的尿囊腔中各接种0.2 ml的无菌生理盐水。
4.1.3.2.样品-用振荡器充分混匀样品。
-用1.0 ml的注射器在10个用于接种样品的SPF鸡胚的尿囊腔中各接种0.2 ml的样品。
用蜡块把5个阴性对照SPF鸡胚和10个接种样品的SPF鸡胚上的孔封起来。
4.1.3.3.阳性对照-在试管架上放上一组15 ml的试管。
-按照下面的举例在每只试管中加入生理盐水溶液（图1）。
-根据标准新城疫/禽流感活病毒（H9）的效价进行梯度稀释，使最后一个病毒稀释液里的病毒效价达到5EID50/ 0.2ml。
在不同的稀释度之间更换滴头在从一支试管里取病毒稀释液之前，用振荡器充分混匀里面的病毒稀释液-图1中，标准禽流感活病毒H9的效价是 3.75×107 EID50/ ml = 7.5×106 EID50/ 0.2 ml。
需要稀释1.5×106倍使最后一个病毒稀释液的病毒效价达到5 EID50/ 0.2ml。
(7.5×106 EID50/ 0.2 ml)/ 1.5×106 = 5 EID50/ 0.2 ml图 1 ：稀释标准禽流感活病毒H9的方法举例-用1.0 ml的注射器在5个用于阳性对照的SPF鸡胚的尿囊腔中各接种0.2 ml的最后一个稀释度的标准新城疫/禽流感活病毒。
-用蜡块把5个阳性对照SPF鸡胚上的孔封起来。
4.1.4.鸡胚孵化-填写记录表格。
-把所有第一代灭活检验用的SPF鸡胚放入37 ℃ ± 1.5 ℃孵箱中孵化5天。
-在接种24小时后照蛋，丢弃死亡的鸡胚作为非特异性死亡。
-在接种后的连续几天里，每个工作日照蛋。
用“X”标记死亡的鸡胚并放入冰箱中。
-在记录表格上记录下照蛋的结果。
4.1.5.收获第一代蛋胚尿囊液尿囊液收获的顺序为：阴性对照蛋胚接种样品的活胚接种样品的死胚阳性对照组的活胚阳性对照组的死胚-把所有的活的和死亡的鸡胚放在蛋盘上放到超净工作台中。
-往鸡胚的蛋壳上喷上消毒剂。
-给几个用于收集尿囊液的试管标记上如下信息：样品名称样品批号灭活检验代次尿囊液收集自哪些蛋胚-例如，用于收集批号为02070180的禽流感H9活性成分灭活检验第1代尿囊液的试管的标记方法： 用于收集接种了样品的活胚的尿囊液的试管标记为：“H9-02070180，第一代灭活检验，活胚尿囊液”。
用于收集接种了样品的死胚的尿囊液的试管标记为：“H9-02070180，第一代灭活检验，死胚尿囊液”用于收集阳性对照活胚的尿囊液的试管标记为：“H9-02070180，第一代灭活检验，阳性对照活胚尿囊液”用于收集阳性对照死胚的尿囊液的试管标记为：“H9-02070180，第一代灭活检验，阳性对照死胚尿囊液”用于收集阴性对照胚的尿囊液的试管标记为：“H9-02070180，第一代灭活检验，阴性对照蛋胚尿囊液”-用无菌剪刀将所有阴性对照组蛋胚的气室的蛋壳剪去。
-从每个蛋胚中收集1 ml的尿囊液，把从每个蛋胚收集的尿囊液混合在同一支相应的试管中。
-重复上述两个步骤，将其他各组蛋胚的尿囊液逐一收集到相应的试管中。
各组收集的尿囊液均不得少于5 ml。
从每组的各个蛋胚收集相同体积的尿囊液混合在一起。
-向各份尿囊液中分别按5.0 ml尿囊液加5.5 µl 抗生素溶液的比例加入抗生素溶液，并用振荡器充分混匀。
-把所有尿囊液都放在5 ± 3 ℃冰箱中至少2个小时，但是不超过24小时，以使抗生素来杀灭其中可能存在的细菌。
