A型产气荚膜梭菌青海分离株tetA(P)耐药基因序列分析及蛋白结构预测

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肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析

中国畜牧兽医 2024,51(3):1298-1307C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r in a r y Me d i c i n e 肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析黄紫贝1,罗健雅1,赵以恒1,李蒙1,苏思元1,赵振华2,刘文博1,3(1.扬州大学兽医学院,扬州225009;2.江苏省家禽科学研究所,扬州225125;3.江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009)摘要:ʌ目的ɔ对江苏某大型白羽肉鸡场疑似产气荚膜梭菌感染造成大规模死亡的病例进行确诊㊂ʌ方法ɔ无菌采集病死鸡肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏及肠道等病变组织,通过厌氧培养进行细菌分离和纯化,革兰染色镜检对分离菌株进行初步鉴定,通过16S r R N A 基因序列分析确定属和演化关系,通过P C R 扩增毒素基因确定分离株毒素型,通过动物致病性试验和药敏试验,确定其致病性和耐药表型并检测耐药基因㊂ʌ结果ɔ从4只病死鸡不同脏器中分离到了9株疑似菌,分离菌在产气荚膜梭菌鉴定培养基上呈黑色,16S r R N A 分析得出9株分离菌与产气荚膜梭菌相似性最高可达99.60%㊂16S r R N A 基因系统进化树显示,4株分离株与巴基斯坦鸡源产气荚膜梭菌(G e n B a n k 登录号:MN 365136.1)具有较近的亲缘性,5株分离株与南非鸡源产气荚膜梭菌(G e n B a n k 登录号:O R 494055)具有较近的亲缘性㊂毒素分型结果显示,5株为A 型,2株为F 型,2株为E 型㊂致病性试验结果显示,小鼠全部死亡,表明该菌具有致死性㊂药敏试验结果显示,9株分离株均对头孢类抗生素敏感,耐药基因分析表明大环内酯类e r m (B )(77.8%)和四环素类t e tA (P )(55.6%)㊁t e tB (P )(66.7%)为主要耐药基因㊂ʌ结论ɔ本研究从同一只病死鸡中分离到不同毒素型产气荚膜梭菌,且分离菌耐药情况较严重㊂研究结果为兽医临床鸡产气荚膜梭菌病防治提供了新的思路㊂关键词:产气荚膜梭菌;鸡;毒素基因;耐药性中图分类号:S 852.61文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.042 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-22基金项目:江苏省农业科技自主创新项目(C X (20)2012-1);江苏省优势学科第四期(2021)联系方式:黄紫贝,E -m a i l :986877847@q q.c o m ㊂通信作者刘文博,E -m a i l :l w b @y z u .e d u .c n I s o l a t i o n ,I d e n t i f i c a t i o na n dD r u g R e s i s t a n c eA n a l ys i s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n ge n sf r o mB r o i l e rC h i c k e n s HU A N GZ i b e i 1,L U OJ i a n y a 1,Z H A O Y i h e ng 1,L IM e n g 1,S US i yu a n 1,Z H A OZ h e n h u a 2,L I U W e n b o1,3(1.C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Y a n g z h o uU n i v e r s i t y ,Y a n gz h o u 225009,C h i n a ;2.J i a n g s u I n s t i t u t e o f P o u l t r y S c i e n c e ,Y a n g z h o u 225125,C h i n a ;3.J i a n gs uC o -i n n o v a t i o n C e n t e r f o rP r e v e n t i o na n dC o n t r o l o f I m p o r t a n tA n i m a l I n fe c t i o u sD i s e a s e s a n d Z o o n o s e s ,Y a n gz h o u 225009,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h es t u d y w a sa i m e dt oi d e n t i f y t h e p a t h o ge n so ft h ed e a t ho fb r o i l e r c h i c k e n s s u s p e c t e dt ob ei nf e c t e db y C l o s t r i d i u m p e r f r i ng e n s i naf a r mi n N a n t o n g ,J i a n g s u .ʌM e th o d ɔT h e li v e r s ,s p l e e n s ,l u n g s ,k i d n e ys a n d c o n t e n t s o f i n t e s t i n e s o f t h e d e a dc h i c k e n sw e r e c o l l e c t e da s e p t i c a l l y .B a c t e r i a li s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n w e r e c a r r i e d o u tt h r o u gh a n a e r o b i c c u l t i v a t i o n ,a n dt h e i s o l a t e ds t r a i n sw e r e p r e l i m i n a r i l y i d e n t i f i e db y G r a m s t a i n i n g m i c r o s c o p y .G e n u s a n d e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p w e r e d e t e r m i n e db y 16S r R N A g e n e s e q u e n c e a n a l ys i s ,t o x i n t y p ew a sd e t e r m i n e d b y P C R a m p l i f i c a t i o n o ft o x i n g e n e s ,p a t h o g e n i c i t y a n d d r u g re s i s t a n c e p h e n o t y p e sw e r ed e t e r m i n e db y a n i m a l p a t h o g e n i c i t y t e s ta n dd r u g s u s c e p t i b i l i t y t e s t ,a n dd r u g3期黄紫贝等:肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析r e s i s t a n c e g e n e sw e r e d e t e c t e d.ʌR e s u l tɔ9s u s p e c t e d s t r a i n sw e r e i s o l a t e d f r o md i f f e r e n t o r g a n s o f 4d e a d c h i c k e n s,a n d t h ei s o l a t e s w e r e b l a c k o n t h ei d e n t i f i c a t i o n m e d i u m o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s.16S r R N A a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e9i s o l a t e s a n d C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s w a s u p t o99.60%.T h e16S r R N A g e n e p h y l o g e n e t i c t r e e s h o w e d t h a t4 i s o l a t e sw e r ec l o s e l y r e l a t e dt oc h i c k e n-d e r i v e d C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s o fP a k i s t a n(G e n B a n k a c c e s s i o nN o.:MN365136.1),a n d5i s o l a t e sw e r e c l o s e l y r e l a t e d t oc h i c k e n-d e r i v e d C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s o fS o u t h A f r i c a(G e n B a n ka c c e s s i o n N o.:O R494055).T h er e s u l t so f t o x i nt y p i n g s h o w e d t h a t5s t r a i n sw e r e t y p eA,2s t r a i n sw e r e t y p eFa n do t h e r sw e r e t y p eE.T h e r e s u l t so f p a t h o g e n i c i t y t e s t s h o w e d t h a t t h eb a c t e r i aw e r e l e t h a l.T h ed r u g s e n s i t i v i t y t e s t s s h o w e d t h a t9 s t r a i n s w e r e s e n s i t i v e t o c e p h a l o s p o r i n a n t i b i o t i c s.R e s i s t a n c e g e n e s a n a l y s i s s h o w e d t h a t m a c r o l i d e e r m(B)(77.8%),t e t r a c y c l i n e t e t A(P)(55.6%),t e t B(P)(66.7%)g e n e sw e r et h e m a i n r e s i s t a n c e g e n e s.ʌC o n c l u s i o nɔI nt h i ss t u d y,d i f f e r e n t t o x i n-t y p e C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s w e r e i s o l a t e df r o mt h es a m ed e a dc h i c k e n,a n dt h ed r u g r e s i s t a n c eo f t h e i s o l a t e db a c t e r i a w a s s e r i o u s.T h i s r e s u l t p r o v i d e d an e wi d e a f o r t h e p r e v e n t i o na n d t r e a t m e n t o f c h i c k e n C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s i nv e t e r i n a r y c l i n i c.K e y w o r d s:C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s;c h i c k e n s;t o x i n g e n e;d r u g r e s i s t a n c e产气荚膜梭菌(C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s)是一种革兰阳性㊁厌氧㊁产芽孢杆菌[1]㊂该菌可见于土壤㊁食物㊁植被㊁海洋沉积物㊁禽类肠道和家禽垫料等,是引起家禽坏死性肠炎(N E)的主要病原菌之一[2]㊂据统计产气荚膜梭菌引起家禽坏死性肠炎每年可造成60亿美元的损失[3-4],产气荚膜梭菌的致病性与产毒素能力相关,该菌可产生至少20种不同的毒素[5]㊂根据产气荚膜梭菌分离株产生的6种主要毒素可将其分为7类:A型(α)㊁B型(α㊁β㊁ε)㊁C型(α㊁β)㊁D型(α㊁ε)㊁E型(α㊁ι)㊁F型(α㊁C P E)和G型(α㊁N e t B)㊂以往防控鸡产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎主要措施是在饲料中添加一定量的林可霉素㊁杆菌肽㊁青霉素等抗生素,再加上临床中的不合理用药,导致产气荚膜梭菌对多种抗生素产生了不同程度的耐药性[6-7]㊂世界上最主要的两个细菌耐药性监测系统,美国全国肠道细菌耐药性监测系统(T h e N a t i o n a l A n t i m i c r o b i a l R e s i s t a n c e M o n i t o r i n g S y s t e mf o rE n t e r i cB a c t e r i a,N A R M S)及欧洲食品安全局(E u r o p e a n F o o d S a f e t y A u t h o r i t y,E F S A),包括芬兰㊁挪威㊁瑞典㊁丹麦等国家,在2019年监测报告中均未报道产气荚膜梭菌的相关耐药数据[8]㊂随着抗生素的大量使用,产气荚膜梭菌的耐药性日益严重,因此,临床强毒株的多重耐药势必会对食品安全和人类健康造成威胁[9]㊂江苏南通某鸡场病鸡精神不振,腹泻,部分鸡突发死亡,本试验对疑似产气荚膜梭菌送检病死白羽肉鸡进行病原学和耐药性相关研究,以期为临床上产气荚膜梭菌病的防治与耐药性相关研究提供参考㊂1材料与方法1.1材料1.1.1病料2021年7月江苏南通某白羽肉鸡场送检的4只病死鸡,主要剖检变化为出血性肠炎㊂无菌采集肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肾脏及肠道等进行细菌分离㊂1.1.2试验动物30只8~10周龄S P F级雄性B L A B/c小鼠,体重18~22g,购自扬州大学比较与医学研究中心,许可证号:SC X K(苏)2022 0009㊂饲养于扬州大学实验动物房,许可证号:S Y X K(苏) 2022 0044㊂1.1.3主要试剂及仪器产气荚膜梭菌测定用培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司;血平板购自恒晨微生物实验器材;T a K a R a16Sr D N A B a c t e r i a lI d e n t i f i c a t i o n P C R K i t㊁200b p D N A L a d d e r(D y eP l u s)㊁P C R预混酶均购自北京宝日医生物技术有限公司;50ˑT A E㊁琼脂糖均购自北京全式金生物技术有限公司;药敏片购自杭州微生物有限公司㊂恒温培养箱(D N P-9022)购自上海精宏实验设备有限公司;显微镜(D M500)购自徕卡微系统有限公司;P C R扩增仪(T100t h e r m a l c y c l e r)和凝胶成像系统(C h e m i D o cX R S+)均购自B i o-R a d公司㊂1.2方法1.2.1病原分离及鉴定无菌取病变组织,划线9921中国畜牧兽医51卷接种于产气荚膜梭菌测定用平板,厌氧条件下37ħ培养24h,挑取黑色单菌落纯化培养二代后进行染色㊁镜检㊂1.2.2分离菌16S r R N A基因P C R检测及测序将纯培养的单个菌落加入20μL灭菌d d H2O中, 100ħ煮沸10m i n后取5μL液体为模板进行16S r R N A基因P C R检测㊂参考16S r D N AB a c t e r i a l I d e n t i f i c a t i o nP C R K i t说明书进行鉴定㊂上游引物:5'-G A G C G G A T A A C A A T T T C A C A G G-3';下游引物:5'-C G C C A G G G T T T T C C C A G T C A C G A C-3',预期扩增片段大小为500b p左右㊂P C R扩增体系25μL:上㊁下游引物(20p m o l/μL)各0.25μL,P C R P r e m i x12.5μL,模板5μL,d d H2O7μL;阳性对照取1μL的P o s i t i v eC o n t r o lD N A作为模板㊂P C R 扩增程序:94ħ预变性5m i n;94ħ变性1m i n, 55ħ退火1m i n,72ħ延伸1.5m i n,共35个循环; 72ħ延伸10m i n㊂P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测㊂将含目的条带的产物送深圳华大基因有限公司测序,测序结果在N C B I数据库中进行B L A S T比对,并利用M e g a X软件构建系统进化树㊂1.2.3毒素分型鉴定根据F o r t i等[10]方法合成毒素基因鉴定引物,引物信息见表1㊂P C R扩增体系25μL:2ˑT a q M a s t e rM i x12.5μL,上㊁下游引物(10μm o l/L)各0.5μL,D N A模板5μL, d d H2O6.5μL㊂P C R反应程序:94ħ预变性10m i n;94ħ变性45s,退火(温度见表1)45s, 72ħ延伸1m i n,共30个循环;72ħ延伸10m i n㊂P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.2.4致病性试验采用随机方法将30只小鼠分为10组,每组3只㊂将鉴定为阳性的产气荚膜梭菌作为接种菌株,其中9组为试验组,1组为对照组㊂试验组腹腔注射0.5m L过夜培养菌液约1ˑ108C F U/m L,对照组腹腔注射0.5m L灭菌P B S㊂隔离饲养1周,观察并记录小鼠发病㊁死亡情况,剖检试验组小鼠并做细菌分离鉴定㊂1.2.5药敏试验选取药敏纸片通过K-B纸片法测定分离菌株的耐药性,37ħ厌氧培养24h后测量抑菌圈直径大小,参照美国临床和实验室标准协会(C L S I)制定的药敏标准[11]判定分离株对30种药物的敏感性㊂1.2.6耐药基因P C R扩增参考文献[12-13],由生工生物工程(上海)股份有限公司合成耐药基因鉴定引物,耐药基因P C R反应体系及条件同1.2.2,退火温度见表2㊂P C R产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测㊂表1毒素基因引物信息T a b l e1I n f o r m a t i o no f p r i m e r s f o r t o x i n g e n e基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')片段大小F r a g m e n t s i z e/b p退火温度A n n e a l i n g t e m p e r a t u r e/ħc p a F:G T T G A T A G C G C A G G A C A T G T T A A G40254R:C A T G T A G T C A T C T G T T C C A G C A T Cc p b F:A C T A T A C A G A C A G A T C A T T C A A C C23651R:T T A G G A G C A G T T A G A A C T A C A G A Ce t x F:A C T G C A A C T A C T A C T C A T A C T G T G54153R:C T G G T G C C T T A A T A G A A A G A C T C Ci a p F:G C G A T G A A A A G C C T A C A C C A C T A C31754R:G G T A T A T C C T C C A C G C A T A T A G T Cc p e F:G G G G A A C C C T C A G T A G T T T C A50651R:A C C A G C T G G A T T T G A G T T T A A T Gc o n s-c p b2F:C A A G C A A T T G G G G G A G T T T A20050R:G C A G A A T C A G G A T T T T G A C C Aa t y-c p b2F:A G G A A T T C A C A A A A T G A A T A C A G T T A A A G C A A A T G75054R:G T G A T G A T G A C C G G T A T A A C A A T A A C C C T Cn e t B F:C T T C T A G T G A T A C C G C T T C A C73851 R:C G T T A T A T T C A C T T G T T G A C G A A A G00313期黄紫贝等:肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析表2耐药基因引物信息T a b l e2I n f o r m a t i o no f p r i m e r s f o r d r u g r e s i s t a n c e抗菌药A n t i b a c t e r i a l s基因G e n e s引物序列P r i m e r s e q u e n c e s(5'ң3')扩增大小P r o d u c tl e n g t h/b p退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħβ-内酰胺类b l a C T X-M F:T T T G C G A T G T G C A G T A C C A G T A A54359β-l a c t a m i d e s R:C G A T A T C G T T G G T G G T G C C A T Ab l a S H V