血清碱性磷酸酶活性测定
血清碱性磷酸酶磷酸对硝基苯酚法测定
血清碱性磷酸酶（ALP）磷酸对硝基苯酚法测定1.实验原理碱性磷酸酶的活性由在pH值为10.4，2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）存在的情况下测量p-硝基-磷酸苯酯（pNPP）的转换速率决定。
ALPpNPP + AMP -----------﹥pNP+AMP-PO4在410/480nm测定pNP的生成速率，它与标本中ALP的活性成正比。
2. 标本采集与处理：2.1 病人准备：无特殊要求。
2.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清或肝素化的血浆。
2.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3. 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
4. 标本运输：常温条件下运输5. 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
6. 实验材料：6.1 上海申能ALP测定试剂盒（141 0417170 1 试剂1 6×64 ml ＋试剂2 6×16 ml）6.1.1 试剂组成试剂1：2-氨基-2甲基-1-丙醇（AMP）缓冲液0.90mol/L（pH:10.4）醋酸镁 1.6mmol/L硫酸锌0.4mmol/LHEDTA 2.0mmol/L试剂2：磷酸对硝基酚16.0mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：原试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：碱性磷酸酶试剂中含叠氮钠，避免接触皮肤及粘膜。
反应过程中产生的对硝基苯酚有毒性，切勿吸入、吞食、接触皮肤或粘膜。
若反应液与皮肤或粘膜接触，请速用水冲洗。
6.2 校准品：使用DiaSys公司提供的TruCal U校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP文件。
ALP测定
三、实验用品
半自动生化分析仪
ALP测定试剂盒；
刻度吸管
微量加样器
人血清
目录
四、实验过程 按 表 加 量
试剂 工作液 蒸馏水 样品 空白管 样品管 1.00mL 1.00 mL 0.02 mL — — 0.02 mL
混匀，在反应温度37°C保温60秒，入=405nm处使用半自动生 化分析仪测定和读取ALP值（U/L） 。 正常参考值 37℃下，20-50岁男性：53-128；60岁以上男性：56-119 20-50岁女性：42-98； 60岁以上女性：53-141
目录
六、实验注意事项
1.血清标本新鲜，避免溶血；
2.正确操作半自动生化分析仪；
3.注意试剂安全，避免直接接触皮肤和 眼睛，切勿吞咽。
目录
半自动生化分析仪的使用
目录
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半自动生化分析仪的使用
吸液键 吸液管
目录
ห้องสมุดไป่ตู้录
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ALP
对硝基苯酚(4-NP)
＋磷酸盐
4-NPP在碱性溶液中为无色，在ALP催化下， 4-NPP水解产生游离的4-NP。 4-NP在碱性溶液中 转变为黄色，在405nm下有最大吸收峰。 4-NP 形成的速率与血清中ALP的活性成正比，测定 405nm处吸光度增加速率（△A/min），即可计 算ALP的活性。
目录
五、实验结果与分析
1、实验结果 2、实验分析 3、临床意义 正常人血清中ALP主要来自肝脏和骨骼，所 以ALP常作为作为肝胆疾病和骨骼疾病的辅助 诊断指标。 血清ALP活性病理性增高可见于： （1）肝胆疾病 阻塞性黄疸、胆道梗阻等； （2）骨骼疾病 佝偻病、骨质软化病等。 血清ALP活性生理性增高见于妊娠期与儿童 生长发育期。
碱性磷酸酶活性测定
方法评价
优点：灵敏度较高，显色稳定，
不需去蛋白，操作简单、快速；
缺点：准确度和精密度都较低,受
胆红素和溶血的干扰。
实验材料与仪器
器材： 新鲜血清、移液器、试管及试管 架、吸量管、恒温水浴箱、分光 光度计
移液器
1.调刻度 2.取样 注意：加不同物质换 枪头
实验材料与仪器
试剂盒：
1.混合液：磷酸苯二钠、4-氨基安替比林 2.标准液：已知浓度的酚溶液 3.样 品：血清 4.蒸馏水 5.显色剂:高铁氰化钾
生物化学与分子生物学实验
血清碱性磷酸酶活性测定
授课教师：
实验目的
1.学习血清碱性磷酸酶活性测定 的原理及方法 2.了解血清碱性磷酸酶活性测定 的临床意义
基本概念
酶活性：即酶催化化学反应的能力。
酶的活性通常以活性单位表示。
它反映在规定的条件下，酶促反应 在单位时间内（秒、分或小时）生 成一定量的产物（mg、μg 、μmol） 或消耗一定量的底物所需的酶量。
