鸡胚法病毒分离培养作业指导书
病毒的鸡胚培养
实验九病毒的鸡胚培养
一、目的
掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理
二、实验内容
1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鮮种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
1 2 3 11 12
稀释倍数212223 (211)
1
振荡混匀15秒，37C感作10-20分钟。
三、实验报告内容
1、病毒鸡胚培养的注意事项。
2、鸡胚尿囊液NDV HA效价结果，原理，并用原理说明HA效
价测定结果含义与意义。
2。
病毒的分离培养标准操作规程
病毒的分离培养标准操作规程1．目的：规范病毒分离及鉴定培养操作流程，保证试验结果的重复性和稳定性。
2．术语：EID50/0.1ml，ELD50/0.1ml，TCID50/0.1ml，CPE3．操作程序与方法：3.1 采样：对于病死或剖杀动物，采集病毒主要聚集组织部位，一般为淋巴结、脾脏、肺脏、血液等；对于活体动物，可用无菌棉拭子采集含病毒量最多部位（口腔、鼻腔、生殖道、肛门等）的分泌液。
采集样品如不能立即处理，应冻存与-20℃备用。
长途运输应用冰盒或4℃低温保存。
3.2 样品处理：组织块可用剪刀剪碎并研磨，加入10倍体积含300-500UI/ml青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
棉拭子可直接混于3-5倍体积含300-500UI/ml 青、链霉素的生理盐水（PBS），反复冻融2-3次。
8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm滤膜过滤，透过液即为病毒原液，收集保存，短期保存4℃，长期保存用液氮。
3.3接种培养：将病毒原液接种与特定细胞单层中，连续盲传4-6代，观察细胞是否产生特异性CPE，并计算及TCID50/0.1ml。
禽源类病毒可接适当日龄鸡胚或鸡胚成纤维细胞进行扩增和鉴定，并计算及EID50/0.1ml和ELD50/0.1ml。
3.4 病毒纯化：采用“有限梯度稀释法”结合“噬斑纯化法”对病毒进行纯化；3.5 动物回归实验：分离培养并纯化好的病毒回归接种动物，观察动物病变是否为该病毒引起及病变特征是否典型。
3.6分子生物学鉴定：基因组提取并设计特异性引物，对分离病毒保守区基因片段进行特异性扩增，并测序，从分子水平对其进行鉴定。
3.7血清学鉴定：用标准阳性血清与分离病毒作用一段时间后再次接种特异性细胞或鸡胚验证病毒特异性。
或者用荧光标记抗体与病毒作用后荧光显微镜下观察其特异性。
4.注意事项4.1采样过程应做好自身防护，烈性病不得随意分离。
4.2 实验动物应及时焚烧或深埋等处理，避免病毒扩散到环境中。
标准操作规程(SOP)——流感病毒的鸡胚分离方法
一、目的流感病毒的鸡胚分离方法是流感病毒分离方法之一，常用于流感病毒的分离、培养。
本SOP 是为确保鸡胚分离流感病毒的操作准确、规范和可靠而制定。
二、范围适用于中国国家流感中心的所有技术人员进行流感病毒的鸡胚分离。
三、程序（一）生物安全要求H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-3。
实验操作人员需进行BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。
H5,H7亚型高致病性禽流感病毒，H2N2亚型流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
其余流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2。
实验操作人员需进行BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护SOP ”。
其余流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进行。
（二）材料1．9～11日龄SPF 鸡胚2．照卵灯3．70%～75％酒精4．一次性注射器5．鸡蛋开孔器6．蜡或医用胶布7．液体石蜡8．15mL 无菌离心管、试管架标准操作规程（SOP ）——分离方法9．10mL无菌移液管10．无菌镊子。
（三）实验步骤1．验卵（1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。
（2）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全或表面有好多渗水孔，应弃掉。
（3）如何判断鸡胚状态1）血管：活胚血管清晰，死胚模糊，成淤血带或淤血块2）胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动。
3）绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限。
2．鸡胚接种（1）将鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚，通常每个样本接种3个鸡胚。
（2）用70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔，开10×6mm裂口。
（3）用注射器吸200µL处理过的临床标本，装上16号针头。