F:A T G C G T T A T A T T C G C C T G T G75357R:T G C T T T G T T A T T C G G G C C A Ab l a T E M F:A T G A G T A T T C A A C A T T T C C G T86148R:T T A C C A A T G C T T A A T C A G T G A磺胺类s u l1F:C T T C G A T G A G A G C C G G C G G C43765 S u l f o n a m i d e s R:G C A A G G C G G A A A C C C G C G C Cs u l2F:G C G C T C A A G G C A G A T G G C A T T28570R:G C G T T T G A T A C C G G C A C C C G Ts u l3F:A G A T G T G A T T G A T T T G G G A G C44360R:T A G T T G T T T C T G G A T T A G A G C C T氨基糖苷类a a c(6')/a p h(2ᵡ)F:C C A A G A G C A A T A A G G G C A T A22055 A m i n o g l y c o s i d e s R:C A C T A T C A T A A C C A C T A C C Ga p h(3')-Ⅲ-F F:G C C G A T G T G G A T T G C G A A A A29254R:G C T T G A T C C C C A G T A A G T C Aa n t(4',4ᵡ)F:G C A A G G A C C G A C A A C A T T T C16954R:T G G C A C A G A T G G T C A T A A C C大环内酯类e r m(A)F:T C T A A A A A G C A T G T A A A A G A A59450 M a c r o c y c l i c R:C T T C G A T A G T T T A T T A A T A T T A G Tl a c t o n e s e r m(B)F:G A A A A G G T A C T C A A C C A A C T A61650R:G T A A C G G T A C T T A A A T T G T T T A Ce r m(C)F:C G T C A A T T C C T G C A T G T T T T A A G56457R:T T G A A A T C G G C T C A G G A A A A G四环素类t e t M F:A G T G G A G C G A T T A C A G A A15455 T e t r a c y c l i n e s R:C A T A T G T C C T G G C G T G T C T At e t A(P)F:A T G G T T A A T A A A C T T T C A G126347R:T T A A T T A T T T T C T T C A T A A T Ct e t B(P)F:A T G A A G A A A A T A A T T A A T A T A G G195947R:T T A A T C T C T A A T T G C G T T Tt e t(L)F:A T A A A T T G T T T C G G G T C G G T A A T107750R:A A C C A G C C A A C T A A T G A C A A T G A Tt e t(K)F:T T A T G G T G G T T G T A G C T A G A A A38250R:A A A G G G T T A G A A A C T C T T G A A At e t(O)F:A C G G A R A G T T T A T T G T A T A C C17158R:T G G C G T A T C T A T A A T G T T G A Ct e t P(B)F:A A A A C T T A T T A T A T T T A T A A C16946R:T G G A G T A T C A A T A A T A T T C A Ct e t(W)F:G A G A G C C T G C T A T A T G C C A G C16864R:G G G C G T A T C C A C A A T G T T A A C1031中国畜牧兽医51卷续表抗菌药A n t i b a c t e r i a l s 基因G e n e s引物序列P r i m e r s e qu e n c e s (5'ң3')扩增大小P r o d u c tl e n g t h /b p退火温度A n n e a l i n gt e m pe r a t u r e /ħ喹诺酮类q n r S F :A C A T A A A G A C T T A A G T G A T C 61955Q u i n o l o n e sR :C A A T T A G T C A G G A T A A A Ca a c (6')-ⅠbF :T TG C G A T G C T C T A T G A G T G G C T A 48255R :C T C G A A T G C C T G G C G T G T T T 氟苯尼考f l o R F :A A C C C G C C C T C T G G A T C A A G T C A A 59055F l u f e n i c o l R :G C A C C A G C C C C A A C G A A A C C A G T A林可霉素类l n u (A )F :G G T G G C T G G G G G G T A G A T G T A T T A A C T G G 32354L i n c o m yc i n R :G C T T C T T T T G A A A T A C A T G G T A T T T T T C G A T C l n u (B )F :C C T A C C T A T TG T T T G T G G A A90645R :A T A A C G T T A C T C T C C T A T T C2 结果2.1 临床症状及剖检病变剖检病死鸡可见腺胃点状出血,肝脏肿大呈砖红色,表面见有粟粒至黄豆大的黄色或灰白色坏死灶,肺脏及肠道有明显出血点(图1)㊂A ,腺胃点状出血;B ,肝脏坏死;C ,肠道出血;D ,肺脏出血A ,P u n c t a t eh e m o r r h a g e i n t h e g l a n d u l a r s t o m a c h ;B ,N e c r o t i c l i v e r ;C ,H e m o r r h a g e i n i n t e s t i n a l ;D ,H e m o r r h a g e i n l u n g s 图1 病死鸡剖检结果F i g .1 N e c r o p s y re s u l t s of t h e d e a d c h i c k e n 2.2 细菌分离培养及染色镜检于37ħ培养箱中厌氧培养24h 后,产气荚膜梭菌测定用平板长出黑色㊁湿润㊁边缘整齐㊁圆形隆起的菌落;挑取纯培养物进行革兰染色,镜检为阳性大杆菌(图2),共获得9株分离菌㊂图2 分离菌株菌落形态(A )与革兰染色镜检(B ,1000ˑ)F i g .2 C o l o n y m o r p h o l o g y (A )a n dG r a ms t a i n i n g m i c r o s c o p y (B ,1000ˑ)o f t h e i s o l a t e d s t r a i n s 20313期黄紫贝等:肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析2.3 细菌16S r R N A 鉴定及毒素分型16S r R N AP C R 结果显示,划线纯培养的菌落于600b p 处出现特异性扩增条带(图3),与预扩增片段大小相符㊂经测序及与G e n B a n k 中已有序列进行B L A S T 比对发现,9株分离菌与产气荚膜梭菌的相似性均在99%以上,说明本试验分离的9株细菌皆为产气荚膜梭菌,分别命名为6-2肺脏㊁6-2脾脏㊁8-2肺脏㊁8-2肝脏㊁8-2脾脏㊁5-2肝脏㊁5-2脾脏㊁8-2盲肠和9-2肺脏( - 前后的数字分别表示鸡的编号及分离菌传代次数)㊂将9株分离菌序列提交至N C B I ,获得登录号,见表3;利用P C R 法对9株分离菌株毒力基因的检测,结果显示,5株分离株c p a 基因检测为阳性,为A 型;2株c p a 和c pe 基因检测为阳性,为F 型;2株c p a 和i o t a 基因检测为阳性,为E 型(表3)㊂M ,200b p D N A L a d d e r (D y eP l u s );P ,阳性对照(600b p );1~9,分离菌株M ,200b p D N AL a d d e r (D y eP l u s );P ,P o s i t i v ec o n t r o l ;1-9,I s o l a t e db a c t e r i a图3 分离菌16S r R N A 基因P C R 扩增电泳图F i g .3 P C Ra m p l i f i c a t i o ne l e c t r o p h o r e s i so f16Sr R N A g e n e o f t h e i s o l a t e d s t r a i n s表3 细菌分离鉴定及毒素分型结果T a b l e 3 R e s u l t s o f b a c t e r i a l i d e n t i f i c a t i o na n d t o x i n t y p i n g 分离菌I s o l a t e s毒素型T y pe of t o x i n G e n B a n k 登录号G e n B a n k a c c e s s i o nN o .6-2肺脏6-2l u n g F O N 1260126-2脾脏6-2s p l e e n A O N 1261658-2肺脏8-2l u n g A O N 1262098-2肝脏8-2l i v e r A O N 1262108-2脾脏8-2s p l e e n E O N 1262145-2肝脏5-2l i v e rE O N 1262155-2脾脏5-2s p l e e n A O N 1262168-2盲肠8-2c a e c u mF O N 1262179-2肺脏9-2l u n gA O N 1262182.4 分离菌株16S r R N A 基因序列系统进化树运用M e gaX 软件对测序结果构建系统进化树,由图4可知,分离株O N 126215㊁O N 126216㊁O N 126217和O N 126218与中国猪源(G e n B a n k 登录号:K X 094441.1)㊁日本人源(G e n B a n k 登录号:L C 515570.1)㊁巴基斯坦鸡源(G e n B a n k 登录号:MN 365136.1)㊁中国北京人源(G e n B a n k 登录号:K P 944154.1)㊁美国猪源(G e n B a n k 登录号:J Q 607422.1)产气荚膜梭菌亲缘性较近;分离株O N 126165㊁O N 126012㊁O N 126209㊁O N 126210和O N 126210与南非鸡源(G e n B a n k 登录号:O R 494055)产气荚膜梭菌具有较近的亲缘性;分离株与印度鸡源产气荚膜梭菌(G e n B a n k 登录号:K J 787651.1)亲缘性较远㊂图4 基于16S r R N A 基因序列的遗传进化树F i g .4 P h y l o g e n e t i c t r e e b a s e do n16S r R N A g e n e s e qu e n c e s 2.5 致病性试验除对照组小鼠外,其余小鼠均在1周内全部死亡,其中分离株O N 126210攻毒的小鼠48h 内全部死亡㊂将病变组织进行细菌分离后,通过16S r R N A 测序确定与之前分离株序列一致㊂2.6 药敏试验和耐药基因的P C R 扩增结果9株产气荚膜梭菌对抗菌药物呈现不同程度耐3031中国畜牧兽医51卷药,药敏试验显示,9株菌对氨基糖苷类如丁胺卡那㊁庆大霉素㊁卡那霉素㊁新霉素等,四环素类及部分喹诺酮类抗菌药耐药率可达100%,对大环内酯类和头孢类抗菌药也大部分敏感(表4)㊂耐药基因结果显示,9株菌大环内酯类e r m (B )的携带率最高(77.8%),其次为四环素类t e t A (P )(55.6%)和t e t B (P )(66.7%)基因,而氨基糖苷类a n t (4',4ᵡ)和大环内酯类e r m (A )基因未检出㊂表4 产气荚膜梭菌分离株耐药谱及耐药基因检测结果T a b l e 4 D r u g r e s i s t a n c e p r o f i l e s a n d r e s i s t a n c e g e n e d e t e c t i o n r e s u l t s o f C l o s t r i d i u m p e r f r i n g e n s i s o l a t e d s t r a i n s 菌株号S t r a i nN o .耐药谱D r u g re s i s t a n c e p r of i l e s 基因谱G e n e p r o f i l e s O N 126215P +O X+C B +P I P +C Z +C X M+C A Z +C T R+C F P +N O R+O F X+V A+P B +F Z +C b l a C T X -M ㊁b l a S H V ㊁s u l 2㊁a a c (6')/a p h (2ᵡ)㊁a ph (3')-Ⅲ-F ㊁e r m (B )㊁e r m (C )㊁t e t B (P )㊁a a c (6')-ⅠbO N 126216P +O X+AM+C B+P I P+C A+C Z+R A D+C X M+C A Z +C T R+C F P +N O R+O F X+C I P +V A+F Z +C s u l 1㊁a ph (3')-Ⅲ-F ㊁e r m (B )㊁t e t M ㊁t e t B (P )㊁t e t (K )㊁q n r S ㊁f l o r O N 126012P +O X+AM+C B +C A+C Z +R A D+C X M+C A Z +C T R+C F P +N O R+O F X+C I P +V A+F Z +C b l a T E M ㊁s u l 2㊁s u l 3㊁a a c (6')-Ⅰb ㊁f l o r O N 126165P +C Z +R A D+C X M+C A Z +C T R+C F P +P B +C t e t A (P )㊁t e t (O )㊁t e t M ㊁l n u (B )O N 126209C Z +C X M+C A Z +C T R+C F P +O F Xa a c (6')/a ph (2ᵡ)㊁e r m (B )O N 126210P +O X+AM+C B +P I P +C Z +C X M+C A Z +C T R+C F P +N O R+O F X+C I P +V A+P B +Ce r m (B )㊁t e t A (P )㊁t e t B (P )㊁t e t P (B )㊁q n r S ㊁l n u (B )O N 126214P +O X+AM +C B+C Z+C X M +C A Z+C T R+C F P +N O R+O F X+V A+P B +C b l a C T X -M ㊁b l a S H V ㊁b l a T E M ㊁e r m (B )㊁e r m (C )㊁t e t M ㊁t e t A (P )㊁t e t B (P )㊁t e t (L )㊁t e t P (B )㊁t e t (W )㊁q n r S ㊁a a c (6')-Ⅰb ㊁l n u (B )O N 126217P +O X+AM +P I P+C A +C Z+R A D+C X M +C A Z +C T R+C F P e r m (B )㊁t e t A (P )㊁t e t B (P )㊁t e t P (B )㊁fl o r O N 126218P +O X+AM+C B+P I P+C A+C Z+R A D+C X M+C A Z +C T R+C F P +N O R+O F X+V A+Ce r m (B )㊁t e t A (P )㊁t e t B (P )㊁t e t P (B )P ,青霉素;O X ,苯唑西林;AM ,氨苄西林;C B ,羧苄西林;P I P ,哌拉西林;C A ,头孢氨苄;C Z ,头孢唑啉;R A D ,头孢拉定;C X M ,头孢呋辛;C A Z ,头孢他啶;C T R ,头孢曲松;C F P ,头孢派酮;A K ,丁胺卡那;GM ,庆大霉素;K ,卡那霉素;N ,新霉素;T E ,四环素;D X ,多西环素(强力霉素);M I ,米诺环素;E ,红霉素;M D ,麦迪霉素;N O R ,诺氟沙星;O F X ,氧氟沙星;C I P ,环丙沙星;V A ,万古霉素;P B ,多黏菌素B ;S X T ,复方新诺明;F Z ,呋喃唑酮;C ,氯霉素;C C ,克林霉素P ,P e n i c i l l i n ;O X ,O x a c i l l i n ;AM ,A m p i c i l l i n ;C B ,C a r b e n i c i l l i n ;P I P ,P i p e r a c i l l i n ;C A ,C e ph a l e x i n ;C Z ,C e f a z o l i n ;R A D ,C e f r a d i n e ;C X M ,C e f u r o x i m e ;C A Z ,C e f t a z i d i m e ;C T R ,C e f t r i a x o n e ;C F P ,C e f o p e r a z o n e ;A K ,A m i k a c i n ;GM ,G e n t a m i c i n ;K ,K a n a m yc i n ;N ,N e o m y c i n ;T E ,T e t r a c y c l i n e ;D X ,D o x y c y c l i n e ;M I ,M i n o c y c l i n e ;E ,E r y t h r o m y c i n ;M D ,M ide a m y c i n ;N O R ,N o rf l o x a c i n ;O F X ,O f l o x a c i n ;C I P ,C i p r o f l o x a c i n ;V A ,V a n c o m y c i n ;P B ,P o l y m y x i nB ;S X T ,C o -t r i m o x a z o l e ;F Z ,F u r a z o l i d o n e ;C ,C h l o r a m ph e n i c o l ;C C ,C l i n d a m yc i n 3 讨论产气荚膜梭菌为食源性病原体,是医学㊁兽医和食品领域的重要微生物㊂该细菌可产多种毒素和细菌素,引起动物亚临床疾病,对家禽业产生巨大的损失[14-16]㊂据了解,目前美国第二常见的食源性疾病是由产气荚膜梭菌A 型引起的[17],造成禽坏死性肠炎的产气荚膜梭菌也多为A 型[18]㊂E 型产气荚膜梭菌与兔子和其他动物的肠炎有关[19],与ι毒素同源的肉毒梭菌产生的C 2毒素曾被报道可引起水鸟致死性腹泻[20]㊂F 型产气荚膜梭菌中肠毒素(C P E )主要导致人类食物中毒和非食源性腹泻,由于2018年才将产C P E 的A 型产气荚膜梭菌归类为F 型,因此有关禽类感染F 型产气荚膜梭菌的相关报道较少㊂本研究中病死鸡肠道有明显的出血点,从病死鸡的肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁肠道内容物中经厌氧培养分离出9株产气荚膜梭菌,通过毒素分型确定为5株A 型㊁2株E 型㊁2株F 型,以往鲜见一次病例暴发分离出多个毒素型产气荚膜梭菌的报道㊂动物致病性试验表明,9株分离株均对小鼠具有致病性,其中O N 126210分离株毒性较强,攻毒的小鼠48h 内全部死亡㊂推测分离的产气荚膜梭菌为引起本次暴发的病原菌㊂兽医临床上常用抗菌素对病畜禽进行治疗,抗生素的长期使用可能诱导抗性菌株的产生,造成了定向筛选问题[21]㊂这些菌株会随着分泌物㊁排泄物等在自然界扩散,P a r k 等[22]研究表明,耐药性在从40313期黄紫贝等:肉鸡源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析鸡体中分离的菌株中最常见,其次是从土壤㊁临床样本和食物中分离的菌株㊂四环素耐药是产气荚膜梭菌耐药中较为常见的耐药表型㊂综合欧美各地药物敏感性报告[23-26],张仕泓等[5]发现,分离菌株对氨基糖苷类药物(如链霉素和庆大霉素)㊁大环内酯类药物(如红霉素)耐药情况较为严重㊂本研究中药敏试验也可发现,产气荚膜梭菌已对部分抗菌药产生强耐药,其中对氨基糖苷类㊁四环素类和部分喹诺酮类抗菌药耐药率可达100%,对大环内酯类如麦迪霉素耐药率达89%,红霉素耐药率达78%,由此可得本次分离菌株多重耐药性非常严重㊂产气荚膜梭菌中的红霉素抗性常常被e r m(Q)基因所介导,但也能被e r m(B)基因介导,与可移动元件相关,能在种属间进行传播[27]㊂t e t A(P)基因是最常见的四环素(t e t)抗性基因,四环素抗性(T c r)的产气荚膜梭菌100%携带t e t A(P)基因,t e t B(P)与t e t A(P)基因重叠,且与t e t A(P)基因相关[28]㊂本研究分离菌耐药性试验结果显示,多数分离株对红霉素耐药,且耐药基因检测结果表明分离株含多种耐药基因,包括大环内酯类e r m(B)(77.8%)和四环素类t e t A(P) (55.6%)㊁t e t B(P)(66.7%)㊂这一结果与吴立婷等[27]研究结果相似,提示大环内酯类耐药基因已在禽类广泛存在[29],产气荚膜梭菌的多重耐药性将会严重威胁人类和动物健康㊂抗生素的滥用导致耐药产气荚膜梭菌强毒株不断出现,家禽坏死性肠炎的发病率逐年上升[30-31],因此,有必要对产气荚膜梭菌耐药的发生及传播机制进行深入研究,为今后临床合理用药和新药研发提供依据和参考㊂4结论本试验确诊了某鸡场产气荚膜梭菌感染,并从同一只病死鸡不同样本中分离出2或3种毒素型产气荚膜梭菌㊂分离菌株含多种耐药基因且对氨基糖苷类㊁四环素类及部分喹诺酮类抗菌药具有较强的耐药性,本研究结果可为进一步防控鸡产气荚膜梭菌病提供参考㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1]陆承平.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,2012.L U CP.V e t e r i n a r y M i c r o b i o l o g y[M].B 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A型产气荚膜梭菌α毒素基因表达及其免疫保护作用的初步研究