——呆小病、磷酸酶过少症、维生素C缺 乏症等。
Katal单位：1Katal指在规定条件下， 每秒钟转化1mol底物的酶量。 1Katal=60×106IU
本实验以血清在37℃，pH为10的
条件下，与AKP底物液作用30min， 每生成1mg酚所需的酶量为1个酶
活性单位。
实验原理
碱性磷酸酶（AKP）在碱性条件下
催化磷酸苯二钠水解，释放出酚和
磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安
基本概念
酶活性单位是衡量酶数量的尺度， 同一种酶由于实验方法、测定条件 不同，酶活性单位的规定也不同。
在相同测定条件下，酶活性单位越 大，表示酶的含量越高，酶促反应 速度越快。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理本试剂以国际临床化学会（IFCC）推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。
ALP对-硝基苯磷酸盐 + H2O ----------- 对硝基酚 + 磷酸在上述反应中，对-硝基苯酚的生成速率与样本中碱性磷酸酶的活力成正比。
通过在405 nm处监测吸光度的上升速率，即可测得样本中碱性磷酸酶的活性。
3 标本采集与处理：3.1 病人准备：无特殊要求。
3.2 标本类型：标本最好是无溶血的血清。
3.3 血清分离：应在收集后两小时内分离出来。
避免使用含EDTA或草酸盐的血浆。
3.4 标本存放：2～3天内的活性损失：15～25℃保存：<10%；标本稳定性：4～8℃保存稳定7天；-20℃保存至少可稳定2个月标本。
如果分析延迟8小时以上，最好把血清冷藏。
冷冻的血清在融解后会表现出血清值的显著降低。
3.5 标本运输：常温条件下运输3.6 标本拒收标准：细菌污染的不能做测定。
4 实验材料：4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALP试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1（R1）：乙酸镁3.0mmol/L硫酸锌 1.5mmol/LHEDTA 3.0mmol/LAMP缓冲液420mmol/L试剂2（R2）：对-硝基苯磷酸盐81.5mmol/LAMP缓冲液420mmol/LHEDTA5.0mmol/L4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染，不能继续使用。
4.1.5 注意事项：试剂中含有稳定剂，可能存在一定的刺激作用或毒性，请勿直接接触皮肤、眼睛。
碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒标准操作程序
碱性磷酸酶(ALP)测定标准操作程序1.摘要碱性磷酸酶（ALP）存在于成骨细胞、干细胞、白细胞、肾、脾、胎盘、前列腺和小肠内。
测定血清或肝素化血浆中的碱性磷酸酶活力，做临床辅助诊断用。
2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中碱性磷酸酶（ALP）的活力。
3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定碱性磷酸酶（ALP）活力的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的碱性磷酸酶（ALP）试剂盒采用的是AMP缓冲液法。
5.原理在AMP的缓冲环境下，磷酸对硝基苯在碱性磷酸酶的作用下，可以水解成磷酸盐和对硝基苯酚。
在一定底物浓度范围内,磷酸对硝基苯的水解产物对硝基苯酚会引起405nm处吸光度的上升，其上升速率与血清中碱性磷酸酶的活力成正比。
−→−+OH−−磷酸盐对硝基苯酚磷酸对硝基苯碱性磷酸酶+26.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：R1：AMP缓冲液（PH10.50）、乙酸镁；R2：AMP缓冲液（PH8.85）、磷酸对硝基苯、乙酸镁。
AMP：2-氨基-2-甲基-1-丙醇7.3试剂稳定性：试剂在2-8℃避光保存，有效期1年。
试剂工作液在2-8℃避光保存，可稳定4周，15-25℃可保存稳定4天。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：使用某某公司提供的标准品对自动分析仪进行校准。
按照公司标准品使用要求，并以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白，经校准测定，仪器自动对标准品响应量通过合适的数学模型绘制校准曲线。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
血清碱性磷酸酶正常值
血清碱性磷酸酶正常值