（4）从裂口中滴入无菌的液体石蜡，然后轻轻晃动鸡胚，让液体石蜡在鸡胚壳膜内层（脏层）铺开，此时在照卵灯下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。
病毒的鸡胚培养
扬州大学兽医学院 成大荣
2009年5月4日星期一来自一、目的要求1. 掌握鸡胚接种的常规方法； 2. 学习NDV的分离培养及其鉴定方法。
二、背景知识介绍
1. 病毒的鸡胚培养
① 鸡胚是正在发育的活体：
• 组织分化程度低； • 细胞代谢旺盛； • 适于许多病毒的生长增殖， 尤其是禽类病毒。
④ 血凝性：可凝集人、鸡、豚鼠和小白鼠的红细胞。 ⑤ 病毒分离培养：9~11日龄鸡胚尿囊腔接种。
三、实验材料
1. 2. 3. 4. 5. 常规接种工具：注射器、打孔器、酒精灯等； 待接种的新城疫病毒材料； 9~11日龄鸡胚（1个/人）； 灭菌生理盐水； 其他： • 镊子、照蛋器； • 酒精棉球、碘酊棉球； • 固体石蜡； • 灭菌瓶子、灭菌吸管 等。
④ 鸡胚接种的方法：
• 尿囊腔接种 • 绒毛尿囊膜接种 • 卵黄囊接种 • 羊膜腔接种 • 静脉接种 ：
2. 新城疫病毒
① 副粘病毒科/副粘病毒亚科/禽腮腺炎病毒属。 ② 新城疫的病原体。 ③ 形态： • • • • • 病毒子多呈球形； 单股负股RNA； 核衣壳螺旋形对称； 有囊膜； 囊膜表面有纤突。
7. 病毒的收获与鸡胚的观察
① 收集24h后死亡鸡胚，置4℃冰箱过夜，以免收获时流血; ② 取出冷却的鸡胚，消毒气室端卵壳表面； ③ 用镊子击破气室部卵壳并去除壳膜，撕破绒毛尿囊膜； ④ 以眼科镊镊住绒毛尿囊膜，用吸管吸取 尿囊液，置无菌容器中保存备用。 一般能尿囊液6-10mL。 ⑤ 取出鸡胚胎，于平皿内观察胚胎有无病 理变化，如出血、蜷缩、侏儒胚等。
4. 注入病毒材料
• 用1mL注射器抽取接种物； • 针头垂直刺入注射部位1-1.2cm即达尿囊腔内； • 注入待接种的新城疫病毒：接种量为0.1~0.2mL。
实验六 病毒培养检测
4.接种量：0.1-0.2ml/胚
5.接种步骤：照蛋→标记→打孔→接毒→封孔→37 ℃孵化箱中继续孵化，及时照蛋，24h内死胚丢 弃，以后死亡者随时取出，冷藏，120h不死者， 冻死。
6.采毒：无菌采取尿囊液、羊水，即为病毒液。
1%鸡红细胞的制作：
1.抗凝剂的准备。常用的抗凝剂有肝素、柠檬酸三钠 等。
病毒培养检测
病毒检测对于病毒研究和病毒病的诊断 十分重要。检测病毒的方法有病毒的分离 和鉴定、病毒感染单位的测定、病毒颗粒 的检测、病毒的血清学检测、病毒为病毒的血凝，利用这种特性设计的实 验称为血球凝集实验（HA），以此来推测 被检材料中有无病毒存在，是非特异性的， 但病毒的血凝可为相应的特异抗体所抑制， 即血球凝集抑制实验（HI），具有特异性。 通过HA-HI实验，可用已知血清来鉴定未知 病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中 的相应抗体和滴定抗体的含量。
5.吸弃上清液后将沉积的红细胞用生理盐水配成1% 红细胞悬液。
6.储存放于4摄氏度冰箱。
操作步骤：
结果判定
判定结果：以100%凝集的病毒的最大稀释孔 为该病毒的血凝价，即一个凝集单位，不凝 集者红细胞沉于孔底呈点状。
2.抗凝剂与血液的比例约为1:4。用一次性注射器抽 取适量抗凝剂后，采集鸡血。
3.将采集的混有抗凝剂的血液转移到离心管中，加入 约3倍体积的生理盐水，2000rpm，离心5min,吸弃 上清液。
4.生理盐水洗涤三次， 2000rpm，每次离心后吸弃 上清液，前两次离心5min，第三次离心10min。
一 目的要求
1.掌握鸡胚的孵化过程和鸡胚的接种 途径； 2.掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖 过程，掌握接毒和收毒的方法； 3.掌握新城疫病毒效价检测方法—血 球凝集试验（HA）。
鸡胚接种实验报告
一、实验目的1. 掌握鸡胚接种病毒的方法和步骤。
2. 了解病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
3. 学习病毒分离和培养的基本原理。
二、实验原理鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法。
病毒接种于鸡胚后，能够在鸡胚中繁殖，从而便于观察和分析病毒的生物学特性。
本实验主要采用尿囊腔接种法，将病毒接种于鸡胚尿囊腔内，观察病毒在鸡胚中的生长和繁殖情况。
三、实验材料1. 实验动物：9-11日龄的鸡胚。
2. 实验试剂：新城疫病毒悬液、生理盐水、碘酒、酒精、消毒棉球等。
3. 实验仪器：照蛋器、无菌手术刀、镊子、注射器、剪刀、平皿等。
四、实验方法1. 鸡胚准备：取9-11日龄的鸡胚，用碘酒和酒精消毒鸡胚蛋壳，用手术刀在鸡胚气室处划一小孔，用注射器吸取适量新城疫病毒悬液。
2. 尿囊腔接种：将鸡胚置于卵盘上，气室端向上，用注射器将病毒悬液注入鸡胚尿囊腔内，注入量约为0.1-0.2ml。
3. 孵育：将接种后的鸡胚放入37℃孵卵箱中孵育48-72小时。
4. 观察：定期观察鸡胚的生长发育情况，记录死亡、畸形等现象。
5. 病毒分离：取出死亡鸡胚，无菌操作下取出尿囊液，进行病毒分离和培养。
五、实验结果1. 接种后，部分鸡胚出现死亡现象，死亡时间集中在接种后24-48小时。
2. 死亡鸡胚的尿囊液中检测到新城疫病毒。
3. 成活鸡胚生长发育正常，未出现明显异常。
六、实验讨论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法，适用于多种病毒的研究。