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作者简介：许崇波（1;"% @ ），男，山东五莲人，博士，教授，主要从事微生物学、分子生物学及基因工程等领域的研究工作。接受日期：修回日期：收稿日期： #$$A01$0$;； #$$A01101%； #$$"0$10##
重组菌株毒性的测定将重组菌株 ;/@B （ ).D ）（ 9E.F,>@ ）的培养上清、菌体及菌体裂解物以及 , 型产气荚膜梭菌标准观察株 M8<*B 培养上清分别接种卵黄琼脂平板上，然后再分别经口服或腹腔注射有无磷脂酶 M 活性， O （ ).D）（ 9E.F,>@），共计 K> 8 N B> 个重组菌株 ;/@B 只小鼠，观察和剖检有无临床症状和病理变化。 !"< 重组菌株包涵体粗提物免疫攻毒试验按文献［?］的方法制备包涵体粗提物和免疫用随机分为 @ 组，每组 ?> 只，一抗原。取 B’> 只小鼠，组用包涵体抗原腹腔免疫 >=@A/H 只，另一组用灭活间隔 BKP 后，以上述方菌体抗原腹腔免疫 >=@A/H 只，法进行第二次免疫， BKP 后进行攻毒试验。按文献［O］的方法制备 , 型产气荚膜梭菌标准株 M8<*B 类毒素免疫用抗原，腹腔注射含 B>C 氢氧化铝胶的标准株 M8<*B 类毒素 >=8A/，作为免疫对照组，同时设立生理盐水对照组。将过夜培养的标准株 M8<*B 培观养上清作倍比稀释，每个剂量腹腔注射小鼠 ’ 只，察小鼠死亡情况；用 B!/) 标准株 M8<*B 培养上清攻击免疫小鼠，观察小鼠的存活情况。 !"8

青海省科学技术厅关于下达青海省二〇二二年第一批科技计划项目的通知

青海省科学技术厅关于下达青海省二〇二二年第一批
科技计划项目的通知
文章属性
•【制定机关】青海省科学技术厅
•【公布日期】2022.02.24
•【字号】青科发规〔2022〕9号
•【施行日期】2022.02.24
•【效力等级】地方规范性文件
•【时效性】现行有效
•【主题分类】科技计划
正文
青海省科学技术厅关于下达青海省二〇二二年第一批科技计
划项目的通知
各有关单位：
现将《青海省二〇二二年结转科技项目经费计划》《青海省二〇二二年新开科技计划项目》下达给你们，本批计划包括科技项目228项，本年度拟资助经费34391.26万元。

其中，结转科技项目132项，当年资助14688.74万元；新开科技项目96项，当年资助19702.52万元。

请接此通知后，加快推进项目的组织实施工作，按已下达的经费预算于30日内完成项目合同书签定，逾期未签定合同将予以撤项。

附件：1. 青海省二〇二二年结转科技项目经费计划
2. 青海省二〇二二年新开科技计划项目
附件
1.青海省二○二二年结转科技项目经费计划。

致人腹泻产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型

致人腹泻产气荚膜梭菌的分离鉴定与基因分型摘要：目的：探讨产气荚膜梭菌与食物中毒之间的联系。

方法：采集腹泻病人的粪便样品，进行生化鉴定和细菌分离培养，设计针对cpa、cpb、etx、iA、cpe及cpb2序列的6对特异引物，并采用多重PCR方法，对产气荚膜梭菌进行基因分型。

结果：50份样品中，分离出10株产气荚膜梭菌，且均为A型，其中5株扩增cpb2基因。

结论：产气荚膜梭菌是导致人类发生腹泻的主要病原菌，而重要的致病因子可能是其β2毒素。

关键词：致人腹泻；产气荚膜梭菌；多重PCR；基因分型气荚膜梭菌在自然界中广泛存在，其是人兽皆可感染的病原菌[1]。

由于气荚膜梭菌是人与动物肠道内的常见菌，因此其为引发人类腹泻与食物中毒的一个重要诱因。

为了对气荚膜梭菌进行深入的研究，我们对腹泻病人的临床样品进行病原的分离鉴定与基因分型，以对引起食物中毒和腹泻的状况进行分析。

现报道如下。

1.资料和方法1.1一般资料采集腹泻病人的临床粪便样品共计50份，不同个体的粪便样品分开收集，并标注编号以区分不同病患的样品。

1.2气荚膜梭菌的分离鉴定取6g粪便样品，加入灭菌生理盐水50mL，以1000r/min速度搅拌充分后，离心10min，取上清液1mL接种10mL的紫牛乳培养液，送入厌氧培养罐进行43℃厌氧培养9-12h。

对出现爆裂发酵的培养液，划线于TSC平板后，进行43℃厌氧培养24h，挑选疑似菌落进一步分离纯化。

挑选平板上黑色菌落接种接种鲜血琼脂平板，经厌氧培养24h后，挑选出现双环溶血的菌落，进一步采用标准化试剂盒进行生化鉴定。

1.3菌株的基因分型1.3.1PCR引物设计根据产气荚膜梭菌毒素基因序列设计的引物序列见表1。

1.3.2多重PCR扩增在反应体系中加入缓冲液、混合引物、灭菌超纯水，DNA模板10μL，TaqDNA 聚合酶1μL，以50μL灭菌石蜡油覆盖。

反应程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。

羊产气荚膜梭菌的分离鉴定

一株羊源产气荚膜梭菌的分离及鉴定金铎*1,2，林家琪1,2，董真1,2，展天松1,2，顾敏1,2，焦库华1,2，王彦红*1,2，刘文博*，1,2（1，扬州大学兽医学院, 扬州，江苏， 225009；2，江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，扬州，江苏，225009；）摘要：2013年4月，扬州大学动物医院畜禽门诊接诊一例山羊急性死亡的病例，对其进行剖检，无菌恒温厌氧分离培养，纯化鉴别，革兰氏染色，生化反应，结果表明为产气荚膜梭菌，并对此进行了一定的讨论关键词：产气荚膜梭菌；分离；鉴定。

产气荚膜梭菌旧名魏氏梭菌，产气荚膜杆菌，根据致死性毒素与其抗毒素的中和实验，将此菌分为A、B、C、D、E 5个类型，以菌体抗原进行血清型分类意义不大，菌体抗原与毒素分型之间没有明显关系，毒素至少已经发现15种，其中α、β、ε、ι、δ、θ、κ、λ、μ、υ、CPE、其他毒素、神经氨酸酶等。

A型、C型、D型的某些菌株可以产生肠毒素，A型产气荚膜梭菌主要引起动物的气性坏疽，牛、羔羊、新生羊驼、驯鹿、仔猪、家兔的肠毒血症，B型菌主要引起羔羊痢疾，还可以引起犊牛、羔羊、山羊的肠毒血症或坏死性肠炎，C型菌是绵羊猝狙的病原。

D型、E型菌也是导致牛羊肠毒血症和猪的腹泻[1]。

笔者结合相关知识，在此整理于扬州大学动物医院所见的一例羊源产气荚膜梭菌感染的疾病。

1材料与方法1.1病料来源2013年4月，江苏某养殖户饲养的240多只母山羊陆续产羔，羔羊在产后24-48小时开始出现剧烈腹泻，拉水样黑色稀粪，虚弱，随后死亡，羔羊的死亡率达60%。

剖检后发现病死羊羔严重脱水，真胃和大肠内容物呈糊状，小肠壁变薄，或黄或黑，透明，充满空气，部分肠道黏膜充血出血，卡他性出血性炎症,*基金项目：江苏高校优势学科建设工程；江苏省大学生创新训练计划省级重点项目（201311117039Z）作者简介：金铎（1992—），男，山东青岛人，扬州大学兽医学院本科生，主要从事羊临床菌株耐药性及质粒指纹图谱分析研究。

1株青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌基因分型及cpa基因生物信息学分析

1株青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌基因分型及cpa基因生物信息学分析青海高原是中国重要的生态环境和畜牧业区域，其中青海牦牛是该地区的特有牛种，也是青海高原牧区重要的经济资源。

但是，青海牦牛在饲养过程中常常出现腹泻现象，严重影响着养殖效益。

而且在一些牲畜中发现了由腹泻产气荚膜梭菌引起的疾病，对青海牦牛的健康也构成威胁。

因此，深入研究青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌的基因分型及其cpa基因在生物信息学方面的分析，对于揭示该菌株的毒力机制以及对青海牦牛的影响具有重要意义。

本研究旨在通过分子生物学和生物信息学的手段，对该菌株的遗传多样性、毒力因子和亲缘关系进行综合分析，以期为青海牦牛腹泻的防控提供科学依据。

首先，我们采集了青海牦牛腹泻患牛的粪便样品，从中筛选出青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌菌株。