血清碱性磷酸酶的正常值是多少？碱性磷酸酶（ALP）大部分由骨细胞产生，小部分来自肝，广泛分布于人体组织和体液，临床上主要用于骨骼、肝胆系统疾病的诊断和鉴别诊断，尤其是黄疸的鉴别诊断那么，血清碱性磷酸酶的正常值是多少呢？一起来看看下面的介绍吧。
一、血清碱性磷酸酶正常值：
有些人会觉得很奇怪为什么自己做过的几次碱性磷酸酶检查的参考正常值会有所不同，其实碱性磷酸酶的参考正常值会根据测试方法或人群的不同会有所区别，正常值范围的不同也与各医院使用的方法和仪器有关。
一般情况下碱性磷酸酶正常参考值为：女性50~135U/L、男性45~125U/L.下面了解下不同测试方法碱性磷酸酶的参考值是多少。
1、比色法：
成人：3~13金氏单位。
儿童：5~28金氏单位。
2、连续监测法：
37℃，女性1~12岁15岁40~150U/L。
男性1~12岁25岁40~150U/L。
二、血清碱性磷酸酶的测定原理：
1、比色法：ALP在碱性条件下使磷酸苯二钠水解，生成磷酸和游离酚，后者与4-氨基安替比林作用，并经铁氰化钾氧化成红色醌类化合物，其颜色的深浅与ALP活性成正比。
2、连续监测法：ALP在碱性条件下，使磷酸对硝基苯酚（4-NPP）释放出磷酸基团，AMP参与磷酸酰基的转移，促进酶反应速率，生成游离的对硝基苯酚（4-NP），并形成黄色的醌，其吸光度的增高速率与酶活。
血清碱性磷酸酶活
！！！两法比较： 两法比较：
• 终止测定法： 用此类方法测定酶活力，必须确保酶 促反应作用时间的精确，否则会产生较大误差！ • 动力学分析法： 该方法计算方便，不需要作标准曲线 或者标准管。随着科学技术的发展，自动化分析 仪的使用，该方法现已逐步取代终止测定法。
标准曲线法
• 制备如下： 取试管6支，分别加酚标准液 取试管6 (1ml=0．1mg)， 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即混 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各管 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为0.5、 10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘制成标 10、20、30、40单位) 准曲线。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠法
实验目的
• 熟悉酶活性测定方法的一般原理 • 掌握血清ALP测定原理与临床意义 掌握血清ALP测定原理与临床意义 • 熟悉终止法和动力学测定法
实验原理
• 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4 成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比 林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧 化生成红色醌亚衍生物。测定红色物质的吸 光度就可以计算酶活性的大小。 • 反应式如下： 磷酸苯二钠+H ——苯酚+ 磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物 苯酚+4-氨基安替比林——红色醌亚胺衍生物
碱性磷酸酶活性测定试剂盒说明书
碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP/ALP）活性测定试剂盒说明书分光光度法50管/24样注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋白酶，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。
AKP/ALP 广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。
测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氰化钾反应红色亚醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510 nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1瓶，4℃保存。
试剂二：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂三：液体×1瓶，4℃避光保存。
试剂四：液体×1瓶，4℃避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。
标准品：液体×1支（EP管中），2 μ mol/mL酚标准液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，4℃、8000g离心10min，取上清液待测。
2. 细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血液可直接测定，或者适当稀释后测定。