2. 尿囊腔接种法是一种常用的鸡胚接种方法，适用于新城疫病毒、流感病毒等多种病毒。
3. 本实验结果表明，新城疫病毒能够在鸡胚中繁殖，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
七、实验结论1. 鸡胚接种是一种简单、有效的病毒分离和培养方法。
2. 尿囊腔接种法适用于新城疫病毒等多种病毒的分离和培养。
3. 本实验成功分离和培养了新城疫病毒，为新城疫病毒的研究提供了有力支持。
八、实验心得1. 实验过程中，无菌操作至关重要，需严格按照无菌操作规程进行。
流感病毒分离标准操作规程
流感病毒分离标准操作规程(SOP)病毒分离分离病毒是诊断病毒性疾病最常用,并且高度敏感的方法之一。
分离出的病毒须经免疫学、基因分析或电子显微镜等进一步鉴定确诊。
病毒可长期保存,亦可用来作抗原性、基因特性或药物敏感性等分析。
病毒分离亦受一定限制。
目前用于分离病毒的组织细胞种类有限,每种细胞只能用来分离培养一或数种病毒。
MDCK(狗肾细胞)是目前用于分离培养流感病毒最常用的细胞系。
分离流感病毒最常用的活体是鸡胚,目前有些实验室用MDCK细胞代替鸡胚分离培养流感病毒。
由于MDCK细胞属肿瘤细胞系,故用该细胞分离的病毒不能用于疫苗生产。
各实验室应同时采用鸡胚和MDCK两种方法分离病毒,不应放弃用鸡胚分离病毒的方法。
流感病毒细胞分离标准操作规程材料:1、细胞瓶或细胞管培养成片的MDCK细胞2、TPCK处理胰酶(牛胰腺来源XIII型)Sigma Cat. # T-86423、HEPES 缓冲液, 1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 15630-0234、D-MEM培养基,GIBCO BRL Cat. # 11965-0925、青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素G; 10,000 μg/ml 硫酸链霉素) ,GIBCO BRL Cat. # 15140-0236、牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液,GIBCO BRL Cat. # 15260-0117、放置于2ml wheaton 小瓶中的临床样品8、T-25培养瓶用于病毒培养,(组织培养管也可被应用,若样本量大的话应选用培养瓶,细胞数量按规定调整。
)9、1ml 滴管10、10ml 滴管培养基和试剂的准备:(建议:要求经常检查试剂使用的有效期)500 ml D-MEM液中加入:青、链霉素母液5 ml (终浓度达: 100 U/ml 青霉素and 100 μg/ml 链霉素) 牛血清白蛋白12.5 ml (终浓度: 0.2 %)HEPES缓冲液12.5 ml (终浓度: 25 mM)病毒生长液:每500毫升不含血清的D-MEM液之中加0.5 ml of TPCK-胰酶(母液浓度为2mg/ml )使TPCK-胰酶的浓度为2 μg/ml。
鸡胚培养和细胞培养
第一节鸡胚接种一、鸡胚的结构鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。
目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。
可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。
虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。
鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。
当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。
因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。
原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。
一般说来，孵育至 8-14 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。
在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。
孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。
鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。
如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。
气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。
病毒的鸡胚培养法
（四）收获病毒
鸡胚为活的有机体，因此要严格无菌操作， 同时动作要仔细，以免造成物理死亡。接种 后24小时内死亡应不计结果。
病 毒 的 鸡 胚 培 养 法
刘映乐
1911年 Rous首先将鸡胚应用于Rous肉瘤病 毒的培养 1938年 Cox应用卵黄囊培养立克次氏体
鸡胚培养法的优点：
1. 组织分化程度低
2. 有神经血管的分布及脏器的构造
3. 来源充足，操作简单 4. 胚体通常无菌
5. 对接种的病毒不产生抗体
鸡胚培养法的缺点：
（三）接种途径