通过细菌培养和基因测序技术，我们成功获得了该菌株的全基因组序列。

接着，我们对该菌株的基因组进行了基因分型分析。

利用多重序列比对和聚类分析方法，我们对菌株的核心基因进行了分类，并构建了菌株之间的系统进化树，揭示了这些菌株的遗传变异情况。

在进一步的分析中，我们注重了腹泻产气荚膜梭菌的毒力因子研究。

我们通过生物信息学方法预测了腹泻产气荚膜梭菌的编码基因中的潜在毒力因子，重点关注了cpa基因。

通过cpa基因的序列比对和结构预测，我们探究了其在菌株中的多态性及其功能。

结果显示，不同菌株的cpa基因序列存在着一定的差异，并且这些差异可能和不同菌株的毒力水平有关。

此外，我们进一步对cpa基因的编码蛋白进行了功能注释和互作网络分析，以期揭示其在菌株中的作用机制。

攻克了以上分析，为了更好地了解腹泻产气荚膜梭菌与青海牦牛的关系，我们还进行了菌株与牦牛宿主的共进化分析。

通过比对菌株基因组和牦牛基因组的差异，我们发现了一些与菌株适应性和宿主发育相关的基因。

这些发现有助于进一步探索腹泻产气荚膜梭菌的宿主特异性以及其对青海牦牛的致病机制。

总之，通过对青海牦牛腹泻产气荚膜梭菌基因分型及其cpa基因的生物信息学分析，我们揭示了该菌株的遗传多样性、毒力因子及菌株与牦牛之间的共进化关系。

产气荚膜梭菌α-毒素基因数字PCR方法的建立及其在标准物质研制方面的应用

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(１):１５６~１６３ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０１.０２１收稿日期:２０２３－０２－２１基金项目:国家重点研发计划项目(２０２２ＹＦＤ１３０１００３ꎬ２０２２ＹＦＣ２３０３９００)ꎻ山东省重点研发计划项目(２０２２ＣＸＧＣ０１０６０６－０１－０５)ꎻ中国动物卫生与流行病学中心创新基金项目单增李斯特菌等致病菌标准物质研究 (ＤＷ２０２１００１－１３)作者简介:张铭洋(１９９６ )ꎬ男ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事致病微生物研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｍｙ１９９６１２２７＠１６３.ｃｏｍ张喜悦(１９７４ )ꎬ男ꎬ河南鹤壁人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事致病微生物研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:Ｚｈａｎｇｘｉｙｕｅ＠ｃａｈｅｃ.ｃｎ∗共同第一作者通信作者:邹明(１９７４ )ꎬ男ꎬ山东龙口人ꎬ博士ꎬ教授ꎬ主要从事兽医药理与毒理学研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｚｏｕｄｎｅｔ＠１６３.ｃｏｍ王君玮(１９６８ )ꎬ男ꎬ山东临沂人ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ主要从事致病微生物研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:Ｗａｎｇｊｕｎｗｅｉ＠ｃａｈｅｃ.ｃｎ产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ方法的建立及其在标准物质研制方面的应用张铭洋１ꎬ２ꎬ张喜悦２ꎬ赵格２ꎬ曲志娜２ꎬ高宏伟３ꎬ孙敏３ꎬ程慧敏２ꎬ徐佳微２ꎬ王君玮２ꎬ邹明１(１.青岛农业大学动物医学院ꎬ山东青岛㊀２６６０００ꎻ２.中国动物卫生与流行病学中心ꎬ山东青岛㊀２６６０３２ꎻ３.青岛海关技术中心ꎬ山东青岛㊀２６６０００)㊀㊀摘要:产气荚膜梭菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ)是一种重要的人兽共患病原菌ꎬα－毒素是其分子生物学检测的主要靶标ꎮ试验选取Ｃｌｐｅｒ引物及探针建立微滴式数字ＰＣＲ(ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｔｉａｌＰＣＲꎬｄｄＰＣＲ)方法ꎬ最佳引物浓度０.８５μｍｏｌ/Ｌꎬ探针浓度为０.３μｍｏｌ/Ｌꎬ退火温度为６０ħꎮ利用建立的ｄｄＰＣＲ方法检测单核细胞增生李斯特菌㊁沙门氏菌㊁大肠杆菌㊁肠球菌㊁金黄色葡萄球菌㊁弯曲杆菌的ＤＮＡꎬ结果均为阴性ꎬ表明该方法具有较好的特异性ꎮ合成产气荚膜梭菌α－毒素基因ꎬ制成ＤＮＡ标准品ꎬ选取３个稀释梯度的标准品进行重复试验ꎬ组内和组间变异系数均小于５％ꎬ证明该方法具有较好的重复性ꎮ采用７个稀释梯度的标准品进行重复检测ꎬ计算出该方法的检测限为１２.３９ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ定量限为３３.９７ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎮ通过对６８份临床样品进行检测ꎬ证实该方法可用于临床ꎬ且用于检测质粒ＤＮＡ时无明显的基质效应ꎮ应用ｄｄＰＣＲ方法对标准品进行均匀性和稳定性检验ꎬ并联合９家实验室进行定值ꎬ最终获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(ＧＢＷ(Ｅ)０９１２３７)ꎮα－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法的建立和ＤＮＡ标准物的研制ꎬ为产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的标准化奠定了基础ꎮ关键词:产气荚膜梭菌ꎻｄｄＰＣＲꎻα－毒素基因ꎻ标准物质ꎻ特异性ꎻ灵敏度ꎻ可重复性ꎻ定值中图分类号:Ｓ８５２.６１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０１－０１５６－０８ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤｉｇｉｔａｌＰＣＲｆｏｒα￣ＴｏｘｉｎＧｅｎｅｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＲｅｆｅｒｅｎｃｅＭａｔｅｒｉａｌｓＺｈａｎｇＭｉｎｇｙａｎｇ１ꎬ２ꎬＺｈａｎｇＸｉｙｕｅ２ꎬＺｈａｏＧｅ２ꎬＱｕＺｈｉｎａ２ꎬＧａｏＨｏｎｇｗｅｉ３ꎬＳｕｎＭｉｎ３ꎬＣｈｅｎｇＨｕｉｍｉｎ２ꎬＸｕＪｉａｗｅｉ２ꎬＷａｎｇＪｕｎｗｅｉ２ꎬＺｏｕＭｉｎｇ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＱｉｎｇｄａｏＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６０００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｈｉｎａＡｎｉｍａｌＨｅａｌｔｈａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６０３２ꎬＣｈｉｎａꎻ３.ＱｉｎｇｄａｏＣｕｓｔｏｍｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｅｎｔｅｒꎬＱｉｎｇｄａｏ２６６０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｚｏｏｎｏｔｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｗｉｔｈα￣ｔｏｘｉｎｇｅｎｅａｓｍａｊｏｒｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔａｒｇｅｔ.ＡｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ(ｄｄＰＣＲ)ｍｅｔｈｏｄｗａｓｄｅｖｅｌｏｐｅｄｕｓｉｎｇＣｌｐｅｒｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅｗｉｔｈｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍｅｒａｎｄｐｒｏｂｅ０.８５ａｎｄ０.３μｍｏｌ/Ｌｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｎｄｔｈｅａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｓ６０ħ.ＴｈｅＤＮＡｏｆＬｉｓｔｅｒｉａꎬＳａｌｍｏｎｅｌｌａꎬＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉꎬＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓꎬＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｎｄＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｅｔｈｏｄꎬａｎｄａｌｌｒｅｓｕｌｔｓｗｅｒｅｎｅｇａｔｉｖｅꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｈａｄｇｏｏｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ.Ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｂａｓｅｄｏｎｔｈｒｅｅｄｉｌｕｔｉｏｎｔｉｔｅｒｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓｏｆｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄα￣ｔｏｘｉｎＤＮＡｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｖａｒｉａｔｉｏｎｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓｏｆｂｏｔｈｉｎｔｅｒ￣ａｎｄｉｎｔｒａ￣ｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｌｅｓｓｔｈａｎ５％ꎬｗｈｉｃｈｉｎｄｉｃａｔｅｄｇｏｏｄｒｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙ.Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙｄｅｔｅｃｔｉｎｇｓｅｖｅｎｄｉｌｕｔｉｏｎｔｉｔｅｒｓｏｆｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓꎬｗｈｉｃｈｗｅｒｅ１２.３９ａｎｄ３３.９７ｃｏｐｉｅｓ/μＬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.Ｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓｖｅｒｉｆｉｅｄｔｏｂｅａｐｐｌｉｅｄｉｎｃｌｉｎｉｃｂｙｄｅｔｅｃｔｉｎｇ６８ｃｌｉｎｉｃａｌｓａｍｐｌｅｓꎬａｎｄｈａｄｎｏｏｂｖｉ￣ｏｕｓｍａｔｒｉｘｅｆｆｅｃｔｗｈｅｎｕｓｅｄｆｏｒｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｄｅｔｅｃｔｉｏｎ.Ａｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ(ＧＢＷ(Ｅ)０９１２３７)ｈａｄｂｅｅｎｉｓｓｕｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｂｙｔｈｅＳｔａｔｅＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆＭａｒｋｅｔＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＡｄｍｉｎｉｓｔｒａ￣ｔｉｏｎａｆｔｅｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｂｙｔｈｅｄｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄａｎｄｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｆｉｘｅｄｖａｌｕｅｓｂｙ９ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ.ＯｖｅｒａｌｌꎬｔｈｅｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｔｈｅｄｄＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒα￣ｔｏｘｉｎｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤＮＡｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓｃｏｕｌｄｌａｙｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎｏｆｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔｓｆｏｒＣ.ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓꎻＤｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲꎻα￣ＴｏｘｉｎｇｅｎｅꎻＲｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌꎻＳｐｅｃｉｆｉｃｉ￣ｔｙꎻＳｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙꎻＲｅｐｅａｔａｂｉｌｉｔｙꎻＦｉｘｅｄｖａｌｕｅ㊀㊀微滴式数字ＰＣＲ(ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲꎬｄｄＰＣＲ)是近年来迅速发展起来的一项定量分析技术ꎬ能够实现对靶基因的精准定量检测ꎮ数字ＰＣＲ的概念由Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ等[１]首次提出ꎬ他们在检测大肠癌患者的Ｋ－ＲＡＳ基因突变时ꎬ进行了微升级的ＰＣＲ扩增ꎬ分别用不同荧光检测突变基因和正常基因ꎬ通过计算突变基因和正常基因的比例得出突变率ꎮ随着生物技术的不断发展与优化ꎬＰＣＲ技术从普通ＰＣＲ逐渐发展为荧光定量ＰＣＲꎬ目前的ｄｄＰＣＲ属于第三代ＰＣＲꎮｄｄＰＣＲ技术通过对样品进行微滴化处理ꎬ经ＰＣＲ扩增后对所有微滴进行逐个检测ꎬ有荧光信号的判读为１ꎬ无荧光信号的判读为０ꎬ再根据泊松分布原理和阳性微滴的数量与比例可得出目的分子的起始拷贝数ꎮ与传统ＰＣＲ及荧光定量ＰＣＲ相比ꎬｄｄＰＣＲ具有样本需求量低㊁绝对定量以及高灵敏度㊁高重复性㊁高耐受性等优势[２－４]ꎮ目前ꎬ该技术已广泛应用于转基因生物㊁致病菌㊁病毒㊁食品安全等领域ꎮ产气荚膜梭菌(Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ)广泛分布于土壤㊁污水㊁饲料和动物肠道中ꎬ可导致动物的坏死性肠炎㊁肠毒血症ꎬ以及人类的腹泻和食物中毒等疾病[１－２]ꎮ近年来ꎬ关于产气荚膜梭菌分子生物学诊断方法的报道较多ꎬ但多为传统的ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ方法ꎬ使用的靶基因均为α－毒素基因ꎮ随着产气荚膜梭菌分子生物学检测试剂的广泛应用ꎬ对标准物质研发的需求也越来越强烈ꎮ标准物质可以满足检测结果标准化的需求ꎬ因此ꎬ本研究旨在建立产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ检测方法ꎬ并应用于质粒标准物质的研发ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀供试菌株及样品产气荚膜梭菌(ＡＴＣＣ１３１２４)㊁单核细胞增生李斯特菌(ＡＴＣＣ１９１１１)㊁沙门氏菌(ＡＴＣＣ１４０２８)㊁大肠杆菌(ＡＴＣＣ２５９２２)㊁肠球菌(ＡＴＣＣ２９２１２)㊁金黄色葡萄球菌(ＡＴＣＣ２９２１３)㊁弯曲杆菌(ＡＴＣＣ３３５５９)均由国家兽医微生物菌(毒)种保藏中心动物卫生与流行病学分中心保存ꎮ产气荚膜梭菌阳性病料由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室保存ꎮ１.２㊀试剂和仪器ｄｄＰＣＲ探针法超预混液(不含ｄＵＴＰ)㊁微滴发生油购自北京汇力宏业生物科技有限公司ꎮα－毒素基因㊁引物和探针序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成ꎮ微滴式数字ＰＣＲ检测系统(伯乐ＱＸ２００ꎬ美国)ꎮ１.３㊀试验设计与方法１.３.１㊀ｄｄＰＣＲ方法的建立㊀参照Ｇｒａｕ－Ｒｏｍａ[５]㊁７５１㊀第１期㊀㊀张铭洋ꎬ等:产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ方法的建立及其在标准物质研制方面的应用Ｘｕ[６]等的方法分别合成２对引物和探针(表１)ꎮ分别使用上述２对引物建立ｄｄＰＣＲ方法并进行反应条件优化ꎮ引物和探针分别设置４个浓度梯度ꎬ其中１０μｍｏｌ/Ｌ引物加样量设置为:１.３㊁１.５㊁１.７㊁１.９μＬꎻ１０μｍｏｌ/Ｌ探针加样量设置为:０.３㊁０.６㊁０.９㊁１.２μＬꎮ退火温度设置为５６㊁５８㊁６０㊁６２ħꎮ通过比较ｄｄＰＣＲ的检测拷贝数㊁微滴生成数㊁微滴分布状态㊁微滴荧光信号的强度确定最佳反应条件ꎮ㊀㊀表１㊀ｄｄＰＣＲ引物与探针信息引物名称引物序列５－３第一对引物Ｃｌｐｅｒ－ＦＧＣＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＧＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＴＣｌｐｅｒ－ＲＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＣＴＴＴＴＴＧＡＧＡＧＴＴＡＧＣｌｐｅｒ－ＰＲＦＡＭ－ＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＧＴＡＡＣＴＴ－ＭＧＢ第二对引物Ｔｏｘ－ＦＡＡＧＡＡＣＴＡＧＴＡＧＣＴＴＡＣＡＴＡＴＣＡＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＴｏｘ－ＲＴＴＴＣＣＴＧＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴＴＣＣＴｏｘ－ＰＲＦＡＭ－ＴＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＧＡＴＧＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＡＧ－ＴＡＭＲＡ１.３.２㊀特异性㊁重复性㊁检出限和定量限试验㊀分别以产气荚膜梭菌㊁单核细胞增生李斯特菌㊁沙门氏菌㊁大肠杆菌㊁肠球菌和金黄色葡萄球菌的ＤＮＡ为模板ꎬ用产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法检测以评价其特异性ꎮ选取３个浓度梯度(１０１㊁１０２㊁１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)的标准品ＤＮＡ为模板ꎬ在间隔第７天和第１４天分别进行重复试验ꎬ每个浓度设３个重复ꎬ记录各次试验的拷贝数ꎬ并分析组内和组间的变异系数ꎬ以检测该方法的重复性ꎮ参考«分析方法检出限和定量限的评估»(ＧＢ/Ｔ２７４１５２０１３)[７]中的方法进行检出限(ＩＤＥ)和定量限(ＩＱＥ)的测定ꎮ以７个浓度梯度(１０－１㊁１００㊁１０１㊁１０２㊁１０３㊁１０４㊁１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)的产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒标准品ＤＮＡ为模板ꎬ每个梯度重复检测９次ꎬ用产气荚膜梭菌α－毒素基因的ｄｄＰＣＲ方法对其扩增ꎬ评估方法的检出限㊁定量限和动态范围ꎮ１.３.３㊀ｄｄＰＣＲ方法的临床应用及基质效应评估㊀取实验室保存的６８份临床阳性病料ꎬ其中产气荚膜梭菌阳性病料３８份ꎬ沙门氏菌㊁大肠杆菌㊁肠球菌㊁单核细胞增生李斯特菌㊁金黄色葡萄球菌㊁弯曲杆菌阳性病料各５份ꎬ提取ＤＮＡ作为临床样本进行产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法鉴定ꎮ依据«基质效应与互通性评估指南»(ＷＳ/Ｔ３５６２０１１)[８]中的方法对制备的标准物质进行基质效应与互通性评估验证ꎮ选取产气荚膜梭菌临床阳性样本２０份ꎬ浓度在１０２~１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ间随机分布ꎮ准备５份制备样本ꎬ将制备样本与临床样本随机穿插排列ꎬ使用ｄｄＰＣＲ方法测定所有样本ꎮ１.３.４㊀候选标准物质的制备㊀通过ＮＣＢＩ网站Ｂｌａｓｔ比对ꎬ合成具有代表性的产气荚膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ基因(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＹ２７７７２４.１)片段ꎬ克隆至ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ质粒并转化Ｅ.ｃｏｌｉＴｏｐ１０感受态细胞ꎮ经扩大培养后提取质粒备用ꎮ应用ＫｐｎⅠ(ＮＥＢꎬ美国)对质粒进行线性化处理ꎬ反应体系为２μＬｃｕｔｓｍａｒｔ㊁３μＬＫｐｎⅠ㊁５μＬｄｄＨ２Ｏ㊁１０μＬ质粒(５３.６５ｎｇ/μＬ)ꎬ３７ħ水浴３ｈꎮ回收后的线性化质粒ꎬ稀释后分装作为候选标准物质ꎬ－８０ħ保存备用ꎮ１.３.５㊀候选标准物质的鉴定及检验㊀对产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒进行常规ＰＣＲ鉴定㊁双酶切和测序鉴定ꎬ并对其进行均匀性和稳定性检验ꎬ鉴定方法参照文献[９]进行ꎮ１.３.６㊀定值㊀选择９家具备认可资质的实验室ꎬ对候选标准物质进行联合定值ꎮ对测得的数据进行正态分布检验㊁组内可疑值检验㊁组间等精度检验以及各组平均值之间的ｔ检验ꎬ并计算样品的不确定度ꎬ对候选标准物质定值ꎬ并通过有证标准物质评估实验室定值的稳定性[７ꎬ９]ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ｄｄＰＣＲ方法的建立分别使用２对引物建立ｄｄＰＣＲ方法ꎬ结果Ｃｌｐｅｒ引物探针具有更好的特异性ꎬ故在本研究中ꎬ使用该引物探针进行目标基因的扩增ꎮ对引物和探针的浓度进行优化ꎬ结果１０μｍｏｌ/Ｌ引物的用量为１.７μＬ㊁１０μｍｏｌ/Ｌ探针的用量为０.６μＬꎬ即反应浓度分别为０.８５μｍｏｌ/Ｌ和０.３μｍｏｌ/Ｌ时ꎬｄｄＰＣＲ检测拷贝数最多ꎬ微滴分布状态㊁微滴荧光信号的强度也均较好(图１Ａ)ꎮ退火温度优化结果显示ꎬ６０ħ时特异性最好ꎬ且信号强度较８５１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀强(图１Ｂ)ꎮ最终建立的ｄｄＰＣＲ方法ꎬ主要包括微滴生成㊁ＰＣＲ扩增和微滴读取３个步骤ꎮ①微滴生成ꎮ反应体系为ｓｕｐｅｒｍｉｘ１０μＬ㊁上㊁下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各１.７μＬ㊁探针(１０μｍｏｌ/Ｌ)０.６μＬ㊁模板１μＬ㊁ｄｄＨ２Ｏ５.０μＬꎬ加入至微滴生成卡的ｓａｍｐｌｅ孔ꎻ在微滴生成卡的ｏｉｌ孔中加入７０μＬ微滴生成油ꎻ将生成卡放入微滴生成仪ꎬ生成微滴ꎮ②ＰＣＲ扩增ꎮ将生成的微滴转移至９６孔板ꎬ盖膜后放入热封仪封膜ꎻ将封好膜的９６孔板放入ＰＣＲ仪进行扩增ꎻＰＣＲ扩增程序为:５０ħ２ｍｉｎꎻ９５ħ１０ｍｉｎꎻ９５ħ３０ｓꎬ６０ħ１ｍｉｎꎬ４０个循环ꎻ９８ħ１０ｍｉｎꎬ４ħ６０ｍｉｎꎮ③微滴读取ꎮ扩增完毕后将９６板转移至ＱＸ２００ＤｒｏｐｌｅｔＲｅａｄｅｒ微滴读取仪上进行微滴读取ꎮ在以上确定的反应条件下ꎬ阴㊁阳性微滴划分阈值划定在荧光强度为２０００的位置ꎮ加样说明参见表２ꎮ图１㊀引物和探针浓度优化(Ａ)及退火温度优化(Ｂ)结果㊀㊀表２㊀引物和探针加样说明样品编号探针加样量/μＬ引物加样量/μＬ样品编号探针加样量/μＬ引物加样量/μＬＡ０６０.