测定步骤：1. 分光光度计预热30min，调节波长到510 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂三置于37℃水浴中预热30 min。
3. 空白管：取EP管，加入20μL蒸馏水，200μL试剂二，200μL试剂三，混匀后置于37℃水浴中保温15min；加入试剂四600μL，混匀后于510 nm测定吸光度，记为A空白管。
血清碱性磷酸酶ALP测定
血清碱性磷酸酶ALP测定1.实验原理ALP对硝基酚磷酸盐+ H2O —————→磷酸+ 对硝基酚Mg2+在镁离子存在下, 对-硝基酚磷酸盐被ALP分解成磷酸和对-硝基酚,在405nm 的波长下, 对-硝基酚的吸光度增加与ALP的活性成正比。
2. 标本：2.1 病人准备：新鲜血清，采血后应及时分离，避免溶血。
2.2 类型：血清、肝素或EDTA血浆，应避光保存。
3. 标本存放：15～25℃保存可稳定2天；2～8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月，如冰冻保存，不可反复冻融！。
4. 标本运输：冰冻条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染、脂血等存运输的标本。
6. 实验材料6.1 试剂：中生碱性磷酸酶试剂盒（试剂1＋试剂2）6.1.1 试剂组成6.1.3 试剂稳定性与贮存试剂避光保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂有效期为12个月。
试剂必需避光保存。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂空白吸光率A405nm(1.0cm)>1.0，或有混浊和可见颗粒时，请不要再使用。
6.1.5 注意事项：试剂请勿直接接触皮肤、眼睛，如有接触，请用大量清水清洗。
请勿吞服。
6.2 校准品：使用OLYMPUS提供的多项校准品对自动分析仪进行校准，参见生化检验校准品和质控品.SOP文件6.3 质控品：参见生化检验校准品和质控品.SOP文件7. 仪器：奥林巴斯AU640生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪项目测定参数.SOP文件。
8.2仪器操作步骤：参见生化检验奥林巴斯AU640生化分析仪操作规程.SOP 文件。
9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
质控规则参见生化室室内质控操作规程.SOP文件。
11. 计算方法：以OLYMPUS校准品校准仪器后，在病人结果可报告范围内，仪器直接报告可靠的检测结果无需手工计算，以U/L报告。
血清中碱性磷酸酶的测定
• 测定ALP的方法主要分为二种，一是测定底物 解离下的磷酸根来计算酶活力，如β-甘油磷酸 钠法，但存在血清本身有磷酸根及磷酸化的缺 点；二是测定底物解离磷酸根后的羟基化合物， 这种方法又可分为：1，酚化合物在显色剂的 作用下显色比色测定。2，生成的酚化合物本 身在一定的条件下就可显色，如磷酸对硝基酚 法。
当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴道和肝窦进入血液，同时由 于肝内胆道胆汁排泄障碍，反流入血而引起血清碱性磷酸酶明显升 高。
碱性磷酸酶偏高的原因可以分为生理性原因和病理性原因，具 体讨论如下：
1、生理性原因 儿童骨骼发育期、孕妇、骨折愈合期，这些情 况下骨组织中的碱性磷酸酶很活跃，所以检测时值会偏高。
2、病理性原因 当人体患有阻塞性黄疸、原发性肝癌、继发性 肝癌、胆汁淤积性肝炎等时，肝细胞过度制造ALP，经淋巴道和肝
1．生理性增高：儿童在生理性的骨骼发育期，碱性磷酸酶活力可 比正常人高1～2倍。处于生长期的青少年，以及孕妇和进食脂肪含量 高的食物后均可以升高。
2．病理性升高： (1)骨骼疾病如佝偻病、软骨病、骨恶性肿瘤、恶性肿瘤骨转移等； (2)肝胆疾病如肝外胆道阻塞、肝癌、肝硬化、毛细胆管性肝炎等； (3)其他疾病如甲状旁腺机能亢进。 3．病理性降低：见于重症慢性肾炎、儿童甲状腺机能不全、贫血 等。
• （二）试剂
（1）0.1mol/L碳酸缓冲液（pH=10.0)：称取无水碳酸钠6.36g、碳酸氢 钠3.36g、4-氨基安替比林1.5g，溶于800ml蒸馏水中，定容至1L,置于 棕色瓶内储存。
（2）20mmol/L磷酸苯二钠溶液：先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸 苯二钠2.18g（磷酸苯二钠如含2分子结晶水，应称取2.54g)，冷却后加 氯仿2ml防腐，在4℃冰箱内保存。用剩的溶液不应再倒回瓶中。
血清碱性磷酸酶活性测定 ppt课件
————磷酸苯二钠法
血清碱性磷酸酶活性测定
主要内容：
⑴ 实验目的 ⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂 ⑷ 实验操作 ⑸ 计算 ⑹ 临床意义 ⑺ 注意事项