尿囊腔接种
该途径一般用于病毒的（流感、新城鸡瘟病毒 和腮腺炎）适应和传代。
尿囊腔接种
卵黄囊接种
该途径主要用于抗病毒（流感）的药物实验。
羊膜腔接种
该途径主要用于临床材料（如患者的鼻洗液及咽 漱液）的病毒分离。
绒毛尿囊膜接种
该途径主要用于病毒滴定、中和试验和药物实验。
1. 病毒通常不能使鸡胚产生特异性的感染指征。 2. 常规饲养方式的不足
3. 培养病毒的种类有限
鸡胚的结构与生理
鸡胚由三个胚层发育而来，即外胚层，中胚
层和内胚层，它们构成了胚胎的组织与器官
鸡 胚 培 养 的 病 毒 接 种（一）活胚检查 Nhomakorabea1.血管
2.胎动 3.绒毛尿囊膜
（二）实验材料
鸡受精卵, 照蛋灯, 打孔器或剪刀, 蛋盘, 无菌注 射器和针头, 消毒酒精, 酒精灯, 石腊 病毒毒种用生理盐水稀释备用
鸡胚造就法[精华]
![鸡胚造就法[精华]](https://img.taocdn.com/s3/m/ace9b8fa112de2bd960590c69ec3d5bbfd0adaa2.png)
鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材SPF鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380C---390C孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
3绒毛尿囊膜发育界限：生活良好的胚胎可见密布血管的绒毛尿囊膜，与胚胎的另一面形成良好的界限须将上面三个方面结合起来进行观察，如果胚胎活动呆滞或不能主动地运动，血管模糊扩张，或折断沉落，绒毛尿囊界限模糊，则可判断胚胎濒死或已经死亡。
病毒分离培养的方法
1.动物接种这是最原始的病毒培养方法。
常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接种的途径有鼻内、皮下、皮内、脑内、腹腔内、静脉等。
根据病毒种类不同，选择敏感动物及适宜接种部位。
2.鸡胚接种鸡胚对多种病毒敏感。
根据病毒种类不同，可将标本接种于鸡胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜上。
3.组织培养将离体活组织块或分散的活细胞加以培养，统称为组织培养。
组织培养法有三种基本类型：器官培养、移植培养和细胞培养。
细胞培养最常用于培养病毒，根据细胞的来源，染色体特性及传代次数又可分为下列类型：原代和次代细胞培养，二倍体细胞株和传代细胞系。
实验五十 动物病毒的鸡胚培养
实验五十一动物病毒的鸡胚培养三、器材1．病毒痘苗病毒（Vaccinia virus），鸡新城疫病毒（Newcastle distase virus）。
2.仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2.5％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1／4凡士林，溶化），灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3.白壳受精卵（自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好）。
四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育（37℃，相对湿度是45%~60%），孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比较大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供应不足，会导致鸡胚大量死亡。
2.接种（1）绒毛尿囊膜接种①将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
②用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形（每边约5~6mm）的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
③用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜分离。
④用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室（图Ⅻ—4）。
⑤用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0.05~0.1ml痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种的方法与步骤
鸡胚接种是一种常用的病毒分离和培养方法，其基本步骤如下：1. 选择合适的鸡胚：通常选择9-12 日龄的鸡胚，此时鸡胚的免疫系统尚未完全发育，适合病毒的生长和繁殖。
2. 准备接种材料：将待接种的病毒样品稀释到适当的浓度，并准备好接种工具，如吸管、针头、注射器等。
3. 接种鸡胚：将稀释后的病毒样品接种到鸡胚的尿囊腔、卵黄囊或绒毛尿囊膜等部位。
接种时要注意操作规范，避免污染和损伤鸡胚。
4. 孵化鸡胚：将接种后的鸡胚放入孵化箱中，在适当的温度和湿度条件下孵化，让病毒在鸡胚中生长和繁殖。
5. 观察和检测：在孵化过程中，定期观察鸡胚的生长情况和病变特征，如鸡胚是否死亡、是否出现出血点、是否出现痘斑等。