３１.３Ａ０７０.３１.７Ｂ０６０.６１.３Ｂ０７０.６１.７Ｃ０６０.９１.３Ｃ０７０.９１.７Ｄ０６１.２１.３Ｄ０７１.２１.７Ｅ０６０.３１.５Ｅ０７０.３１.９Ｆ０６０.６１.５Ｆ０７０.６１.９Ｇ０６０.９１.５Ｇ０７０.９１.９Ｈ０６１.２１.５Ｈ０７１.２１.９２.２㊀特异性㊁重复性㊁检出限和定量限结果分别以单核细胞增生李斯特菌㊁沙门氏菌㊁大肠杆菌㊁肠球菌㊁弯曲杆菌㊁金黄色葡萄球菌的ＤＮＡ为模板ꎬ用建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法检测ꎬ结果均为阴性(图２)ꎬ表明特异性较好ꎮＡ０３为产气荚膜梭菌ꎬＢ０２为单核细胞增生李斯特菌ꎬＢ０３为沙门氏菌ꎬＣ０２为大肠杆菌ꎬＣ０３为肠球菌ꎬＤ０２为弯曲杆菌ꎬＤ０３为金黄色葡萄球菌ꎮ图２㊀产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法㊀的特异性试验结果㊀㊀选取３个浓度梯度(１０１㊁１０２㊁１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)的标准品ＤＮＡ为模板ꎬ分别在第１㊁７㊁１４天进行重复试验ꎬ每个梯度设３个平行ꎬ记录各次试验的拷贝数ꎬ并统计分析组内和组间的变异系数ꎮ结果３个梯度标准品的组内变异系数为０.７３％~３.１７％ꎬ组间变异系数为３.３６％~４.２７％(表３)ꎬ重复性和重现性较好ꎮ９５１㊀第１期㊀㊀张铭洋ꎬ等:产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ方法的建立及其在标准物质研制方面的应用㊀㊀表３㊀产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法的重复性试验结果标准品浓度/(ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)组内重复性第１天拷贝数变异系数/％第７天拷贝数变异系数/％第１４天拷贝数变异系数/％组间重复性拷贝数变异系数/％１０１３４.４３ʃ０.７８２.２６３４.５６ʃ１.１０３.１７３４.１７ʃ１.０３３.０１３４.３９ʃ１.４７４.２７１０２３４３.３３ʃ２.５２０.７３３４１.１２ʃ４.４０１.２９３３９.３３ʃ３.３３０.９８３４１.２６ʃ１１.４７３.３６１０３３４６５.３３ʃ４４.６６１.２９３４２８.１７ʃ７３.０２２.１３３４４７.２８ʃ３９.３０１.１４３４４６.９３ʃ１４５.１２４.２１㊀㊀采用７个浓度梯度(１０－１㊁１００㊁１０１㊁１０２㊁１０３㊁１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬ和１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)的产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒ＤＮＡ进行检测ꎮ每个稀释度３个重复ꎮ结果(图３)表明ꎬｄｄＰＣＲ反应产生的微滴数量超过１００００个ꎬ当稀释度为１０１~１０４时ꎬ产气荚膜梭菌α－毒素基因拷贝数与浓度之间呈良好的线性关系ꎬ可绘制标准曲线(图４)ꎮ标准曲线方程为ｙ＝４.３１９ｘ＋１４.５３ꎬＲ２＝０.９９９ꎬ计算得出检出限为１２.３９ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ定量限为３３.９７ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎮＡ０８㊁Ｂ０８㊁Ｃ０８的ＤＮＡ浓度为１０５ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬＤ０８㊁Ｅ０８㊁Ｆ０８的ＤＮＡ浓度为１０４ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ图３㊀梯度稀释ｄｄＰＣＲ扩增图Ｇ０８㊁Ｈ０８的ＤＮＡ浓度为１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬＢ０９㊁Ｃ０９㊁Ｄ０９的ＤＮＡ浓度为１０２ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬＥ０９㊁Ｆ０９㊁Ｇ０９的ＤＮＡ浓度为１０１ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬＨ０９㊁Ｄ１０㊁Ｅ１０的ＤＮＡ浓度为１００ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬＦ１０㊁Ｇ１０㊁Ｈ１０的ＤＮＡ浓度为１０－１ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎮ图４㊀产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ标准曲线２.３㊀候选标准物质的制备与鉴定将提取的ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ质粒进行双酶切和ＰＣＲ鉴定ꎬ结果均可见大小为１１４６ｂｐ的片段ꎬ符合预期(图５Ａ㊁Ｃ)ꎮ电泳鉴定线性化质粒ꎬ仅见１条条带且大小正确ꎬ证实酶切完全(图５Ｂ)ꎮ将质粒交由公司进行测序ꎬ结果其序列与大肠产气荚膜梭菌α－ｔｏｘｉｎ完全一致ꎮ证明产气荚膜梭菌α－毒素基因质粒ＤＮＡ候选标准物质基因序列正确ꎮＭ:ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１㊁３:ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ质粒样本ꎻ２:ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ纯化的线性化质粒ꎮ图５㊀ｐＵＣ５７－α－ｔｏｘｉｎ质粒双酶切(Ａ)㊁线性化质粒(Ｂ)及ＰＣＲ(Ｃ)鉴定结果ꎮ０６１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀２.４㊀临床样品的验证及基质效应评价对６８份临床阳性病料进行检测ꎬ结果３８份产气荚膜梭菌阳性病料的拷贝数均高于１０００(荧光值均高于２０００)ꎬ其他非特异性菌株阳性病料的拷贝数均为零(荧光值均低于２０００)ꎮ证明建立的ｄｄＰＣＲ方法可用于临床样品的检测ꎮ测定的结果采用线性回归分析方法进行分析ꎬ参考«基质效应与互通性评估指南»[８]中的方法ꎬ计算样本测定值双侧９５％置信区间ꎮ结果表明ꎬ标准物质的测定均值在临床样本９５％置信区间内(图６)ꎬ表明标准物质无明显的基质效应ꎮ图６㊀制备样品基质效应分析２.５㊀候选标准物质的检验对２０管候选标准物质进行均匀性检验ꎬ采用单因素方差分析法(Ｆ检验法)对结果进行分析ꎬ结果Ｆ<Ｆαꎬ表明样品是均匀的ꎮ经稳定性检验ꎬ样品可在－２０ħ条件下稳定储存１８个月ꎬ基因含量未发生显著变化ꎻ将样品置于４ħ保存８ｄꎬ结果样品的检测值无显著变化ꎬ表明标准物质在４ħ运输条件下可稳定保持ꎮ模拟反复冻融ꎬ结果样品冻融３０次ꎬ基因含量未发生显著变化ꎮ２.６㊀定值联合９家实验室应用ｄｄＰＣＲ方法进行定值ꎮ应用ＳＰＳＳ软件ꎬ对定值数据进行正态分布检验ꎬ结果显示数据符合正态分布ꎻ应用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ做出正态分布的直方图ꎬ拟合正态曲线(图７)ꎮ对组内数据可疑值检验ꎬ结果各组所有最大值和最小值之差的绝对值｜ｖｉ｜均小于l(αꎬｎ)ｓꎬ证实组内没有可疑值ꎮ对各组数据进行等精度检验ꎬ计算出Ｃ值为０.１８ꎬ实验室取α为０.０５ꎬ数据组数９ꎬ重复测定次数９ꎬ查科克伦检验临界值Ｃ(αꎬｍꎬｎ)为０.２７ꎻ结果ＣɤＣ(αꎬｍꎬｎ)ꎬ表明各组数据为等精度ꎮ对平均值最大组及平均值最小组之间的数据进行ｔ检验ꎬｔ值为２.７４ꎬ查ｔ值表ｔα为２.７８ꎬ图７㊀定值数据直方图和正态分布曲线ｔ<ｔαꎬ证明各组平均值之间无显著差异[７]ꎮ２.７㊀不确定度评定用ｕＡꎬｒｅｌ表示相对Ａ类不确定度ꎬ经计算ｕＡꎬｒｅｌ为２.１％ꎮ用ｕＢꎬｒｅｌ表示Ｂ类相对不确定度ꎬ经计算ｕＢꎬｒｅｌ为３.２％ꎮ用ｕｂｂꎬｒｅｌ表示均匀性差异带来的不确定度ꎬ经计算为２.３％ꎮ用Ｕｌｔｓ和Ｕｓｔｓ分别表示长期和短期不确定度ꎬ经计算分别为６.６０％和３.４２％ꎮ将各分量合成得到标准物质的合成相对不确定度ｕＣＲＭꎬｒｅｌ为８.６７％ꎬ扩展相对不确定度ｕＣＲＭꎬｒｅｌ为１７.３４％ꎬ扩展不确定度ｕＣＲＭ为０.５９ˑ１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎮ综合确定制备的标准物质的定值为(３.４３ʃ０.４３)ˑ１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎮ２.８㊀比对与验证购置中国计量科学研究院制备的猪繁殖与呼吸障碍综合征标准物质ꎬ用ｄｄＰＣＲ方法对其进行测定ꎮ３次的结果分别为９.４１ˑ１０８㊁９.３８ˑ１０８㊁９.４２ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ经分析ꎬ该值符合标准物质说明书上的定值(标准值９.４ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬꎬ扩展不确定度０.９ˑ１０８ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)ꎮ证明本研究建立的ｄｄＰＣＲ方法对标准物质的定值正确ꎮ３㊀讨论与结论产气荚膜梭菌分布广泛ꎬ对人类和动物的健康造成严重危害ꎮ该菌可产生多种毒素ꎬ其中Ａ型产气荚膜梭菌分泌的α－毒素是动物和人食源性感染的主要毒素型ꎮ研究表明ꎬα－毒素能够突破血脑屏障㊁侵害延髓㊁破坏呼吸系统及心脏的传导系统ꎬ最终引发动物猝死症 [１０]ꎮ产气荚膜梭菌可跟据其产生的４种主要毒素(α㊁β㊁ε㊁ι)分为５种毒素型(Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ㊁Ｄ㊁Ｅ)ꎮ其中α－毒素是产气荚膜梭菌分泌的主要致死毒素ꎬ是一种多功能磷脂酶ꎬ几乎所有产气荚膜梭菌都能产生α－毒素ꎮＹｏｎｏｇｉ等[１１]建立了用于检测产气荚膜梭菌各种１６１㊀第１期㊀㊀张铭洋ꎬ等:产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ方法的建立及其在标准物质研制方面的应用毒素的多重ＰＣＲ检测方法ꎻｖａｎＡｓｔｅｎ等[１２]针对α㊁β㊁ε等毒素建立了多重ＰＣＲ检测方法ꎻＳｈａｎ￣ｎｏｎ等[１３]建立了用于检测城市污水中特定病原菌的荧光定量ＰＣＲ检测方法ꎻＨａｎａｂａｒａ等[１４]建立了用于检测人类粪便中食源性致病菌的荧光定量ＰＣＲ检测方法ꎻ另有其他众多关于检测产气荚膜梭菌的报道[１５－２２]ꎬ他们使用的靶基因均为α－毒素基因ꎮｄｄＰＣＲ方法是一种对核酸分子进行绝对定量的检测技术ꎬ已广泛应用于病原检测领域ꎬ尤其适用于对低拷贝㊁低含量病原早期的精准检测ꎬ可有效弥补普通荧光定量ＰＣＲ方法的不足ꎮｄｄＰＣＲ将反应体系分散为上万个微滴ꎬ微滴经ＰＣＲ扩增后ꎬ利用微滴检测仪对每个微滴进行检测ꎬ最后根据泊松分布原理ꎬ直接计算阳性微滴的个数ꎬ从而实现直接定量核酸浓度ꎮ本研究建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ方法ꎬ具有较好的特异性㊁灵敏性和重复性ꎬ与Ｌｉ[２３－２４]㊁Ｃｏｒ￣ｂｉｓｉｅｒ[２５]㊁Ｄｕｐａｓ[２６]等的报道一致ꎮｄｄＰＣＲ检测中ꎬＤＮＡ浓度过高会超出仪器的检测范围ꎬ无法直接用于检测ꎻ而ＤＮＡ浓度过低则会对标准物质的稳定性产生不利影响ꎮ为保证标准物质的稳定性ꎬ以更好地应用于临床ꎬ本研究制备了浓度相对较低(１０３ｃｏｐｉｅｓ/μＬ)的标准物质ꎮｄｄＰＣＲ为直接定量方法ꎬ其对标准物质的定值结果是全国标准物质管理委员会评价其可信度的主要指标ꎮ本研究利用建立的ｄｄＰＣＲ方法对标准物质进行定值ꎬ并获得了国家市场监督管理总局颁发的标准物质证书(ＧＢＷ(Ｅ)０９１２３７)ꎮ该标准物质的研发成功ꎬ可促进产气荚膜梭菌诊断试剂的标准化ꎬ减少检测误差ꎬ确保检验人员的检测能力ꎬ规范试剂盒的管理ꎮ相较于其他定值方法ꎬｄｄＰＣＲ法对技术人员和试剂等要求更高ꎬ但随着技术进步和试剂成本的逐步降低ꎬ本研究建立的产气荚膜梭菌α－毒素基因ｄｄＰＣＲ检测方法ꎬ必将具有广阔的应用前景ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎＢꎬＫｉｎｚｌｅｒＫＷ.ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ１９９９ꎬ９６:９２３６－９２４１. [２]㊀黄瑾ꎬ梁涛波ꎬ许恒毅.数字ＰＣＲ在生物学检测中应用的研究进展[Ｊ].生命科学ꎬ２０２１ꎬ３３(２):２５５－２６４. [３]㊀ＳａｃｈｅｒＡＧꎬＰａｗｅｌｅｔｚＣꎬＤａｈｌｂｅｒｇＳＥꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｖａｌ￣ｉｄａｔｉｏｎｏｆｒａｐｉｄｐｌａｓｍａｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＥＧＦＲａｎｄＫＲＡＳｍｕｔａｔｉｏｎｓｉｎａｄｖａｎｃｅｄｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ[Ｊ].ＪＡＭＡＯｎ￣ｃｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ２(８):１０１４－１０２２.[４]㊀ｖａｎＧｉｎｋｅｌＪＨꎬＨｕｉｂｅｒｓＭＭＨꎬｖａｎＥｓＲＪＪꎬｅｔａｌ.ＤｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｔｕｍｏｒＤＮＡｉｎｐｌａｓｍａｏｆｈｅａｄａｎｄｎｅｃｋｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ[Ｊ].ＢＭＣＣａｎｃｅｒꎬ２０１７ꎬ１７(１):１－８.[５]㊀Ｇｒａｕ￣ＲｏｍａＬꎬＮａｖａｒｒｏＭꎬＢｌａｔｔｅｒＳꎬｅｔａｌ.Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒ￣ｆｒｉｎｇｅｎｓ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｎｅｃｒｏｔｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓ￣ｌｉｋｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｃｏｃｏｎｕｔｌｏｒ￣ｉｋｅｅｔｓ(Ｔｒｉｃｈｏｇｌｏｓｓｕｓｈａｅｍａｔｏｄｕｓ)[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０２１ꎬ５８(２):４２３－４２７.[６]㊀ＸｕＷＰꎬＷａｎｇＨＲꎬＬｉｕＬＸꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅａｎｄｃｈａｒａｃ￣ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｈｉｃｋｅｎｆａｒｍｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].Ａｎａｅｒｏｂｅꎬ２０２１ꎬ７２:１０２４６７. [７]㊀中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.分析方法检出限和定量限的评估:ＧＢ/Ｔ２７４１５２０１３[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０１３.[８]㊀中华人民共和国卫生部.基质效应与互通性评估指南:ＷＳ/Ｔ３５６２０１１[Ｓ].北京:中国标准出版社ꎬ２０１２. [９]㊀张喜悦ꎬ张铭洋ꎬ赵格ꎬ等.弯曲杆菌１６ＳｒＲＮＡ基因质粒ＤＮＡ标准物质的研制[Ｊ].中国动物检疫ꎬ２０２３ꎬ４０(７):１０３－１０９.[１０]王苗利ꎬ蔡玉梅ꎬ柴同杰ꎬ等.感染Ａ型产气荚膜梭菌小鼠体内α毒素的分布及定位[Ｊ].动物医学进展ꎬ２０１１ꎬ３２(１０):１９－２３.[１１]ＹｏｎｏｇｉＳꎬＫａｎｋｉＭꎬＯｈｎｉｓｈｉＴꎬｅｔａｌ.Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉ￣ｃａｔｉｏｎｏｆａｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ￣ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｅｎｅｓｃｐｅａｎｄｂｅｃＡＢ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１６ꎬ１２７:１７２－１７５. [１２]ｖａｎＡｓｔｅｎＡＪＡＭꎬｖａｎｄｅｒＷｉｅｌＣＷꎬＮｉｋｏｌａｏｕＧꎬｅｔａｌ.ＡｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲｆｏｒｔｏｘｉｎｔｙｐｉｎｇｏｆＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｏ￣ｌａｔｅｓ[Ｊ].ＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ(Ａｍｓｔｅｒｄａｍ)ꎬ２００９ꎬ１３６(３/４):４１１－４１２.[１３]ＳｈａｎｎｏｎＫＥꎬＬｅｅＤＹꎬＴｒｅｖｏｒｓＪＴꎬｅｔａｌ.Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅａｌ￣ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｂａｃｔｅｒｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｄｕｒｉｎｇｍｕｎｉｃｉｐａｌｗａｓｔｅｗａｔｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｃｅｏｆＴｈｅＴｏｔａｌＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔꎬ２００７ꎬ３８２(１):１２１－１２９. [１４]ＨａｎａｂａｒａＹꎬＵｅｄａＹ.ＡＲａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｓｓａｙｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｆｏｏｄｂｏｒｎｅｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｂａｃｔｅｒｉａｉｎｈｕｍａｎｆｅｃｅｓ[Ｊ].ＪａｐａｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓꎬ２０１６ꎬ６９(６):４７１－４７６.[１５]任宏荣ꎬ李苗云ꎬ朱瑶迪ꎬ等.产气荚膜梭菌在食品中的危害及其控制研究进展[Ｊ].食品科学ꎬ２０２１ꎬ４２(７):３５２－３５９.[１６]孙雨ꎬ王晓英ꎬ董浩ꎬ等.产气荚膜梭菌外毒素基因与相关疫苗的研究进展[Ｊ].中国草食动物科学ꎬ２０１６ꎬ３６(２):５８－６２.[１７]刘立兵ꎬ李睿文ꎬ陈志敏ꎬ等.产气荚膜梭菌实时荧光ＰＣＲ２６１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀和实时荧光ＲＰＡ检测方法的建立和比较[Ｊ].食品科学ꎬ２０２０ꎬ４１(４):２６８－２７２.[１８]石玉玲ꎬ曾兰兰ꎬ陈丽丹ꎬ等.产气荚膜梭菌实时荧光ＰＣＲ方法的建立[Ｊ].生物技术通讯ꎬ２０１０ꎬ２１(３):３８９－３９２. [１９]ＢｒｙｎｅｓｔａｄＳꎬＧｒａｎｕｍＰＥ.Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓａｎｄｆｏｏｄ￣ｂｏｒｎｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏ￣ｇｙꎬ２００２ꎬ７４(３):１９５－２０２.[２０]ＭａｉｋａｎｏｖＢꎬＭｕｓｔａｆｉｎａＲꎬＡｕｔｅｌｅｙｅｖａＬꎬｅｔａｌ.ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｂｏｔｕｌｉｎｕｍａｎｄＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｉｎＫａｚａｋｈｈｏｎｅｙｓａｍｐｌｅｓ[Ｊ].Ｔｏｘｉｎｓꎬ２０１９ꎬ１１(８):４７２.[２１]ＢｒａｄｙＪꎬＨｅｒｎａｎｄｅｚ￣ＤｏｒｉａＪＤꎬＢｅｎｎｅｔｔＣꎬｅｔａｌ.Ｔｏｘｉｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆｎｅｃｒｏｔｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｄｃｏｍｍｅｎｓａｌｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＣｌｏｓ￣ｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｆｒｏｍｃｈｉｃｋｅｎｓｆｅｄｏｒｇａｎｉｃｄｉｅｔｓ[Ｊ].ＡｖｉａｎＰａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ３９(６):４７５－４８１.[２２]门佩璇ꎬ肖宇锋ꎬ张玢.基于计量学方法分析数字ＰＣＲ技术的临床应用现状与技术热点[Ｊ].生物技术进展ꎬ２０２２ꎬ１２(４):６０６－６１３.[２３]ＬｉＪꎬＬｉＬꎬＺｈａｎｇＬꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｃｅｒｔｉｆｉｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｇｅ￣ｎｅｔｉｃａｌｌｙｍｏｄｉｆｉｅｄｒｉｃｅＫＭＤ[Ｊ].ＡｎａｌｙｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２０ꎬ４１２(２５):７００７－７０１６.[２４]ＬｉＪꎬＺｈａｉＳＳꎬＧａｏＨＦꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｄｕｐｌｅｘｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＭｒｉｃｅＫｅｍｉｎｇｄａｏ[Ｊ].ＡｎａｌｙｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２１ꎬ４１３(１６):４３４１－４３５１.[２５]ＣｏｒｂｉｓｉｅｒＰꎬＰｉｎｈｅｉｒｏＬꎬＭａｚｏｕａＳꎬｅｔａｌ.ＤＮＡｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｄｉｇｉｔａｌａｎｄｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌｑｕａｎｔｉｔａ￣ｔｉｖｅＰＣＲｕｓｉｎｇｃｅｒｔｉｆｉｅｄｒｅｆｅｒｅｎｃｅｍａｔｅｒｉａｌｓ[Ｊ].ＡｎａｌｙｔｉｃａｌａｎｄＢｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０１５ꎬ４０７(７):１８３１－１８４０. [２６]ＤｕｐａｓＥꎬＬｅｇｅｎｄｒｅＢꎬＯｌｉｖｉｅｒＶꎬｅｔａｌ.Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲａｎｄｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＸｙｌｅｌｌａｆａｓｔｉｄｉｏｓａｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓꎬ２０１９ꎬ１６２:８６－９５.３６１㊀第１期㊀㊀张铭洋ꎬ等:产气荚膜梭菌α－毒素基因数字ＰＣＲ方法的建立及其在标准物质研制方面的应用。