血清碱性磷酸酶活性测定
基本概念
酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。
4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级 标准品。 血清碱性磷酸酶活性测定
实验操作
取4支试管，如下操作：
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
血清碱性磷酸酶活性测定
试剂与仪器
器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液 器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸钠
6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。
碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。
血清碱性磷酸酶活性测定
实验原理
碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之 水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替 比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物， 其颜色深浅与ALP活性成正比。
磷酸苯二钠+H2O
ALP 苯酚+磷酸氢二钠
pH=10
苯酚+4-氨基安替比林 铁氰化红钾色醌亚胺衍生物
血清碱性磷酸酶的活性测定
实验原理
三.核心原理 ALP催化磷酸苯二钠转变成苯酚的速率 可用分光光度计监测，从而计算ALP活 力的大小 ALP 磷酸苯二钠+H2O----------苯酚+磷酸氢 PH 10 二钠 苯酚+4-氨基安替比林--铁氰化钾---红色醌 亚胺衍生物
试剂
碳酸盐缓冲液（0.1mol/L PH10.0) 无水碳 酸钠6.36g、碳酸氢钠3.36g、4-氨基安替比 林1.5g溶于800ml蒸馏水中，定容至1L。棕 色瓶贮存。 磷酸苯二钠底物液（20mmol/L) 先将 500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠 2.18g，冷却后加氯仿2ml，4℃冰箱保存。 显色液 铁氰化钾K3[Fe(CN)6]2.5g、硼酸 17g，各溶于400ml蒸馏水，混合后加蒸馏 水至1L，棕色瓶避光保存。 酚标准工作液0.05mg/ml
实验操作
试剂/ml 血液 酚标准液 蒸馏水 PH10碳酸盐 缓冲液 底物液 铁氰化钾溶 液 血清 测定管（T） 0.100 ----1.00 标准管（S) --0.100 --1.00 空白管（B） 对照管（C） ----0.100 1.00 ------1.00
混匀，37℃水浴保温5min，同时将底物液预热
临床意义
1.生理性增加：如儿童、妊娠期、进食 高糖高脂肪食物等使ALP活性升高 2.病理性改变 A.升高：肝胆疾病（主要见于阻塞性黄 疸，急或慢性黄疸型肝炎，肝硬化，肝 癌） 骨骼疾病（纤维性骨炎、变型 性骨炎、成骨不全症、骨质软化病、佝 偻病、肿瘤骨转移等） B.降低:主要见于呆小症、磷酸酶过少症 等
血清碱性磷酸酶活力的测定
磷酸苯二钠法
生化试验第三组
实验目的
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程
血清碱性磷酸酶测定标准操作规程1.检验原理：(对硝基酚磷酸盐连续监测法)以磷酸对硝基酚二钠(PNPP)为底物，2—氨基-2-甲基丙醇(AMP)为磷酸酰基的受体。
在碱性环境，碱性磷酸酶催化PNPP水解产生的游离对硝基酚，对硝基酚在碱性溶液中转变成黄色。
根据在405nm 处吸光度增高速率来计算碱性磷酸酶的活性单位。
PNPP+H2O9阻'->对硝基酚+无机磷-20°C保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法；仪器法(详见DF-603/DI-600标准操作规程)5.参考范围6.检验结果的解释：6.1样本含量超出线性范围时，建议用0.9%(W∕V)的氯化钠溶液稀释样本。
7.2.单位换算：ukat∕L=U∕L*16.67*IO-38.检验方法的局限性8.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在405nm处吸光度大于1.000时不能使用。
8.试剂性能指标8.1试剂外观：R1：无色透明液体，无悬浮物及沉淀；R2无色或淡黄色透明液体，无悬浮物及沉淀。
8.2装量：不低于标识值。