同时，可以进行病毒的分离和鉴定，以确定病毒的种类和特性。
6. 收获病毒：当病毒在鸡胚中生长和繁殖到一定程度时，可以收获病毒。
收获病毒的方法包括离心、过滤、沉淀等，具体方法取决于病毒的种类和特性。
7. 保存病毒：收获的病毒可以保存在适当的温度和湿度条件下，以备后续的实验和研究使用。
需要注意的是，鸡胚接种是一项技术性较强的操作，需要严格遵守实验操作规范和安全注意事项，以确保实验的准确性和安全性。
同
时，在进行鸡胚接种实验时，应该遵循相关的法律法规和伦理规范，确保实验的合法性和道德性。
病毒的鸡胚培养法
卵黄囊接种
鸡胚的各种接种途径
1.绒毛尿囊膜接种 2.尿囊腔接种 3.羊水腔接种 4.卵黄囊接种
3.收毒：病毒的收毒根据接种的途径而定。
绒毛尿囊腔内接种 ★★
尿囊液
绒毛尿囊膜接种
绒毛尿囊膜
羊膜腔接种 卵黄囊内接种
羊水 卵黄液和卵黄膜
4.废料处理
• 操作完毕，将所有的用具煮沸消毒，擦净 后再以消毒水浸洗，卵壳、壳膜和胚胎等 残物煮沸消毒后弃去。
• b.病毒材料的准备：要分离培养的病毒材料应
是无菌的，因此在处理材料的过程中，应严格按 照无菌操作进行，将新城疫弱毒活疫苗按照每 1000羽份配成250ml,为达到无菌的目的，可在 每毫升接种物中加入青霉素和链霉素各1005000IU，置室温中1h处理。
法氏囊病毒的分离
• 取疑似感染病毒的法氏囊，称重，按1:5 （w/v）加入生理盐水，研磨，-20℃，反复 冻融2次；每次冷冻时间以研磨物结冰为准；
绒毛尿囊膜接种
1.鸡胚胎2.羊膜腔3.绒毛尿囊膜
羊膜腔接种
取10-12日龄的鸡胚，消
毒气室顶上的蛋壳，并
将气室顶端的蛋壳锉一
三角形的裂痕，用灭菌
镊子揭去裂痕部位的蛋
壳和壳膜，用灭菌平头
镊子刺破尿囊膜，并轻
轻夹去羊膜，用小号针
头刺进羊膜腔内，注入
0.05-0.1ml的病毒接种
液，以氧化锌胶布封口，
滴上溶化的固体石蜡。
（三）实验器材
• 1.鸡胚：要选择SPF鸡胚或低母源抗体的鸡胚。
从实践看，法氏囊炎病毒对抗体相当敏感，所以 要用无母源抗体的鸡胚；而新城疫病毒、禽流感 病毒等可抵御母源抗体的作用而得以繁殖致死鸡 胚。
• 孵化前的鸡胚应注意消毒，置37-38℃、相对湿
鸡胚法病毒分离培养作业指导书
1.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。
2.依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五>3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定4.实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。
在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。
5.标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。
5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。
标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。
标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。
收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。
按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。
咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。
处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。
病毒的鸡胚培养法接种途径
新乡医学院微生物学教研室 监督电话:3029945 Email:jcbwsw@
内容提要
一 抗酸染色 二 病毒的接种技术 三 真菌菌落的观察 （小白鼠和鸡胚共用注射器16支，病毒悬液用 锥蓝染液代替，小白鼠8只，鸡胚15只，微 量移液器4支，真菌示教培养管4支）
缺陷：带毒，缺敏感动物。
常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。
接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静
脉注射等。
1 病毒的动物接种
目的 了解病毒的动物接种法 材料 小白鼠（1~3天或3周龄）， 乙型脑炎 病毒悬液， 1ml注射器（8支），碘酒 ， 棉签，眼科剪等
小白鼠的脑内接种（共8只小白鼠）
病毒的培养
病毒的概念：形态最小，结构最简 单的微生物。缺乏完整的酶系统， 无完整的细胞结构，必须在活的组 织细胞中才能增殖。
常用的分离、 培养、鉴定 病毒的分离培养 病毒的方法
动物接种法
鸡胚培养法
组织细胞培养法
动物接种（Animal inoculation）
最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。
本次实验不做培养，接种完病毒，可将 鸡胚去除部分卵壳后，小心将卵壳内组 织倒入平皿中，观察接种的病毒替代液 （锥蓝染液）是否接种部位正确及各膜 囊等的组织结构。
注意事项
消毒小白鼠时不要碰到眼睛
注射时不要扎的太深以免扎到手
磨卵壳及钻孔时力量要适中