扩展产气荚膜梭菌毒素型分型的概述

子科赫法则也已被证实。有实验表明，Ｆ型产气荚膜梭菌的浓
缩培养上清液可在兔肠坏死疾病模型中导致积液和黏膜损伤，
这与通过等位基因交换分离出的ｃｐｅ突变体不同。这些菌株
原被称为Ａ型产气荚膜梭菌的ＣＰＥ阳性菌株，将它们命名为Ｆ
型产气荚膜梭菌将为不同菌株的临床和流行病学分析提供可
靠的基础。这种命名法变化的结果是Ａ型产气荚膜梭菌食物
２０２１年第８期（总第３８７期）
畜禽业
试验研究
扩展产气荚膜梭菌毒素型分型的概述
钟建辉，纪甜甜，杨凌７１２１００）
摘要：产气荚膜梭菌是革兰阳性孢子形成的厌氧菌，是人类和动物许多组织毒性和肠毒性疾病的病原体。介绍了最新修订的产气荚膜梭菌毒素型分型方案，并对拓展的Ｆ型和Ｇ型产气荚膜梭菌特性进行了整理，以便为产气荚膜梭菌的进一步分型提供研究资料。关键词：产气荚膜梭菌；毒素；分型ｄｏｉ：１０．１９５６７／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８－０４１４．２０２１．０８．０１４
起亚临床性坏死性肠炎病变。针对ＮｅｔＢ基因的特异性突变消
除了引起这些病变的能力，再通过与ＮｅｔＢ基因反式互补的野
生型得到恢复。目前，这些菌株被称为禽坏死性肠炎Ａ型产气
荚膜梭菌株，而将它们命名为Ｇ型产气荚膜梭将为这些分离株
的诊断和流行病学分析提供坚实的基础。
结语与展望
产气荚膜梭菌自发现与确定命名以来，经历了若干次毒素
２１Ｆ型产气荚膜梭菌
Ｆ型产气荚膜梭菌被定义为携带 α毒素和ＣＰＥ基因且在
产生孢子形成ＣＰＥ，但不携带 β毒素、ε毒素和 ι毒素结构基
因的分离菌株。这些菌株已有证据显示参与人食物中毒和非
食源性产气荚膜梭菌介导的腹泻，包括一些与抗生素相关性的

A 型产气荚膜梭菌 tetB（P）耐药基因核苷酸序列与蛋白结构分析

A 型产气荚膜梭菌 tetB（P）耐药基因核苷酸序列与蛋白结构分析冶贵生;马玉花;张爽;梅成和;张晓芬;韩志辉;贾跃宁;邹勇【摘要】In order to analysis tetB(P )drug resistance gene of Clostridium perfringens ,primers were designed by biology software and were used to amplified tetB(P )gene of Clostridium perfringens type A, the amplified gene was sequenced and the protein structure was analyzed.The results showed that the tetB (P )gene was 1 959 bp long,encoding 652 amino acids.Nucleotide sequence homology of tetB(P )gene with reference strains CW92 and EHE-NE18 were 99.7% and 99.9%,respectively,amino acid sequence homolo-gy were 99.4% and 99.8%.The tetB(P )of isolated strain had more hydrophilic amino acid,no transmem-brane domain,had four N-glycosylation sites,one cAMP and cGMP dependent protein kinase phosphoryla-tion site,nine protein kinase C phosphorylation sites,twelve Casein kinase II phosphorylation sites,seven N-myristoylation sites,one ATP/GTP-binding site motif A,one translational (tr)-type guanine nucleotide-binding (G)domain signature.%为了对产气荚膜梭菌 tetB（P）耐药基因进行分析，通过生物软件设计引物，扩增 A 型产气荚膜梭菌 tetB （P）耐药基因，测序后对 tetB （P ）基因核苷酸序列与蛋白结构进行分析．结果表明：分离株 tetB （P ）基因长度为1959 bp，编码652个氨基酸．与参考菌株CW92、EHE-NE18的核苷酸序列同源性依次为99．7％、99．9％，氨基酸序列同源性依次为99．4％、99．8％．分离株 tetB（P）蛋白亲水性氨基酸较多，无跨膜区，含有4个 N-糖基化位点，1个 cAMP 和 cGMP 依赖性蛋白激酶磷酸化位点，9个蛋白激酶 C 磷酸化位点，12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，7个N-豆寇酰化位点，1个 ATP／GTP 结合位点基序，1个翻译型鸟苷酸结合域，三级结构主要是由α-螺旋、β折叠和无规则卷曲形成．【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】5页(P160-164)【关键词】A 型产气荚膜梭菌;tetB(P)基因;序列分析;蛋白结构【作者】冶贵生;马玉花;张爽;梅成和;张晓芬;韩志辉;贾跃宁;邹勇【作者单位】青海大学农牧学院，青海西宁 810016;青海大学农牧学院，青海西宁 810016;青海大学农牧学院，青海西宁 810016;青海大学农牧学院，青海西宁810016;青海大学农牧学院，青海西宁 810016;青海大学农牧学院，青海西宁810016;青海大学农牧学院，青海西宁 810016;西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100【正文语种】中文【中图分类】Q517;Q523+.8第一作者：冶贵生(1977-)，男，副教授，博士，主要从事分子病原生物学与免疫学的研究工作.E-mail：***************A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A)是梭菌属的成员，能引起坏死性肠炎和食物中毒[1].四环素类抗生素能结合细菌核糖体，阻断细菌蛋白质的翻译，而细菌产生的核糖体保护蛋白能使细菌免受四环素类抗生素的作用[2].关于产气荚膜梭菌四环素耐药及耐药基因方面的研究，国外已经开展了一些工作[3-6]，细菌四环素耐药相关的基因有tet(A)、tet(Y)、tet(Z)、tet(M)、tet(O)、tet(W)等[7]，而与产气荚膜梭菌四环素耐药相关的基因有tetB(P)和tetM等[8]，其中产气荚膜梭菌tetB(P)基因编码的蛋白与tet(M)-like蛋白具有高度同源性[9].但是，目前关于产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因遗传变异分析以及蛋白结构预测方面的研究国内报道的极少.因此，本研究通过PCR技术扩增A型产气荚膜梭菌tetB(P)耐药基因，分析tetB(P)基因核苷酸序列，预测tetB(P)蛋白功能位点、跨膜区及结构，以期为进一步研究产气荚膜梭菌tetB(P)基因四环素耐药功能提供参考.1.1.1 菌株A型产气荚膜梭菌青海分离株为青藏高原动物疾病研究室保存菌株.1.2.1 主要试剂FT培养基为北京陆桥技术有限责任公司产品，DNA Marker、Ex Taq DNA聚合酶为TaKaRa公司产品，细菌质粒DNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品.1.2.1 引物设计根据NCBI数据库中产气荚膜梭菌tetB(P)基因序列(登录号：L20800.1)，设计引物，基因长度为1 959 bp.引物序列为tetB(P)-F：ATGAAGAAAATAATTAATATAGG，tetB(P)-R：TTAATCTCTAATTGCGTTT.1.2.2 A型产气荚膜梭菌的培养取适量保存的A型产气荚膜梭菌分离株菌液，接种于FT培养基中，石蜡无菌封口，37 ℃厌氧培养17~19 h.1.2.3 提取质粒吸取培养的细菌置于1.5 mL离心管中，室温12 000 r/min，3 min，弃上清，然后依次按试剂盒说明书进行.1.2.4 PCR扩增tetB(P)基因反应体系：质粒DNA 1 μL，DNA聚合酶0.5 μL，PCR Buffer 5 μL，dNTPs 4 μL，tetB(P)-F 1 μL，tetB(P)-R 1 μL，灭菌水37.5μL.条件：94 ℃ 1 min、47 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min 20 s、30个循环，72 ℃ 10 min.1.2.5 tetB(P)基因序列测定将上述tetB(P)基因PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测、纯化后，送交上海美吉生物医药科技有限公司进行核苷酸序列测定.1.2.6 tetB(P)基因序列与蛋白结构分析将测序正确的tetB(P)基因通过DNASTAR软件进行序列分析，采用Predictprotein和TMHMM服务器分析tetB(P)蛋白的修饰位点和跨膜区，采用Garnier-Robson[10]、Chou-Fasman[11]方法分析tetB(P)蛋白的二级结构，采用Kyte-Doolittle[12]方法分析蛋白的亲水性，采用I-Tasser服务器分析tetB(P)蛋白的三级结构.提取的A型产气荚膜梭菌质粒DNA经1%琼脂糖凝胶电泳后结果表明(图1)，质粒DNA所在泳道中出现远大于DNA Marker 2 000 bp的条带，亮度虽然较弱，但可作为PCR扩增的模板.A型产气荚膜梭菌tetB(P)基因扩增产物经电泳检测后结果表明(图2)，tetB(P)基因所在泳道出现1条与DNA Marker 2 000 bp相近的目的条带，大小符合预期要求，阴性对照无扩增现象.2.3.1 核苷酸序列分析tetB(P)基因核苷酸序列分析后结果表明(表1)，tetB(P)基因含有1 959个核苷酸，A+T含量最高.2.3.2 氨基酸序列分析tetB(P)蛋白氨基酸序列经软件分析后结果表明(表2)，tetB(P)蛋白氨基酸序列含有652个氨基酸，疏水性氨基酸含量最高.2.3.3 序列同源性分析将分离株tetB(P)基因与产气荚膜梭菌CW92菌株tetB(P)基因(登录号：L20800.1)和产气荚膜梭菌EHE-NE18菌株tetB(P)基因(登录号：JN689220.1)的核苷酸序列与氨基酸序列分别进行比较，结果表明(图3~4)分离株tetB(P)基因与CW92、EHE-NE18参考菌株tetB(P)基因的核苷酸序列同源性依次为99.7%、99.9%，氨基酸序列同源性依次为99.4%、99.8%.Garnier-Robson方法预测表明(图5)，分离株tetB(P)蛋白二级结构中α螺旋占47.9%，在肽链前中、中部和C端区段较密集.β折叠占38.2%，分布较多且均匀，β转角和无规则卷曲也有一定的分布，分别占7.06%和7.36%.Chou-Fasman方法预测显示(图5)，分离株tetB(P)蛋白二级结构中α螺旋占35.6%，β折叠和β转角分布区也较多，分别占34.8%、24.5%.Kyte-Doolittle方法预测显示(图6)，分离株tetB(P)蛋白的亲水性氨基酸分布较多，但是疏水性氨基酸也有较多分布，说明tetB(P)蛋白成为跨膜蛋白的可能性较小. TMHMM服务器预测分离株tetB(P)蛋白，结果表明tetB(P)蛋白无跨膜区. Predictprotein预测结果显示分离株tetB(P)蛋白含有4个N-糖基化位点，分别为148~151位NMSN、346~349位NISI、471~474位NVSV；1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，为629~632位RKKT；9个蛋白激酶C 磷酸化位点，分别为56~58位TIK、116~168位TLK、150~152位SNK、267~269位TSK、284~286位SVR、431~433位TPK、492~494位TSK、568~570位TMR、584~586位SIK；12个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，分别为19~22位TITE、42~45位TQTD、84~87位SEVE、101~104位SGVE、116~119位TLKE、187~190位SDLD、268~271位SKNE、284~287位SVRD、359~362位SAID、409~512位SMLD、422~425位SNIE、510~513位SCGE；7个N-豆寇酰化位点，分别为29~34位GAIKSV，40~46位GNTQTD、135~140位GANFNK、280~285位GGKISV、310~315位GVVEAQ、323~328位GILYGL、609~614位GMFVTK；1个ATP/GTP结合位点基序，为11~18位AHVDAGKT；1个翻译型鸟苷酸结合域，为45~60位DSMELERKRGITIKSS.分离株tetB(P)蛋白经I-Tasser服务器预测三级结构，结果表明(图7)tetB(P)蛋白存在2种空间模型，2种模型的C-score值均在[-5,2]的置信区间内，蛋白空间结构主要是由α-螺旋、β折叠和无规则卷曲形成，模型1比模型2的C-score值大，说明tetB(P)蛋白三级结构形成模型1的可能性较大.四环素是一种广谱类抗生素，包括四环素、土霉素等，已广泛用于人、畜疾病的治疗.由于四环素药物的大量应用，使得细菌对四环素耐药现象日益严重[13-15].细菌体内的耐药基因是细菌对四环素类药物产生耐药性的重要原因，细菌可通过主动外排、核糖体保护蛋白等方式对四环素类药物产生耐药[7].产气荚膜梭菌对四环素耐药主要是由于菌体内47 kU接合型R质粒上的2个重叠基因即tetA(P)和tetB(P)[6]，其中tetA(P)基因编码的蛋白是一种外排泵蛋白，能调节四环素类药物的主动外排[16]，而tetB(P)基因编码的蛋白与Tet(M)-like蛋白具有高度同源性[9]，Tet(M)蛋白作为一种核糖体保护蛋白，可以将结合在细菌核糖体30S小亚基上的四环素类药物解离，从而恢复细菌蛋白质的生物合成过程[17].A型产气荚膜梭菌青海分离株tetB(P)基因长度为1 959 bp，编码652个氨基酸.核苷酸序列同源性比对结果说明分离株与CW92参考菌株有6处核苷酸突变位点，与EHE-NE18参考菌株有1处核苷酸突变位点.氨基酸序列同源性分析显示分离株与CW92参考菌株有4处突变，与EHE-NE18参考菌株有1处突变，突变的原因可能是由于细菌所处环境不同所造成.【相关文献】[1] Sparks S G,Carman R J,Sarker M R,et al.Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecalisolates associated with antibiotic associated diarrhoea and food poisoning in north America[J].J Clin Microbiol,2001,39(3):883-888[2] 何伟.革兰阳性菌对四环素耐药的生化和遗传机制[J].国外医药抗生素分册,2005,26(5):201-204[3] Kouassi K A,Dadie A T,N'Guessan K F,et al.Clostridium perfringens and Clostridium difficile in cooked beef sold in Cte d'Ivoire and their antimicrobialsusceptibility[J].Anaerobe,2014,28:90-94[4] Gobeli S,Berset C,Burgener I,et al.Antimicrobial susceptibility of canine Clostridium perfringens strains from Switzerland[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2012,154(6):247-250 [5] Slavi D,Boerlin P,Fabri M,et al.Antimicrobial susceptibility of Clostridium perfringens isolates of bovine,chicken,porcine,and turkey origin from Ontario[J].Can J VetRes,2011,75(2):89-97[6] Johanesen P A,Lyras D,Bannam T L,et al.Transcriptional analysis of the tet(P) operon from Clostridium perfringens[J].J Bacteriol,2001,183(24):7110-7119[7] Roberts M C.Update on acquired tetracycline resistance genes[J].FEMS MicrobiolLett,2005,245(2):195-203[8] Sasaki Y,Yamamoto K,Tamura Y,et al.Tetracycline-resistance genes of Clostridium perfringens,Clostridium septicum and Clostridium sordellii isolated from cattle affected with malignant edema[J].Vet Microbiol,2001,83(1):61-69[9] Sloan J,McMurry L M,Lyras D,et al.The Clostridium perfringens Tet P determinant comprises two overlapping genes:tetA(P),which mediates active tetracycline efflux,and tetB(P),which is related to the ribosomal protection family of tetracycline-resistance determinants[J].Mol Microbiol,1994,11(2):403-415[10] Garnier J,Osguthorpe D J,Robson B.Analysis of the accuracy and implications of simple method for predicting the secondary structure of globular proteins[J].J Mol Biol,1978,120(1):97-120[11] Chou P Y,Fasman G D.Prediction of the secondary structure of proteins from their amino acid sequence[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1978,47:45-148[12] Kyte J,Doolittle R F.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J Mol Biol,1982,157(1):105-132[13] Chen L,Song Y,Wei Z,et al.Antimicrobial susceptibility,tetracycline and erythromycin resistance genes,and multilocus sequence typing of Streptococcus suis isolates from diseased pigs in China[J].J Vet Med Sci,2013;75(5):583-587[14] Bojesen A M,Vazquez M E,Bager R J,et al.Antimicrobial susceptibility and tetracycline resistance determinant genotyping of Gallibacterium anatis[J].Vet Microbiol,2011,148(1):105-10[15] Morioka A,Asai T,Nitta H,et al.Recent trends in antimicrobial susceptibility and the presence of the tetracycline resistance gene in Actinobacillus pleuropneumoniae isolates in Japan[J].J Vet Med Sci,2008,70(11):1261-1264[16] Bannam T L,Johanesen P A,Salvado CL,et al.The Clostridium perfringens TetA(P) efflux protein contains a functional variant of the Motif A region found in major facilitator superfamily transport proteins[J].Microbiology,2004,150(Pt 1):127-134[17] Connell S R,Tracz D M,Nierhaus KH,et al.Ribosomal protection proteins and their mechanism of tetracycline resistance[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(12):3675-3681。