8.3空白吸光度：在37℃、405rπn处，光径IenI时，空白吸光度A≤1.0008.4空白吸光度变化率：在37C、405nm处，光径ICm时，用生理盐水作为样品加入试剂测试时，Z∖A∕minW0.005.1.15分析灵敏度：在405nm处,光径Icm时，测量120U/L的碱性磷酸酶时，吸光度变化4A∕min20.015.8.6线性范围：试剂的线性区间为[25-750]U∕L,在此线性区间内：a)线性相关系数r应不小于0.9900；b)[25-100]U/L区间内，线性绝对偏差不超过土10U/L；(100-750)U/L区间内,线性相对偏差不超过±10%。
8.7重复性:CV≤5%8.8批间精密度:R≤10%8.9准确度：相对偏差应不大于±10%。
8.10稳定性：(2-8)C下，原包装存放的试剂有效期为12个月,取到期后一个月的试剂进行测试，应满足1-7、9的要求。
碱性磷酸酶值测定实验报告
碱性磷酸酶值测定实验报告一、实验目的碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，简称 ALP）是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
本次实验的目的是测定样本中碱性磷酸酶的活性，以评估相关生理或病理状态。
二、实验原理碱性磷酸酶在碱性环境下能够催化磷酸酯的水解反应，生成无机磷和醇。
通过测定生成的无机磷的量，可以间接反映碱性磷酸酶的活性。
本实验采用磷酸苯二钠法，磷酸苯二钠在碱性条件下被碱性磷酸酶水解生成苯酚和磷酸氢二钠。
苯酚与 4-氨基安替比林反应生成红色醌亚胺衍生物，在 510nm 波长处有最大吸收峰。
通过测定吸光度值，并与标准曲线对照，即可计算出碱性磷酸酶的活性。
三、实验材料与设备1、材料血清样本磷酸苯二钠溶液碳酸盐缓冲液（pH 100）4-氨基安替比林溶液铁氰化钾溶液酚标准液2、设备分光光度计恒温水浴锅移液器试管、刻度吸管等四、实验步骤1、标准曲线的绘制取 6 支干净试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5。
按表 1 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
加入铁氰化钾溶液 30ml，立即混匀。
用分光光度计在 510nm 波长处，以 0 号管调零，读取各管的吸光度值。
以酚含量（μg）为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
表 1 标准曲线绘制的试剂加入量｜试管编号|0|1|2|3|4|5|｜｜｜｜｜｜｜｜｜酚标准液（ml）｜0|005|010|020|030|040|｜蒸馏水（ml）｜10|095|090|080|070|060|｜碳酸盐缓冲液（ml）｜30|30|30|30|30|30|｜4-氨基安替比林溶液（ml）｜10|10|10|10|10|10|｜铁氰化钾溶液（ml）｜30|30|30|30|30|30|2、样本测定取 3 支干净试管，分别编号为测定管、对照管和空白管。
按表 2 向各试管中加入试剂，混匀。
置于 37℃水浴中保温 15 分钟。
碱性磷酸酶比活性测定实验报告
碱性磷酸酶比活性测定实验报告一、实验目的本实验旨在测定碱性磷酸酶（ALP）的比活性，了解其在生物体内的作用和活性水平。
通过实验，掌握碱性磷酸酶比活性测定的基本原理和方法，培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理碱性磷酸酶是一种广泛存在于生物体内的酶，能够催化磷酸酯的水解反应。
在本实验中，以对硝基苯磷酸二钠（pNPP）为底物，在碱性条件下，碱性磷酸酶能够将 pNPP 水解生成对硝基苯酚（pNP）和磷酸。
pNP 在碱性溶液中呈黄色，其在 405nm 波长处有最大光吸收。
通过测定反应体系在405nm 处的吸光度变化，可以计算出碱性磷酸酶的活性。
比活性是指每毫克蛋白质所含的酶活性单位数，通过测定蛋白质含量和酶活性，即可计算出碱性磷酸酶的比活性。
三、实验材料与仪器1、实验材料碱性磷酸酶标准品对硝基苯磷酸二钠（pNPP）碳酸钠碳酸氢钠缓冲液（pH 100）氢氧化钠溶液（1mol/L）考马斯亮蓝 G-250 试剂牛血清白蛋白标准品待测样品（组织提取液或细胞培养液）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器容量瓶试管四、实验步骤1、标准曲线的绘制配制不同浓度的对硝基苯酚（pNP）标准溶液：分别吸取 0、01、02、03、04、05ml 的 1mmol/L pNP 标准溶液，加入到 10ml 容量瓶中，用碳酸钠碳酸氢钠缓冲液定容至刻度，得到浓度为 0、10、20、30、40、50μmol/L 的标准溶液。
长处测定各标准溶液的吸光度。
绘制标准曲线：以 pNP 浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法）配制考马斯亮蓝 G-250 试剂：将 100mg 考马斯亮蓝 G-250 溶解于50ml 90%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，最后用蒸馏水定容至1000ml。