看过的鸡胚不要倒入水池，倒入指定的 大烧杯中
菌落光滑、湿润；无菌丝 隐球菌菌落 外观和酵母型菌落相似，显微镜下可看到假菌丝 白色念株菌菌落 菌落系由多细胞菌丝体所组成 大多数丝状真菌或霉菌的菌落
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的要求掌握鸡胚尿囊腔接种培养新城疫病毒的操作技术。
二、器材1.鸡胚应选用健康鸡群的受精蛋，接种鸡的鸡胚应无母源抗体，以免影响病毒在胚胎中的增殖。
实验用的鸡胚多采用9—10日龄的活胚。
2.接种材料新城疫I系疫苗3.各种器械孵卵器、照蛋箱、蛋架、打孔器、1ml结核菌素注射器、41/2号注射针头、镊子、3%碘酊、75%酒精棉球、铅笔、酒精灯、剪刀、眼科镊子、灭菌的疫苗瓶、灭菌滴管和固体石蜡等。
三、内容和方法（一）接种前的准备1.鸡胚的准备本实验选择9—10日龄的鸡胚，在照蛋时以铅笔勾划出气室，于气室稍下方胚胎活跃而血管明显的区域中，在血管之间的间隙划上记号，作为接种部位；用0、 1%新洁尔灭把蛋壳搽洗干净并抹干，再以2%碘酊对接种部位进行消毒，用75%酒精再擦一遍，在接种定位出打孔，气室向上竖放于蛋架上。
2.病毒接种材料的准备要分离培养的病毒材料应是无菌的，因此为达到材料无菌的目的，可在每ml接种物质中加青霉素和链霉素各100—500IU，置室温中1小时或冰箱中12—24小时处理。
或经滤器除菌。
（二）接种绒毛尿囊腔内注射：用6号针头的1ml注射器吸取新城疫病毒材料，针头从已打好的小孔中向鸡胚方向插入0.5—-1cm,注入0、1ml （相当0、5羽份），再加氧化锌胶布贴封,再加融化的固体石蜡封口,放回孵化箱中进行孵化,每天翻蛋两次,照视一次.24小时内死亡的舍去。
（三）收获新城疫I系病毒材料，在接种24—48小时即可收获。
收获前应将鸡胚置4度冰箱冷藏4小时或过夜，以免解剖时血管破裂。
碘酒消毒蛋壳，用镊子去卵壳和尿囊膜，用吸头吸尿囊液于瓶内，可收集5-8ml，无菌检查，冰冻保存。
食品生物技术《实验三 动物病毒的鸡胚培养》
实验三动物病毒的鸡胚培养一、实验目的掌握鸡胚培养病毒的接毒和收毒方法，明确鸡胚培养病毒的应用三、器材1．病毒痘苗病毒〔Vaccinia virus〕，鸡新城疫病毒〔Newcastle distase virus〕。
2仪器或其他用具孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，25％碘酒，70％乙醇，镊子，剪刀，封蜡〔固体石蜡加1／4凡士林，溶化〕，灭菌培养板，灭菌盖玻片等。
3白壳受精卵〔自产出后不超过10d，以5d以内的卵为最好〕。
四、操作步骤1．准备蛋胚孵育前的鸡卵先用清水以布洗净，再用干布擦干，放入孵卵器内进行孵育〔37℃，相对湿度是45%~60%〕，孵育3d后，鸡卵每日翻动1~2次。
孵至第4d，用检卵灯观察鸡胚发育情况，未受精卵，只见模糊的卵黄黑影，不见鸡胚的形迹，这种鸡卵应淘汰。
活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影，比拟大一些的可以看见胚动，随后每日观察一次，将胚动呆滞的或没有运动的、血管昏暗模糊者，即可能是已死或将死的鸡胚，要随时加以淘汰。
生长良好的蛋胚一直孵育到接种前，具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。
鸡卵孵化期间，箱内应保持新鲜空气流通，特别是孵化5~6d 后，鸡胚发育加快，氧气需要量加大，空气供给缺乏，会导致鸡胚大量死亡。
2接种〔1〕绒毛尿囊膜接种℃将孵育10~12d的蛋胚放到检卵灯上，用铅笔勾出其实与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育的好的地方。
℃用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处，并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形〔每边约5~6mm〕的小窗，不可弄破下面的壳膜。
在气室顶端钻一小孔。
℃用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳，露出壳下的壳膜，在壳膜上滴一滴生理盐水，用针尖小心地划破壳膜，但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛尿囊膜，以利两膜别离。
℃用针刺破其实小孔处的壳膜，再用橡皮乳头吸出气室内的空气，是绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室〔图℃—4〕。
℃用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴005~痘苗病毒液于毛绒尿囊膜上。
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1.目的规范本中心分离和鉴定各型流感病毒的操作方法，确保结果准确、可靠和实验室生物安全。
2.依据标准《流行性感冒诊断标准》WS285-2008附录A<仅限A1，A2.1>,附录G《全国流感监测技术指南》附件1<一、四、五>3.适用范围适用于各型流感病毒的分离和鉴定4.实验室生物安全级别及个人防护对采集自属于感染流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-2实验室内进行，并遵循生物安全二级个人防护。