-如果第二代灭活实验要在从第一代蛋胚中收获了尿囊液1天后（不包括1天）进行，将尿囊液保存在 -30 ℃ ± 3 ℃冰箱中。
-通常在早晨收获尿囊液而在下午进行第二代灭活检验。
4.1.6.读结果在从蛋胚里收集了尿囊液之后读取结果。
-用20 µl ~ 200 µl 的微量移液器从每个鸡胚取100 µl的尿囊液并滴加到玻璃平板上。
在来自不同蛋胚的尿囊液间留有足够的空间用不同的滴头吸取不同鸡胚的尿囊液-从冰箱中取出2%的红细胞悬液并轻轻摇晃充分混匀红细胞悬液。
-用20 µl ~ 200 µl的微量移液器在每滴尿囊液上加100 µl的红细胞悬液。
-用2.0 ml的小试管的底部充分混匀红细胞和尿囊液。
在混匀不同液滴之间用抹布纸吸干试管的底部。
-将玻璃板放在水平桌面上放置5分钟。
-对着灯光轻轻摇晃玻璃板来检查红细胞是否被尿囊液凝集。
如果在混合物里能看到红细胞凝集块，同时混合物的液体变得透明，表明红细胞被凝集了，此混合物里的尿囊液来源胚被新城疫/禽流感病毒感染了如果在混合物里不能看到红细胞凝集块，同时混合物的液体也没有变得透明，表明红细胞没有被凝集，此混合物里的尿囊液来源胚没有被新城疫/禽流感病毒感染-将结果记录在记录单上。
4.2.第二代灭活实验4.2.1.准备蛋胚-照9 ~ 11日龄的SPF鸡胚并用记号笔标记上接种部位（在气室的下缘且无大的血管处）。
-按照如下数量为每次检验选择SPF鸡胚：10个SPF鸡胚用于接种每一样品第一代灭活实验的活胚尿囊液10个SPF鸡胚用于接种每一样品第一代灭活实验的死胚尿囊液（如果第一代有死胚的话） 如果第一代阳性对照组中有部分鸡胚死亡：5个SPF鸡胚用于接种活胚尿囊液，另外5个SPF 鸡胚用于接种死胚的尿囊液如果第一代阳性对照组无鸡胚死亡：10个SPF鸡胚用于接种阳性对照第一代灭活实验的尿囊液 5个SPF鸡胚用于接种阴性对照第一代灭活实验的尿囊液-给每组SPF鸡胚标记上如下信息：样品名称样品批号代次接种物-例如，要进行批号为02070180的H9禽流感活性成分的第二代灭活实验，如果在第一代灭活实验中样品组和阳性对照组均有死亡胚：在10个用于接种样品第一代灭活实验活胚尿囊液的鸡胚上标记：“H9-02070180，第二代，活胚”在10个用于接种样品第一代灭活实验死胚尿囊液的鸡胚上标记：“H9-02070180，第二代，死胚”在5个用于接种阳性对照组第一代灭活实验活胚尿囊液的蛋胚上标记：“H9-02070180，阳性对照，第二代，活胚”在5个用于接种阳性对照组第一代灭活实验死胚尿囊液的蛋胚上标记：“H9-02070180，阳性对照，第二代，死胚”在5个用于第二代阴性对照的蛋胚上标记：“H9-02070180，阴性对照，第二代”-将标记好的蛋胚放在蛋盘上。
-给蛋盘标记上如下信息：活性成分的名称批号代次开始日期结束日期-在接种部位用碘酊棉球进行消毒。
4.2.2.蛋胚接种-把从第一代灭活实验的蛋胚中收集的所有尿囊液都放入超净工作台。
-在标记的接种部位用蛋钻打一个孔，在气室的顶部打上另一个孔。
-将盛放鸡胚的蛋盘放入层流罩中。
-按照蛋胚上的标记，用1.0 ml的注射器把每个尿囊液按照每个蛋胚0.2 ml的接种量接种到相应的蛋胚尿囊腔中。
-用蜡块将蛋胚上的孔封起来。
接种后把所有的第一代灭活实验的尿囊液保存在 -30 ℃±3 ℃的冰箱中，直到第二代结束。