配制牛血清白蛋白标准溶液：将牛血清白蛋白标准品用蒸馏水配制成 0、01、02、03、04、05mg/ml 的标准溶液。
碱性磷酸酶km值测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除碱性磷酸酶km值测定实验报告篇一：酶促反应动力学实验报告酶促反应动力学实验报告14301050154杨恩原实验目的：1.观察底物浓度对酶促反应速度的影响2.观察抑制剂对酶促反应速度的影响3.掌握用双倒数作图法测定碱性磷酸酶的Km值实验原理：一、底物浓度对酶促反应速度的影响在温度、ph及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶的催化作用有很大的影响。
在一般情况下，当底物浓度很低时，酶促反应的速度(v)随底物浓度[s]的增加而迅速增加，但当底物浓度继续增加时，反应速度的增加率就比较小，当底物浓度增加到某种程度时反应速度达到一个极限值(即最大速度Vmax)。
底物浓度和反应速度的这种关系可用米氏方程式来表示(michaelis-menten方程)即：式中Vmax为最大反应速度，Km为米氏常数，[s]为底物浓度当v=Vmax/2时，则Km=[s]，Km是酶的特征性常数，测定Km是研究酶的一种重要方法。
但是在一般情况下，根据实验结果绘制成的是直角双曲线，难以准确求得Km和Vmax。
若将米氏方程变形为双倒数方程(Lineweaver-burk方程)，则此方程为直角方程，即:以1/V和1/[s]分别为横坐标和纵坐标。
将各点连线，在横轴截距为-1/Km，据此可算出Km值。
本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同浓度底物时的酶活性，再根据1/v和1/[s]的倒数作图，计算出其Km值。
二、抑制剂对酶促反映的影响凡能降低酶的活性，甚至使酶完全丧失活性的物质，成为酶的抑制剂。
酶的特异性抑制剂大致上分为可逆性和不可逆性两类。
可逆性抑制又可分为竞争性抑制和非竞争性抑制等。
竞争性抑制剂的作用特点是使该酶的Km值增大，但对酶促反映的最大速度Vmax值无影响。
非竞争性抑制剂的作用特点是不影响[s]与酶的结合，故其Km值不变，然而却能降低其最大速度Vmax。
本实验选取na2hpo4作为碱性磷酸酶的抑制物，确定其抑制作用属于哪种类型。
血清碱性磷酸酶活性测定
优选血清碱性磷酸酶活性测定
主要内容：
⑴ 实验目的 ⑵ 实验原理
⑶ 实验器材与试剂 ⑷ 实验操作 ⑸ 计算 ⑹ 临床意义 ⑺ 注意事项
基本概念
酶活力：称酶活性，是表示催化某一特定反应 的能 力。可以用在一定条件下所催化的某一特 定化学速度表示。
酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈 低。
底物液
铁氰化钾溶液 血清
4．酚标准工作液（0.05mg/ml） 购买合格的二级 标准品。
实验操作
取4支试管，如下操作：
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水
测定管 0.100 —— ——
pH10碳酸盐缓冲液 1.00
标准管 —— 0.100 —— 1.00
空白管 —— —— 0.100 1.00
对照管 —— —— —— 1.00
2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将500ml蒸馏水 煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2 分子结晶水，则应称取2.54g) ，冷却后加氯仿2ml防 腐，在4℃冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）
3．显色液（铁氰化钾的硼酸溶液） 称取铁氰化 钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混 合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现 蓝绿色即弃去)。
试剂与仪器
器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液 器，721E分光光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴
试剂： 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0) 无水碳酸钠
6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于 800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。
思考
如何测定酶活力的大小？
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临床意义