在特殊情况下（如新型流感病毒的分离培养工作等），应根据实际情况调整实验室生物安全级别及个人防护级别。
5.标本的采集、处理和储存5.1推荐采集的呼吸道标本种类及拭子的选择发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。
气管插管的病人也应收集气管吸取物。
标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃冰箱，并马上送至实验室。
标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。
不推荐棉拭子和木柄。
标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）。
5.2标本处理实验操作人员在处理流感样病例标本时必须在BSL-2实验室的生物安全柜中进行。
标本在实验室内/间转运时需有双层防护包装。
标本在离开生物安全柜前，应使用75%酒精或新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量2000mg/L）对容器表面进行消毒。
收到标本后，应尽快处理并进行分离，避免反复冻融。
按标本类型不同分别处理：鼻、咽拭子标本应将管内拭子在管壁反复挤压后，弃去拭子；鼻腔、气管吸取物标本应用干净灭菌的毛细吸管反复吹打，以便打碎粘液；鼻腔或咽部冲洗液标本应充分振荡标本管，将粘液打碎。
咽拭子在进行挤压时，动作要轻柔勿剧烈操作，以防止产生气溶胶和液体溅出。
处理前将合适尺寸的纱布在新鲜配制的含氯消毒液（有效氯含量1000mg/L）中浸泡并拧干，平铺于生物安全柜内操作区。
标本经以上处理后置4℃，待其自然沉淀5～10分钟，取上清液直接接种或低温保存。
如采样液中未加抗菌素，接种前应补加庆大霉素终浓度为0.1mg/ml，抗真菌药物终浓度为2mg/ml。
混匀置4℃过夜或室温作用2～4小时即可接种。
5.3标本保存24小时内能进行接种的样本可置于4℃保存；如未能接种，应置-70℃或以下保存。
不应保存在-20℃。
6.流感病毒的分离程序6.1鸡胚分离程序流感病毒的鸡胚分离实验室生物安全级别：BSL-2，实验操作人员需进行BSL-2级防护。
流感病毒的鸡胚接种和病毒培养液的收获操作必须在上述级别实验室的生物安全柜中进行。
6.1.1试验材料的准备：9～11日龄SPF鸡胚照卵灯70%～75％酒精一次性1ml注射器，22号针头鸡卵开孔器胶水或医用胶布15mL无菌离心管、试管架10mL无菌移液管无菌镊子6.1.2验卵1）用照卵灯检测鸡胚，标记出鸡胚的气室与尿囊的界限、胚胎的位置。
如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉。
2）如何判断鸡胚状态血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带或淤血块胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊膜与鸡胚胎的另一面形成明显的界限6.1.3鸡胚接种及培养观察1）鸡胚的气室朝上放置在蛋盘上，标记每个鸡胚,通常每个样本接种3个鸡胚。
2）70%～75％酒精消毒鸡胚，在气室端钻孔。
每份标本接种3个鸡胚。
3）1ml注射器吸200µL处理过的临床标本，装上22号针头。
4）胚置于蛋架上，针头完全进入鸡胚，刺破鸡胚羊膜，将100 µl临床标本注入鸡胚羊膜腔。
然后将针头退出至针头的一半，将另外100 µl临床标本注入鸡胚尿囊腔。
5）同一注射器将同一标本依上法接种另外的两枚鸡胚。
6）用注射器反复吸取2‰次氯酸钠消毒液2~3次后，将针头放于毁形器中销毁，注射器针筒弃于锐器盒中。
7）用胶水或者消毒过的医用胶布封口。
8）鸡胚于35℃培养2～3天。
进行病毒分离培养时，每天应检查鸡胚生长情况，24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡应弃去。
6.1.4鸡胚尿囊液和羊水的收获1）在收获前应4℃过夜或至少放置4小时。
2）标记15ml 无菌塑料管与相应的鸡胚编号一致。
用70%～75％酒精消毒鸡胚气室端。
3）用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。
用10mL 无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。
用移液管刺破鸡胚羊膜，尽量吸取羊水放置于另外的管中。
羊水较少时也可以将3个鸡胚的羊水合并。
4）收获病毒培养液后的鸡胚在生物安全柜内装入密封袋，然后进行高压处理。
5）将鸡胚收获液3000rpm离心5min去除血液和细胞。
进行红细胞凝集试验HA≥1:8 的进行病毒的鉴定。
6）如没有红细胞凝集现象的标本，应再进行鸡胚传代1次（对于“O”相的毒株，需要连续传代多次才能具备在鸡胚中生长的特性）。
传代后HA滴度仍为阴性的标本，可以按有关生物安全规定进行处理。
对于HA≤8 的鸡胚分离物继续进行鸡胚传代，直至HA≥8 时再进行病毒的鉴定。
经连续传代后HA<8，可以用RT-PCR方法鉴定分型。
鸡胚传代对于HA≥8的病毒进行鸡胚病毒传代前应将病毒液进行10-1…10-3稀释。
具体的稀释浓度与HA滴度的大小有关。
一般滴度小于1:32时选择10-1稀释度接种；滴度大于1:32以上时选择10-2或10-3稀释度接种。
6.1.5注意事项1）不要在-20℃条件下保存病毒分离物，因为该温度条件下甲型H1N1病毒极不稳定。