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析

产气荚膜梭菌β毒素蛋白抗原表位预测及CPB-N蛋白免疫原性分析王玉建;商红旗;朱琳;徐煜琳;胡莉萍;朱瑞良【摘要】为获得具有与β毒素蛋白相同免疫原性的新蛋白,本研究对产气荚膜梭菌β毒素蛋白的氨基酸序列进行综合分析,预测其抗原表位并筛选出有效的新蛋白.采用生物信息学方法综合分析β毒素蛋白二级结构、亲水性、可塑性、抗原性、跨膜区域以及信号肽,同时参考ElliPro服务器在线预测.最终预测aa108～aa320区段为优势抗原表位,在此基础上建立β毒素蛋白三维结构模型,标记特殊位点并筛选出B型产气荚膜梭菌新蛋白(CPB-N).诱导表达CPB-N后通过SDS-PAGE和western blot鉴定,结果显示在约24 ku处有明显条带.采用间接ELISA方法对免疫小鼠的血清和肠道灌洗液样品进行检测,结果表明CPB-N与β毒素蛋白的免疫原性基本相同.CPB-N蛋白的筛选及预防产气荚膜梭菌引起的疾病奠定了重要的研究基础.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2019(041)002【总页数】4页(P188-191)【关键词】产气荚膜梭菌;β毒素蛋白;抗原表位;免疫原性【作者】王玉建;商红旗;朱琳;徐煜琳;胡莉萍;朱瑞良【作者单位】山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安271018;山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安271018;山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安271018;山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安271018;山东省动物疫病预防与控制中心,山东济南250022;山东农业大学动物科技学院/山东省动物生物技术与疫病防治重点实验室,山东泰安271018【正文语种】中文【中图分类】S852.6产气荚膜梭菌β毒素是由B型产气荚膜梭菌(C.perfringens type B，CPB)和 C型产气荚膜梭菌(CPC)产生的一种强毒素，具有细胞毒性和强致死性，是引起人和动物坏死性肠炎以及动物痢疾的主要致病因子[1-2]。

A型产气荚膜梭菌的分离及鉴定(1)

Ａ型产气荚膜梭菌的分离及鉴定高文伟１，郭宏伟１，任家琰１，蒋玉文２，杨茂荣３，赵玉臣３，柴奎强３，周县利３（１山西农业大学动物科技学院，太谷０３０８０１；２中国兽药监察所，北京１０００８１；３山西省药物培植场，降县０４３６００）摘要：从山西各鹿场采集鹿出血性肠炎急性病死鹿病料３９例，通过病原微生物分离培养，形态学观察和血清型鉴定，初步表明分离到的产气荚膜梭菌主要是Ａ型，对ＰＣＲ产物的序列分析表明经过ＰＣＲ得到了特异性的α毒素基因片段，因而Ａ型产气荚膜梭菌是引起山西鹿场发生鹿出血性肠炎的主要致病菌。

为该疾病的防治和疫苗研制提供依据。

关键词：山西鹿场；Ａ型产气荚膜梭菌；分离；鉴定中图分类号：Ｓ８５２．６文献标识码：ＡＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍＰｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓＧａｏＷｅｎｗｅｉ１，ＧｕｏＨｏｎｇｗｅｉ１，ＲｅｎＪｉａｙａｎ１，ＪｉａｎｇＹｕｗｅｎ２，ＹａｎｇＭａｏｒｏｎｇ３，ＺｈａｏＹｕｃｈｅｎ３，ＣａｉＫｕｉｑｉａｎｇ３，ＺｈｏｕＸｉａｎｌｉ３（１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｈａｎｘｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｇｕ０３０８０１；２ＴｈｅＡｎｉｍａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎＡｃａｄｅｎｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１；３ＳｈａｎｘｉＭｅｄｉｃａｔｉｏｎＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎＦｉｅｌｄ，Ｊｉａｎｇｘｉａｎ０４３６００）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍ３９ｃａｓｅｓｏｆｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｔｈｅｍａｊｏｒｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘａｍｉｎｅｄｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌｌｙ，ｔｈｅｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｈｒｏｕｇｈｓｅｒｕｍｒｅａｃｔｉｏｎ，ｔｈｅｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｉｔｉｓｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙＰＣＲａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＳｏｔｈｅｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｗａｓｍａｄｅｔｈａｔｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｐａｔｈｏｇｅｎｔｈａｔｃａｕｓｉｎｇｃｅｒｖｕｓｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｅｎｔｅｒｉｔｉｓｉｎＳｈａｎｘｉｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎｄｔｈｅｒｅｆｏｒｅｐｒｏｖｉｄｅｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｈａｎｘｉｃｅｒｖｕｓｆａｒｍ，ｔｙｐｅＡＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ基金项目：山西省攻关项目“鹿出血性肠炎多价疫苗的研制”（０１２０２９）。

A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达

第27卷　增刊1998年　8月卫　生　研　究JOURNAL O F HYGIENE RESEARCH Vol.27　Supplement Aug.　1998　49许崇波,男,博士,助理研究员A 型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达许崇波　朱　平　姚湘燕　马从林　冯书章(解放军农牧大学军事兽医研究所,长春　130062)摘要　将含A 型产气荚膜梭菌α毒素基因的质粒pKM A100用核酸内切酶Ba mH I 和H ind Ⅲ双酶切,经电泳分离、透析袋电洗脱法回收了0.95kb α毒素基因片段,再将载体pE T-28b(+)用Bam H I 和Hind Ⅲ双酶切,然后将处理好的pET-28b(+)与0.95kb 的α毒素基因片段进行连接、转化。

经Ba m H I 和H ind Ⅲ酶切分析和序列分析,证明重组质粒pX ETA1含有α毒素基因,且具有正确的阅读框架。

构建的重组菌株BL 21(DE 3)(pXETA 1)能表达α毒素,但已经完全丧失其毒性。

经SDS -P AGE 和薄层凝胶扫描分析,IP TG 诱导后的BL21(DE3)(pXET A1)所表达的目的蛋白占菌体总蛋白的33.21%。

经Western blot 分析和免疫试验结果表明,表达产物能被α毒素抗血清识别,且免疫小鼠后,用强毒株培养上清攻击,结果免疫小鼠能抵抗至少4LD 100的攻击,这说明表达产物具有良好的免疫原性。

关键词　A 型产气荚膜梭菌　α-毒素基因　高效表达　免疫原性中图分类号　High -Level Expression of Alpha -Toxin Protect iveAnt igen Gene of Clostridium Per f ringensXu Chongbo,Zhu Ping,Yao Xiangyan,Ma Conglin,et al.(The Militar y Veterinar y Insti tute ,University of Agriculture a nd AnimalSciences of the PLA,Changchun 130062)We used restriction endonucleases Bam H I a nd H ind Ⅲto cleave 0.95kb a lpha-toxin protec-tive antigen gene fr agm ent fr om plasmid pKM A 100containing a lpha -toxin gene of Clost ridium per -fringens,isolated by 1.5%agarose gel elect rophoresis,and recover ed the 0.95kb gene f ragment,then inser ted it into a n expression vector p ET -28b (+),which cleaved with Bam H I by blunt -endliga tion.The r ecombina nt plasmid pXETA1was studied in detail by rest riction endonuclease ana ly-sis and nucleotide sequencing .The results showed tha t the recombina nt gene fra gment ,ha d positiver ea ding fra me,and revea led the nucleotide sequence.The alpha-toxin of Clost ridium perf ringenswas expr essed in recombina nt str ain BL 21(DE 3)(pX ETA 1),lost its activity of the toxin complete-ly,a nd was r ecognized by anti-sera of Clostr idium per f ringers t ype A by the Weste rn blot ana lysis.Immuni zation with cr ude prepa ra tion containing a lpha-toxin inclusion body induced pr otection a-gainst the lethal effec ts of the toxin .Immunization with cr ude pr epa ration also provided protetion ina mouse model against a t lea st 4LD 100dose of Clostr idium per f r ingens t ype A.This r esult showsthat the expressed a lpha -toxin ha s good immunogenicity .Key wor ds :　Clostr idium per f r ingens type A,a lpha-toxin,expression,immunogenicity产气荚膜梭菌(Clostridium pe rfringens,又称魏氏梭菌),是引起各种动物坏死性肠炎、肠毒血症、人类的食物中毒和平战时创伤性气性坏疽的主要病原菌之一,该菌分为A 、B 、C 、D 、E 五型,其致病因子是菌体产生的外毒素。

黄牛源产气荚膜梭菌分离株基因组的生物信息学分析

黄牛源产气荚膜梭菌分离株基因组的生物信息学分析田睿;徐思翔;谢烽;刘广锦;王刚;李庆霞;代蕾;谢国信;张琼文;陆亚警;王光文;王金秀;张炜【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2024(55)4【摘要】本研究自猝死海南黄牛的组织器官中分离到2株A型产气荚膜梭菌,命名为ZWCP209和ZWCP210。