• 在临床上，血清ALP测定常作为肝胆疾病和骨骼 疾病的临床辅助诊断指标。 • 1．血清 血清ALP活性升高 ： 肝胆疾病：阻塞性黄疸、 血清 活性升高 急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由 于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的 ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高， 如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、 骨转移癌和骨折修复愈合期等。 • 2．血清 血清ALP活性降低 活性降低： 比较少见，主要见于呆 血清 活性降低 小病，ALP过少症，维生素C缺乏症。
血清碱性磷酸酶活性测定
磷酸苯二钠法
小组成员：
• 程展鹏，杨秋月，陈敬根， 程展鹏，杨秋月，陈敬根， 卢昆
实验目的
• 熟悉酶活性测定方法的一般原理 • 掌握血清ALP测定原理与临床意义
实验原理
• 在PH10 环境中，ALP催化磷酸苯二钠水解生成 苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应 生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色 醌亚衍生物。测定红色物质的吸光度就可以计算 酶活性的大小。 • 反应式如下： • ALP 磷酸苯二钠+H2O——苯酚+磷酸氢二钠 • pH10 • 铁氰化钾 苯酚+4-氨基安替比林————红色醌亚胺衍生物
注意事项
• 1．底物溶液中不应含有游离酚，如有酚则 空白管显红色，说明磷酸苯二钠已经开始 分解，应弃去不用。 • 2．铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定显色作 用。该液应避光保存，如出现蓝绿色即应 废弃。 • 3．加入铁氰化钾溶液后必须立即混匀，否 则显色不完全。
• 立即混匀。用510nm波长比色，以蒸馏水 调零点，读取各管吸光度。 • 计算 ALP活性=（A测定—A ）/（A —A ） *0.05*100(金氏单位）下： 取试管6支，分别加酚标准液 (1ml=0．1mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml， 各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、 2.7ml。混匀后37℃水浴保温5分钟，各管加入 1.0ml碱性溶液，再加0.5％铁氰化钾2.0ml，立即 混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上 各管所得读数与其相应的碱性磷酸酶单位(依次为 0.5、10、20、30、40单位)在坐标纸上作图，绘 制成标准曲线。
实验器材和试剂：
• （一）器材： 5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光 光度计，1cm比色皿，37℃ 恒温水浴 • （二）试剂： • 1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液 碳酸盐缓冲液(pH10.0) 称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢 碳酸盐缓冲液 钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，加蒸馏水溶解至1000ml。置棕色瓶 中保存。 • 2．20mmol/L磷酸苯二钠溶液 先将400ml蒸馏水煮沸，称取磷酸 磷酸苯二钠溶液 苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)加入煮沸 的蒸馏水中使其溶解，冷却后用煮过的冷蒸馏水加至500ml，再加氯 仿2ml，置冰箱保存，此为底物溶液。 • 3．铁氰化钾的硼酸溶液 称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于 ． 蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1 000ml，置棕色瓶中避光 保存(如出现蓝绿色即弃去)。 • 4．酚标准工作液（0. 05mg/ml）： 酚标准工作液（ ）：购买合格的二级标准品。 酚标准工作液 ）：
实验操作
• 取试管4支，按下表操 作： 测定管 标准管
血清（ml） 酚标准液 蒸馏水 pH10碳酸盐缓 冲液 0.100 —— —— 1.00 —— 0.100 —— 1.00 混匀37摄氏度水浴保 温5MIN同时将底物预 热 底物液 1.00 1.00 混匀37摄制度水浴保 护15min 铁氰化钾溶液 血清 3.00 —— 3.00 ——— 3.00 —— 3.00 0.100 1.00 1.00 空白管 —— —— 0.100 1.00 对照管 —— —— —— 1.00