2）流感病毒分离操作严格按照生物安全规程的要求。
禁止在同一实验室，同一时间接种未知临床标本和已知其他亚型标准病毒。
禁止在同一实验室，同一时间接种来自不同动物的标本。
动物标本（如猪、禽等）必须与人的标本分别保存。
7.病毒分离物的鉴定------血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验流感病毒的血红细胞凝集及红细胞凝集抑制实验室生物安全级别：缓冲液和其它液体试剂、红细胞悬液的配制可在BSL-1以上（含BSL-1）实验室进行。
血清处理、血凝实验、血抑实验应在BSL-2中进行，实验操作人员需进行BSL-2防护。
血凝实验、血抑实验操作必须在上述级别实验室的生物安全柜中进行。
7.1实验材料及试剂配制7.1.1国家流感中心提供的流感病毒标准参照抗原与血清流感病毒HA抗原：季节性H1N1、季节性H3N2、乙型Yamagata-系、乙型Victoria-系、新甲型H1N1、其他型别流感病毒液流感病毒HAI抗血清：季节性H1N1、季节性H3N2、乙型Yamagata-系、乙型Victoria-系、新甲型H1N1、其他型别流感病毒抗血清7.1.2缓冲液和其他液体试剂1）磷酸缓冲液（PBS），PH7.425×PBS缓冲液：2.74g Na2HPO4,0.79g NaH2PO4 加去离子水至100 ml。
工作液：25×PBS缓冲液完全溶解后，取40ml 25倍PBS液，加入8.5g NaCl，加去离子至1000 ml。
用1N NaOH 或1N HCl调整PH 至7.4。
高压灭菌15分钟，至4℃保存，保存期为3周。
2）生理盐水，0.85% NaCl20×母液：170g NaCl加入1000ml去离子水，高压灭菌。
工作液：20×母液50ml加入去离子水950ml。
高压灭菌15分钟，至4℃保存，保存期为3周。
3）阿氏液Alsever液葡萄糖2.05 g、柠檬酸钠0.8 g、NaCl0.42 g、柠檬酸0.055 g，加去离子水100ml，微热溶解后，过滤，8磅20分钟灭菌，4℃储存备用。
4）红细胞悬液配制a.取阿氏液中的红细胞，1200rpm离心5分钟，弃上清。
b.加入等量的PBS液体洗涤，充分混匀，1200rpm离心5分钟，弃上清。
c. PBS液体洗涤三次。
最后一次洗涤后，1200rpm离心10分钟。
d.将红细胞稀释至合适的浓度。
如用鸡、火鸡的红细胞，工作液浓度为1%（体积比）如用人“O”型、豚鼠红细胞，工作浓度为1.5%（体积比）。
7.1.3其他离心管、无菌纱布37℃水浴、56℃水浴台式离心机、多道可调加样器、单道加样器96孔微量板：鸡/火鸡红细胞最好用“V”底板，也可用“U”底板；豚鼠和人“O”型红细胞必须用“U”底板。
表1 流感病毒红细胞凝集试验各项条件比较7.2 血清的处理7.2.1去除血清中的非特异性抑制素动物血清中常存在菲特异性血凝抑制物质，可以造成假阳性结果。
去除血清中非特异性抑制物质的方法很多，此处仅列出受体破坏酶（RDE）的去除方法：1)1份血清加入4份RDE ，37℃水浴过夜（16-18小时）。
2)56℃水浴加热30-50分钟，灭活RDE。
3)加入15倍体积的生理盐水，此时血清稀释度为1：20。
置4℃保存待用，请勿冻存。
7.2.2去除血清中的非特异性凝集素血清中常有一些非特异性凝集素存在使红细胞凝集，去除非特异性凝集素的方法：1体积的红细胞（未经稀释的浓红细胞）可以去除20倍体积的RDE处理过的血清，红细胞与血清混匀后，置室温1h或4℃过夜，1000rpm离心5min后取上清。
对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。
7.3待检病毒红细胞凝集试验（HA）滴度的测定将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。
标记好加样顺序。
作业指导书编号：TYCDCQTDOC0012018病毒分离培养（鸡胚法）版本：第一版第0次修改颁布日期：2018—11—121) 微量血凝板的第2-12列加入50μlPBS。
2）在第一列（A1-G1）中加入100μl病毒悬液。
3）H1加100μlPBS，作为红细胞阴性对照。
4）从第一列各孔吸50μl病毒液，由第一列至第12列做二倍系列稀释。
最后一列每孔弃去50μl。
5）每孔加入50μl红细胞悬液，轻弹血凝板，充分混匀。
6）室温孵育，禽红细胞静置30min；豚鼠红细胞静置45min；人“O”型红细胞静置60min，观察结果并记录。
7.4 HA试验结果判断引起全部红细胞凝集为完全凝集以“+”记录；只有部分红细胞凝集记录为“+/-”；无凝集记录“-”。
血凝滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的血凝滴度。
7.5制备用于红细胞凝集抑制试验的4个血凝单位的抗原1)一个凝集单位指能引起等量的标准化的红细胞凝集的病毒量。
进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个血凝单位的病毒量。
2)制备4个单位血凝抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。
如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μl抗原，那么测定一份血清须0.2ml抗原。
根据标准血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制4单位标准血凝抗原。