基因组拼接结果显示其基因组大小处于3.4~3.5 Mb 之间,tRNA和CDS数量稳定。

多位点序列分析(MLST)显示,测序菌株属于同种新ST型。

从NCBI数据库中获取27株牛源产气荚膜梭菌的基因组,与测序分离株共同进行生物信息学分析:共检测到13种耐药基因,其中四环素类耐药基因tetA(P)和tetB(P)的携带率最高(79.4%),值得关注的是,本研究中2株海南黄牛分离株均携带了7种以上的耐药基因,其中包括非兽用抗生素噁唑烷酮的耐药基因optrA。

泛基因组分析结果显示以上菌株的基因组中共含有7 345个基因,核心基因数量占比22.94%;在核心基因组和plc基因的系统进化分析中,两海南黄牛分离株处于同一分支,并具有相同的毒力因子,具有极高的同源性。

本研究为国内首次对海南黄牛产气荚膜梭菌进行全基因组序列测定与生物信息学分析,对牛产气荚膜梭菌病的防治与基因组研究具有参考价值。

【总页数】9页(P1707-1715)【作者】田睿;徐思翔;谢烽;刘广锦;王刚;李庆霞;代蕾;谢国信;张琼文;陆亚警;王光文;王金秀;张炜【作者单位】南京农业大学三亚研究院;南京农业大学动物医学院;南京农业大学WOAH猪链球菌参考实验室;海南省动物疫病预防控制中心;昌江黎族自治县畜牧兽医技术服务中心【正文语种】中文【中图分类】S852.616.3【相关文献】1.仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究Ⅲ.7株A型产气荚膜梭菌菌株的产毒素试验2.1株羊源产气荚膜梭菌的分离鉴定及毒素分型检测3.牦牛源产气荚膜梭菌青海分离株的生物学特性4.猪源产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性分析及益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用5.加查县3株藏猪源产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

A型产气荚膜梭菌生物被膜的培养与鉴定李凯

A型产气荚膜梭菌生物被膜的培养与鉴定李凯发布时间：2022-02-23T02:11:19.649Z 来源：《基层建设》2021年31期作者：李凯[导读] 通过结晶紫染色法、扫描电镜观察法以及OD值测定法对A型产气荚膜梭菌青海分离株进行了生物被膜的培养与鉴定青海农牧科技职业学院 812100摘要：通过结晶紫染色法、扫描电镜观察法以及OD值测定法对A型产气荚膜梭菌青海分离株进行了生物被膜的培养与鉴定。

结果表明培养的A型产气荚膜梭菌生物被膜结晶紫染色后，随着时间的延长，附着在载玻片的细菌不断增多并聚集；其被膜经扫描电镜观察可见菌体被团状聚集的生物被膜包裹；对其OD值测定后判定该菌株生物被膜的粘附程度为中等粘附。

绪论A型产气荚膜梭菌可以感染牛羊等在内的多种家畜，引起肠毒血症、创伤性气性坏疽、猝死症、坏死性肠炎等[1]。

细菌自身产生的胞外多聚物包裹在细菌群落外，其对生物被膜中细菌的存活率非常重要，细菌群落之间存在的内隙是细菌获取营养和排出代谢废物的通道[2]。

本实验通过结晶紫染色、扫描电子显微镜法以及OD值测定法对A型产气荚膜梭菌生物被膜的形成过程进行鉴定与检测，旨在为产气荚膜梭菌生物被膜机制的深入研究提供基础数据。

1材料与方法菌株：A型产气荚膜梭菌青海分离株分离自青海某食堂。

试剂：液体硫乙醇酸盐培养基(不含琼脂)，2%结晶紫染料，0.1%结晶紫染料；1.1 方法1.1.1 A型产气荚膜梭菌的复苏培养将A型产气荚膜梭菌青海分离株置于摇床上150 rpm/min， 37℃培养16-20小时。

按上述方法再传代培养2次。

1.1.2 A型产气荚膜梭菌生物被膜结晶紫染色与观察（1）载玻片的准备：2%盐酸浸泡24h，蒸馏水冲净，烘干后灭菌备用。

（2）将细菌在载玻片培养，然后将放有载玻片的培养皿放入37℃生化培养箱中培养6天。

隔天换液。

（3）将培养的生物被膜载体，经生理盐水漂洗，置于无菌培养皿中，加入适量甲醇固定，再加入2%结晶紫溶液染色，生理盐水冲洗，烘干后在光学显微镜下观察，照相记录。

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定王玲玲;王景松;王健霖;王玮;陈灿;宋前进;郭亚男;李继东【期刊名称】《现代畜牧兽医》【年(卷),期】2024()3【摘要】试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。

采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。

结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。

大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI(irp2)及LEE(eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。

研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。

【总页数】6页(P1-6)【作者】王玲玲;王景松;王健霖;王玮;陈灿;宋前进;郭亚男;李继东【作者单位】宁夏大学动物科技学院;宁夏农林科学院动物科学研究所;银川市畜牧技术推广服务中心【正文语种】中文【中图分类】S855.1【相关文献】1.仔猪产气荚膜梭菌肠毒血症病原诊断及疫苗研究Ⅲ.7株A型产气荚膜梭菌菌株的产毒素试验2.岩羊病原性大肠埃希氏菌及A型产气荚膜梭菌的分离与鉴定3.猪源产气荚膜梭菌分离鉴定、耐药性分析及益生菌对产气荚膜梭菌的抑制作用4.一起耐热型A型产气荚膜梭菌食物中毒的病原菌分离因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究

牦牛源A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及生物学特性研究王冬经;吴金措姆;曾江勇【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2024(51)1【摘要】【目的】2023年4月至2023年5月,西藏拉萨市多地出现牦牛严重腹泻、便血甚至死亡的现象。

试验旨在确定牦牛腹泻的病原菌并研究其生物学特性,以期为该地区牦牛腹泻病的防治提供参考。

【方法】采集新鲜牦牛腹泻粪便样品进行厌氧培养,通过培养特性及染色镜检进行初步鉴定;对可疑阳性菌株进行生化特性、多重PCR毒素基因分型及cpe、netB、cpb2毒素鉴定,并进行cpa、cpb2、16S rRNA基因的遗传进化分析、部分分离株生长曲线测定及动物致病性试验;采用K-B 法测定分离株的体外药物敏感性,统计不同分离株的多重耐药结果。

【结果】从样品中分离纯化得到8株分离菌,在厌氧培养基中生长旺盛,在TSC培养基、5%脱纤维绵羊血平板、卵黄琼脂培养基上均呈现与产气荚膜梭菌相似的典型菌落,革兰染色为紫色大杆菌,初步判定为产气荚膜梭菌,命名为XZ-1~XZ-8。

分离株生化检测结果与产气荚膜梭菌相符;分离株均携带cpa和cpb2基因,为A型产气荚膜梭菌;16S rRNA基因分析结果显示,8株分离株与产气荚膜梭菌参考株的相似性为97.3%~100%,在系统进化树中处于同一分支,而与屎肠球菌、大肠杆菌参考株处于不同分支;分离株cpa和cpb2基因存在一定的变异性。

生长曲线显示,3株分离株(XZ-1、XZ-4、XZ-7)生长规律基本一致,其中0~4 h为迟缓期,4~8 h为对数期,8~22 h为稳定期,22 h后开始进入衰亡期。

动物致病性试验结果显示,分离株对昆明小鼠具有较强的致病性。

分离株对苯唑西林、红霉素、氯霉素、氧氟沙星、米诺环素、头孢哌酮、利福平及罗红霉素敏感,对青霉素、哌拉西林、羧苄西林、麦迪霉素、头孢曲松等22种药物均存在不同程度的耐药性,存在多重耐药性,其中XZ-7株耐药数量多达11种,6重以上耐药的菌株占75.0%。

A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达

A型产气荚膜梭菌α毒素基因的高效表达赵志军;许崇波;曾瑾;王玉炯【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2004(14)5【摘要】用NcoI EcoRI酶切含α毒素基因质粒pXCPA0 2 ,回收 1.2kb的α毒素基因片段 ,通过T4 DNA连接酶 ,将回收的α毒素基因片段与经NcoI EcoRI酶切的表达载体pET - 2 8c连接 ,转化至受体菌BL2 1(DE3)中。

经NcoI EcoRI、BamHI EcoRI和NcoI BamHI EcoRI酶切反应鉴定和核苷酸序列分析证实 ,获得的表达质粒pXETA0 2含有α毒素基因 ,而且阅读框架是正确的。

重组菌株BL2 1(DE3) (pXETA0 2 )经IPTG诱导后 ,其表达产物经ELISA检测和SDS -PAGE分析 ,结果表明重组菌株可以高效表达α毒素蛋白 ,该蛋白占菌体总蛋白相对含量的36 .83%。

【总页数】3页(P15-17)【关键词】产气荚膜梭菌;α毒素基因;基因表达【作者】赵志军;许崇波;曾瑾;王玉炯【作者单位】宁夏大学生命科学学院;大连大学生物工程学院【正文语种】中文【中图分类】S852.61;Q786【相关文献】1.产气荚膜梭菌β2 -β1毒素融合基因在大肠杆菌中高效表达条件的优化 [J], 曾瑾;王玉炯;邓光存;高蔚丰2.A型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及高效表达 [J], 王景林;王利春;吴东林;康琳;姜永强3.D型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆与高效表达 [J], 李娜;吴建勇;李建军;杨学云;王登峰;段新华;王治才4.A型产气荚膜梭菌α毒素保护性抗原基因的高效表达 [J], 许崇波;朱平;姚湘燕;马从林;冯书章5.重组A型产气荚膜梭菌α毒素C端基因在大肠杆菌中的高效表达 [J], 林明辉;荫俊;王慧;侯晓军;宋伟;邢洪光因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

产气荚膜梭菌α毒素分子生物学研究进展

产气荚膜梭菌α毒素分子生物学研究进展张艳平;唐成程;许崇波【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2013(000)001【摘要】Alpha-toxin is a major pathogenic determinant of Clostridium perfringens and exhities both phospholi⁃pase C and sphingomyelinase activities. It can hydrolysis phosphatidylcholine and sphingomyelin. It causes cell ly⁃sis and possesses cell toxicity, hemolysis, lethality, and platelet aggregation. In this paper we summarized the re⁃searches on biological characteristics, gene cloning and transcriptional regulation, gene expression and gene fusion, site-directed mutagenesis and structural analysis, structure and function of N- and C-domain of C.perfringensal⁃pha-toxin.% α毒素是产气荚膜梭菌主要的毒力因子，具有磷脂酶C和鞘磷脂酶等2种酶的活性，能同时水解细胞膜上的磷脂酰胆碱和鞘磷脂，导致细胞裂解，因而具有细胞毒性、溶血活性、致死性和血小板聚集等特性。

我们对产气荚膜梭菌α毒素的生物学特性、基因克隆与转录调控、基因表达与基因融合、基因定点突变与结构分析、N端和C端的结构与功能等方面的研究进展进行简要综述。

【总页数】5页(P113-117)【作者】张艳平;唐成程;许崇波【作者单位】大连大学生命科学与技术学院辽宁大连 116622;吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春 130062;大连大学医学院，辽宁大连 116622【正文语种】中文【中图分类】Q75;S852.61【相关文献】1.产气荚膜梭菌β毒素分子生物学研究进展 [J], 李芳;墙克信;王玉炯2.A型产气荚膜梭菌α毒素分子生物学的研究进展 [J], 许崇波3.产气荚膜梭菌肠毒素的分子生物学研究进展 [J], 赵立峰4.产气荚膜梭菌肠毒素的分子生物学研究进展 [J], 文其乙;刘秀梵5.产气荚膜梭菌肠毒素的分子生物学研究进展 [J], 文其乙; 刘秀梵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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ｔｅｔＡ（Ｐ）基因寡核苷酸引物，预期长度为１２６３ｂｐ。引
ＡＡＣＴＴＴＣＡＧ一３、ｔｅｔＡ（Ｐ）一Ｒ：５＇－ＴＴＡＡＴ—
Ｔ町ＴＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＣ一３。
素耐药基因检测等方面的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ究
动物医学进展。２０１５，３６（６）：５４ — ５９
ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ
Ａ型产气荚膜梭菌青海分离株ｔｅｔＡ（Ｐ）耐药基因序列分析及蛋白结构预测
产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）是一种革兰阳性芽胞杆菌，在污水、食物等中均有分布，是一种重要的人畜共患传染病的病原口］，也是一种引起食物中毒的重要病原菌［２］。随着四环素类抗生素的广
因的研究开展的相对较少。因此，本实验通过ＰＣＲ梭菌分离株菌液，室温解冻，无菌操作吸取５Ｌ接
种于ＦＴ培养基中，酒精灯融化石蜡无菌封口，３７ ℃
高原动物疾病研究室保存。
１．２．１主要试剂ＦＴ培养基为北京陆桥技术有限
责任公司产品；ＥｘＴａｑＤＮＡ聚合酶为宝生物工程（３ｖ连）有限公司产品；ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、细菌质粒提取试剂
度为１２６３ｂｐ，编码４２０个氨基酸。与参考菌株ＥＨＥ－ＮＥ１８、Ｗａｋａｙａｍａ、ＣＷ９２的核苷酸序列同源性依次为
１００、９９．８％和９８．７，氨基酸序列同源性依次为１００、１００和９８．３。分离株ＴｅｔＡ（Ｐ）蛋白疏水性较强，
冶贵生，马玉花，张爽，张晓芬，韩志辉，邹勇，贾跃宁
（１．青海大学农牧学院，青海西宁８１００１６；２．西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌７１２１００）
摘要：应用ＰＣＲ技术对Ａ型产气荚膜梭菌青海分离株的ｔｅｔＡ（Ｐ）耐药基因进行扩增、测序，利用生物软件对ｔｅｔＡ（Ｐ）基因进行序列分析与蛋白结构预测。结果表明，Ａ型产气荚膜梭菌青海分离株的ｔｅｔＡ（Ｐ）基因长
盒为天根生化科技（北京）有限公司产品；其他试剂均
为国产分析纯。
１．２方法
环素类药物的耐药性。四环素类药物可与细菌核糖体３０Ｓ亚基结合从而中断细菌蛋白质的生物合成，而细菌对四环素产生耐药性可通过表达核糖体保护蛋白、外排泵等方式进行］。
是由ａ一螺旋和无规则卷曲形成。研究结果可为Ａ型产气荚膜梭茵ｔｅｔＡ（Ｐ）基因功能研究提供依据。
关键词：Ａ型产气荚膜梭茵；ｔｅｔＡ（Ｐ）基因；序列分析；蛋白结构
中图分类号：￥８５２．６１６．３文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１５）０６ — ００５４ — ０６
。产气荚膜梭菌对
四环素耐药相关的基因有ｔｅｔＡ（Ｐ）、ｔｅｔＢ（Ｐ）和ｔｅｔＭ物序列为：ｔｅｔＡ（Ｐ）一Ｆ：５ｔ — ＡＴＧＧＴＴＡＡ］１Ａ—
等Ｈ，其中ｔｅｔＡ（Ｐ）基因编码产气荚膜梭菌外排泵蛋
具有１Ｏ个跨膜区，含有４个Ｎ＿糖基化位点，１个ｃＡＭＰ和ｃＧＭＰ依赖性蛋白激酶磷酸化位点，５个蛋白激酶ｃ磷酸化位点，１个酪蛋白激酶Ⅱ 磷酸化位点，１个酪氨酸激酶磷酸化位点，１２个Ｎ＿豆寇酰化位点，三级结构主要
白，其在产气荚膜梭菌主动外排抗药性过程中起着重
要作用，而目前国内关于产气荚膜梭菌四环素耐药基
技术扩增Ａ型产气荚膜梭菌青海分离株ｔｅｔＡ（Ｐ）基
１．２．２细菌培养
取超低温保存的Ａ型产气荚膜
近年来产气荚膜梭菌的耐药性日趋严重，国外学者已经开展了产气荚膜梭菌四环素耐药性以及四环
１．２．１引物设计
根据ＧｅｎＢａｎｋ中登录的产气荚膜
梭菌ｔｅｔＡ（Ｐ）基因序列（登录号：ＡＢ０５４９８０．１），设计
泛使用，四环素耐药性细菌也日渐增多，大肠埃希菌～、沙门菌］、链球菌＿５等多种细菌均表现出对四
１材料与方法
１．１材料
１．１．１菌株
Ａ型产气荚膜梭菌青海分离株由青藏